MYC通过促进pRB1降解诱导CDK46抑制剂耐药性

MYC基因扩增是导致膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）产生耐药的重要原因。MYC扩增通过促进E3连接酶KLHL42转录，导致pRB1泛素化降解，引发RB1缺失并引起癌细胞对CDK4/6抑制剂耐药。A80.2HCl降解MYC并恢复pRB1水平，联合CDK4/6i可显著抑制肿瘤生长，为克服耐药提供新策略。

癌症是一种细胞增殖失控的疾病，细胞周期中的G1/S转变是关键调控点。CDK4/6与其环蛋白D结合，磷酸化RB1蛋白，促进E2F转录因子释放，从而推动细胞进入S期。通过抑制CDK4/6，CDK4/6i（CDK4/6抑制剂）可以阻断RB1磷酸化，抑制细胞周期进程，从而在多种癌症中表现出抗肿瘤活性。CDK4/6i已被批准用于治疗激素受体（HR）阳性、HER2阴性的晚期或转移性乳腺癌。

尽管CDK4/6i在乳腺癌中表现出显著疗效，但其他类型的癌症（如膀胱癌、前列腺癌等）中疗效有限，耐药问题亟待解决。以下机制已被报道：1）RB1功能丧失：RB1基因的缺失或突变是最常见的耐药机制，因为RB1是CDK4/6的主要靶点。2）其他机制：包括CDK6扩增、AKT1和RAS活化突变、CCNE2和FGFR2异常等。

MYC是一种经典的致癌基因，调控多种细胞过程，包括细胞周期进程、代谢、凋亡等。在大约70%的癌症中，MYC基因存在扩增或过表达。通过与其他转录因子和蛋白复合物相互作用，MYC起到转录放大器的作用，推动肿瘤进展。MYC扩增与RB1丢失的相互排斥关系提示了二者可能在功能上存在交叉调控。然而，MYC通过RB1后转录修饰（如降解）引发耐药的机制尚不清楚。

基于上述背景，本文作者旨在揭示MYC扩增如何驱动RB1降解并导致CDK4/6i耐药，进一步确定MYC与E3泛素连接酶KLHL42的分子关系及其在RB1蛋白稳定性中的作用。从而探索一种能靶向MYC的新分子药物（A80.2HCl），以恢复RB1功能、克服CDK4/6i耐药性，为癌症治疗提供新策略。

总之，这项研究的意义在于，填补了RB1蛋白降解机制的空白，并为克服CDK4/6i耐药性提供了直接靶向MYC的新方法，推动了MYC驱动癌症的治疗探索。

1、高MYC表达通过降低pRB1导致CDK4/6抑制剂耐药性

研究揭示，高MYC表达通过降低pRB1蛋白水平，导致癌细胞对CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）的耐药性。作者在TCGA数据库中分析，MYC扩增与RB1基因丢失在多种癌症中呈现互斥关系，提示二者可能通过不同机制调控细胞增殖。进一步实验显示，高MYC表达的膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞中，pRB1蛋白水平显著下降，而mRNA水平未受影响，表明MYC通过后转录机制降低pRB1稳定性。

在药物敏感性实验中，低MYC表达的细胞对CDK4/6i（如Palbociclib）表现出显著抑制效果，药物IC50值较低；相反，高MYC表达的细胞对药物的抑制作用显著降低(图1a)。palbociclib治疗导致正常表达MYC的T24细胞中的基因表达显著下降，而对高表达MYC的UMUC14细胞的基因表达几乎没有影响(图1b和c)。此外，在T24细胞中敲除MYC靶基因后，E2F靶基因的表达下降(图1d和e)。小鼠异种移植肿瘤模型进一步证实了这一现象，MYC过表达的小鼠肿瘤对Palbociclib治疗的效果显著减弱（图1h和 i）。通过对pRB1的研究，发现MYC不仅降低了pRB1蛋白水平，还削弱了CDK4/6i的抗肿瘤活性（图1f和 g）。这些结果明确表明，MYC扩增通过掩盖pRB1功能驱动CDK4/6i耐药，为未来克服耐药性提供了新的研究方向和治疗策略。

图1 高MYC表达通过屏蔽pRB1驱动对CDK4/6i的抗性

2、高MYC表达通过蛋白酶体降解降低pRB1丰度

根据之前的研究，MYC作为主要的转录因子，可能通过转录抑制RB1的表达。然而，研究发现，外源性表达MYC导致pRB1蛋白水平呈剂量依赖性下降，这一效应在使用蛋白酶体抑制剂MG132时完全消失（图2a）。此外，MYC过表达并未改变RB1的mRNA水平（图2b）。通过敲低MYC，发现pRB1蛋白水平显著上升，但对RB1 mRNA表达未产生明显影响（图 2c,和d）。实验中还发现，MYC敲低后pRB1的E3连接酶β-TrCP的水平未发生变化，这表明MYC可能通过与β-TrCP无关的机制调控pRB1蛋白水平。进一步的实验显示，MYC敲低延长了内源性pRB1蛋白的半衰期（和2e–h），并显著抑制了pRB1的多泛素化图 2i）。通过对膀胱癌患者样本的组织芯片分析（n=40），发现pRB1表达与MYC表达呈负相关（图2j,和k）。这些发现提供了直接证据，表明高MYC表达通过蛋白酶体降解抑制pRB1的丰度。

图2 高MYC表达通过蛋白酶体降解降低pRB1丰度

3、E3泛素连接酶KLHL42与pRB1相互作用并诱导pRB1蛋白酶体降

为了鉴定靶向pRB1降解的潜在E3泛素连接酶，本研究通过LC-MS分析发现，KLHL42作为E3泛素连接酶，与pRB1蛋白发生相互作用，并在MYC过表达的情况下促进pRB1的降解。具体而言，实验结果显示，在MYC过表达的情况下，KLHL42与pRB1的结合显著增强（图3a）。进一步的共免疫沉淀（Co-IP）实验确认了KLHL42与pRB1之间的直接相互作用，并发现KLHL42的Kelch结构域对这种结合至关重要（图3g）。KLHL42不仅能够通过泛素化途径促进pRB1的降解，而且KLHL42的敲低显著延长了pRB1的半衰期（图3k），表明KLHL42在细胞内的降解作用是通过泛素化机制实现的。

此外，研究还表明，KLHL42的表达与pRB1在膀胱癌患者样本中的表达呈负相关（图3n），进一步的TCGA数据库分析也发现KLHL42在多种癌症类型（如乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌）中均表现出较高的表达，并且与MYC蛋白水平显著相关。这些结果表明，KLHL42是pRB1降解的关键E3连接酶，在癌症细胞中通过降低pRB1的稳定性参与了CDK4/6i耐药性的发展。

总体而言，这项研究揭示了KLHL42在MYC扩增导致的耐药性中的重要作用，并为进一步研究MYC与KLHL42的相互作用提供了新的视角，可能为癌症治疗提供新的靶点。

图3 E3泛素连接酶KLHL42与pRB1相互作用,并诱导pRB1蛋白酶体降解

4、KLHL42是MYC介导CDK4/ 6i抗性的转录靶点

该研究表明，MYC和KLHL42通过蛋白酶体降解机制共同降低pRB1的丰度，并且KLHL42在MYC过表达后显著与pRB1相互作用。通过分析已发布的ChIP-seq数据集，研究人员发现MYC在KLHL42基因启动子区域结合的峰值，提示KLHL42可能是MYC的转录靶基因（图4a）。ChIP-qPCR分析进一步证实，MYC在T24和UMUC14细胞的KLHL42基因启动子区域显著富集（图4b）。实验验证发现，敲低MYC后，KLHL42的表达在mRNA和蛋白质水平上均显著下降（图4c和d）。

为了进一步验证KLHL42是MYC的直接转录靶基因，研究人员在前列腺癌小鼠模型中分析了Myc、Klhl42和Rb1的表达。结果显示，与对照组小鼠相比，高MYC转基因小鼠中Myc和Klhl42的表达显著增加，而Rb1的表达在正常和肿瘤样本中均显著下降（图4e和f）。这些数据表明，KLHL42是MYC的直接转录靶基因，且通过促进pRB1降解，影响细胞的周期进程和耐药性。

这些发现表明，MYC通过直接调控KLHL42表达，增强KLHL42对pRB1的降解作用，进一步加深了我们对MYC和KLHL42相互作用在癌症进展中的作用的理解。

图4 KLHL42是MYC介导CDK4/6i抗性的转录靶点

5、鉴定A80.2HCl为myc降解分子

这项研究发现了A80.2HCl，一种能够有效降解MYC蛋白的化合物，具有克服癌症中MYC驱动的耐药性的潜力。MYC是多种癌症中过度表达的关键致癌基因，研究表明，MYC的过表达会导致对CDK4/6抑制剂（如Palbociclib）的耐药。通过筛选一系列基于亚氨基的化合物，研究人员识别出A80.2HCl，该化合物在极低浓度（10nM）下能够显著降解MYC，并通过与GSPT1和MYC结合，招募E3泛素连接酶CRBN来促进MYC降解（图 5a）。通过分子对接分析和其他实验，证明A80.2HCl与CRBN和MYC有高亲和力，并通过蛋白酶体降解途径减少MYC的丰度（图5c和d）。

进一步研究发现，A80.2HCl能够降低多种癌细胞系（膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞）的MYC水平，同时伴随KLHL42的降低和pRB1水平的升高（图 5f）。RNA-seq结果显示，A80.2HCl显著抑制了MYC及其下游E2F靶基因的转录（图5g和h）。此外，MYC敲低的膀胱癌细胞对A80.2HCl表现出耐药性，进一步证明其作用依赖于MYC的表达（图5j-l）。

在小鼠肿瘤模型中，A80.2HCl显著抑制了T24和UMUC14异种移植肿瘤的生长，但对MYC敲低的小鼠肿瘤影响较小（图5m，n）。药代动力学研究表明，A80.2HCl能够在肿瘤内积累，并在36小时内从各大器官排除（图 5o）。

综上所述，A80.2HCl通过靶向MYC并促进其降解，为癌症治疗提供了一个有前景的药物候选，尤其是在MYC驱动的癌症中。

图5 A80.2HCl作为myc降解分子的鉴定

6、A80.2HCl增强CDK4/6抑制剂的治疗效果

RNA-seq分析发现，A80.2HCl和Palbociclib联合治疗比单独使用任何一种药物时对MYC及E2F下游靶基因的抑制更为显著，且1609个基因仅在联合治疗组中被下调（图 6a和 b）。这些基因主要富集了MYC和E2F靶基因，表明联合治疗能够更全面地抑制这些关键的癌基因（图6c）。

在体外实验中，A80.2HCl联合Palbociclib显著降低了肿瘤细胞的IC50值，并增强了对克隆形成的抑制作用（图6d,和e）。此外，A80.2HCl与Palbociclib的联合治疗在膀胱癌（T24）、前列腺癌（UMUC14）等细胞系中表现出协同效应。然而，当KLHL42过表达时，MYC与CDK4/6抑制剂的联合效果被完全抑制。在RB1缺失的细胞系中，A80.2HCl和Palbociclib的联合治疗未能显著改善效果，提示pRB1的表达对于MYC和CDK4/6抑制剂的效果至关重要。进一步地，研究发现，在CDK4/6抑制剂耐药细胞系中，MYC和KLHL42的积累导致pRB1蛋白水平显著降低。A80.2HCl能够有效克服由MYC和KLHL42蛋白积累引起的耐药性，并使耐药细胞重新对CDK4/6抑制剂产生敏感性。这些结果表明，MYC是克服CDK4/6i耐药性的一个重要靶点。

在小鼠异种移植模型中，A80.2HCl显著增强了Palbociclib在抑制T24和UMUC14肿瘤生长中的效果（图 6h）。在MYC扩增的mini-PDX模型中，联合治疗也表现出显著的治疗效益（图 6i）。综上所述，这些结果表明，A80.2HCl通过促进MYC降解，增强了CDK4/6抑制剂的治疗效果，为克服CDK4/6i耐药性提供了一个有效的癌症治疗靶点。

图6 A80.2HCl增强CDK4/6i的治疗效果

这项研究揭示了MYC在驱动CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）耐药中的新角色。MYC通过激活E3泛素连接酶KLHL42，促进pRB1的泛素化和降解，进而导致pRB1功能丧失，从而使癌细胞对CDK4/6i产生耐药性。MYC的扩增和RB1的缺失在多种癌症中频繁发生，并且这两者常常呈现互斥关系。

MYC一直被认为是一个“不可药物化”的靶点，因为它具有固有的无序结构，并且缺乏明确的结合口袋。然而，最近的目标蛋白降解（TPD）技术为这一挑战提供了新的解决方案。研究表明，通过小分子促进MYC降解，可以为MYC驱动的癌症提供潜在的治疗策略。研究中所开发的分子A80.2HCl，能够在纳摩尔浓度下有效降解MYC蛋白，并显著抑制肿瘤生长 。在膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞系中的克服作用，为癌症治疗提供了新的思路和治疗靶点。

总的来说，本研究揭示了MYC在通过破坏pRB1稳定性来推动CDK4/6i耐药方面的作用，并确定了A80.2HCl作为一种有效的MYC降解分子，为克服CDK4/6i耐药性提供了新的治疗策略。