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摘要
后生动物依靠保守的应激反应途径来缓解恶劣条件和保持细胞完整性。应激反应在干细胞中尤为重要，干细胞为组织形成和修复提供终身支持，但这些保护系统如何整合到发育程序中尚不清楚。在这里，本文作者使用成肌细胞分化来鉴定E3连接酶CUL2FEM1B及其底物FNIP1是否是还原性应激反应的核心成分。由延长的抗氧化信号传导或线粒体失活引起的还原性应激可以逆转FNIP1中不变性Cys残基的氧化，并允许CUL2FEM1B识别其靶标。随后的蛋白酶体降解FNIP1恢复线粒体活性，以保持氧化还原稳态和干细胞的完整性。因此，还原性应激反应是围绕泛素依赖的变阻器建立的，该变阻器调节线粒体活性以满足氧化还原需求，并在应激和发育信号的协调中影响代谢的调控。
背景介绍
后生动物的发育依赖于精心平衡的转录网络来产生一个成年生物体的200多种细胞类型。干细胞处于这一复杂程序的顶端，其有缺陷的稳态会导致许多儿童疾病。因为多能性细胞也支持组织修复，它们的异常维持与肿瘤发生和组织变性有关。
为了保护它们的干细胞群免受损害，生物体具有保守的应激反应途径，可以检测和缓解广泛的不利条件。许多干细胞存在于缺氧的生态位中，依赖糖酵解作为主要能量来源，从而限制对DNA、脂质或蛋白质的氧化损伤。如果有太多的活性氧（ROS）积累，这些细胞就会激活氧化应激反应，以稳定转录因子核因子红样2相关因子2（NRF2）。NRF2驱动清除氧化分子并将氧化蛋白还原为功能还原态的蛋白质表达。未能诱导抗氧化信号会损害干细胞的自我更新和分化，并危及组织维护。干细胞的完整性同样被应激反应保持，由蛋白质错误折叠、DNA损伤或缺氧激活。根据它们的快速激活，应激反应必须在细胞内稳态恢复后立即关闭。不关闭氧化应激反应的干细胞不能积累信号传导所需的生理ROS，并且无法分化。持续缺乏ROS或减少压力也会阻碍胰岛素信号和葡萄糖稳态；减弱运动对胰岛素敏感性的积极影响；触发心肌病、肥胖或糖尿病；并增加死亡率。尽管有如此可怕的后果，还原性压力是如何被感知和缓解的仍然是未知的。
本文作者利用成肌细胞分化背后的氧化还原敏感途径，鉴定了CUL2FEM1B及其靶滤泡素相互作用蛋白1（FNIP1）作为还原应激反应的核心成分。持续线粒体无活性或抗氧化信号导致的还原应激逆转了FNIP1中不变Cys残基的氧化，这是CUL2FEM1B与底物结合的先决条件。随后，FNIP1的泛素化和蛋白酶体降解增加线粒体输出以产生ROS并保持氧化还原稳态。因此，还原应激反应建立在一个泛素依赖的变阻器上，该变阻器调节线粒体输出以满足细胞需要，并将脊椎动物的应激和发育信号结合起来。
结果分析
1、还原性应激抑制成肌细胞分化
作为消耗氧气的组织，肌肉提供了一个系统来识别在氧化还原应激管理中起作用的蛋白质。这促使本文作者探索cullin - ring - E3连接酶（CRLs），已知的控制应激和发育信号的E3家族，是体外肌生成所必需的。本文作者从C2C12成肌细胞中分别去除7个Cullin支架，并通过肌球蛋白重链（MyHC）染色跟踪肌管形成。这些实验表明，CUL2和CUL3对肌管形成尤为重要（图S1A），这与CUL3缺失对小鼠肌肉发育的影响是一致的。
CUL2和CUL3通过包含VHL盒或BTB域的适配器选择底物。利用CUL2和CUL3的亲和纯化与质谱结合，本文作者在肌母细胞或肌管中检测到19个CUL2和32个CUL3接头。这包括候选接头，如肌营养不良蛋白肌钙素，以及与家族性肌病相关的因子，如KLHL9。将此列表与其他细胞类型的适配器结合后，本文作者从成肌细胞中去除156个CRL2和CRL3亚基，启动分化，并通过显微镜和自动图像分析记录MyHC阳性肌管（图1A）。用多个siRNA确认关键表型，以消除脱靶效应的风险。本文作者的筛选结果显示，CUL3接头KEAP1、BTBD9、KLHL22和ANKFY1是肌管形成所必需的，而CUL2接头FEM1同源物B （FEM1B）的缺失极大地改善了这种分化程序（图1A-1C）。
图1 还原性应力抑制肌管的形成
由于这些接头的丢失对细胞数量的影响较小（图S1B），异常的细胞分裂或存活不太可能解释细胞分化的变化。值得注意的是，肌管形成所需的所有接头都与疾病有关；KEAP1突变导致肺癌和肾癌，BTBD9突变引发不宁腿综合征和失眠，KLHL22过表达导致乳腺癌进展，ANKFY1突变导致类固醇抵抗性肾病综合征。
图S1 在成肌细胞分化过程中，CRL2和CRL3 E3连接酶是成肌细胞分化所必需的，与图1相关
本文作者好奇地发现氧化应激传感器KEAP1的缺失阻止了成肌细胞的分化。虽然氧化应激会短暂抑制CUL3KEAP1，但KEAP1基因缺失会使NRF2长时间保持稳定，并引发应激还原。成肌细胞中KEAP1的缺失诱导NRF2（图1C和1D）及其靶基因（图2E和2F）的积累。这导致NADPH水平升高（图S1C）和ROS急剧下降，这是还原性应激的标志（图1E）。当本文作者通过共同消耗NRF2或谷胱甘肽合成和再循环酶来钝化这种抗氧化信号时，分化得以恢复(图1D和1F；图S1D)。线粒体来源ROS的清除剂，通过化学手段施加还原性应激也抑制成肌细胞分化（图1G）。因此，本文作者得出结论，与最近使用KEAP1抑制剂的研究结果一致，还原性应激损害体外肌生成。这支持了活性氧发挥关键信号作用的观点，强化了在正常发育过程中如何感知和抵消减少压力的问题。
2、FEM1B抵消KEAP1
为了解剖细胞对还原性应激的反应，本文作者设计了一个基因修饰筛选，旨在挽救KEAP1缺陷的成肌细胞的分化。E3连接酶作为可能的应激调节因子，本文作者发现尽管缺乏KEAP1， CUL2接头FEM1B的缺失仍能促进肌管的形成（图2A）。本文作者在显微镜下用独立的siRNAs和成肌细胞分化的western blot分析证实了这一结果（图2B和2C）。在线粒体来源的活性氧清除剂存在的情况下，FEM1B的缺失也挽救了分化，这表明FEM1B会影响遗传或化学手段施加的还原应激（图2D）。有趣的是，FEM1B已经从本文作者的初始筛选中出现，其缺失显示出肌管形成效率的最强增加（图1A），与KEAP1缺失的表型相反。
基因表达分析表明，KEAP1缺失诱导抗氧化NRF2靶标，如谷胱甘肽合成酶、ROS清除剂或戊糖磷酸途径组分(图2E和2F；图S2A、2B）.FEM1B的缺失具有相反的作用，减少了NRF2靶点，但增加了肌生成标志物MYOG和MYL1（图2E和2F）。重要的是，KEAP1和FEM1B的同时缺失抵消了这些单个E3连接酶缺失的表型(图2E和2F；图S2A)。与这些结果一致，FEM1B的缺失恢复了KEAP1缺失的成肌细胞中的ROS水平（图1E）。尽管KEAP1以控制NRF2水平而闻名；它还将转录因子隔离在细胞质中。尽管FEM1B缺失降低了NRF2 mRNA（图S2C），但它对NRF2蛋白丰度的影响很小（图2C）。相反，FEM1B的缺失对NRF2的定位有显著影响；尽管NRF2在KEAP1缺失的成肌细胞细胞核中积累，FEM1B的共缺失将NRF2定向到核周区域，在那里它不能诱导基因表达（图2G）。因此，本文作者的研究结果确定了FEM1B是氧化还原信号的关键调节因子，并提出了E3 CUL2FEM1B可能直接或间接影响还原应激反应的可能性。
图2消耗FEM1B可以使成肌细胞分化
3、CUL2FEM1B靶向FNIP1进行蛋白酶体降解
先前的研究表明，在CUL2适配器的VHL盒中有一个Leu残留物，它与长链蛋白C上的一个口袋相接合，将适配器连接到同样由CUL2、长链蛋白B和RBX1组成的催化模块。相应的FEM1B残基Leu597的突变产生了一个接头，该接头不能结合CUL2，因此不能支持泛素化（图S2D），但包含锚蛋白重复序列，因此应该保留其识别底物的能力。与其他CRLs一样，本文作者预计FEM1BL597A与其他短寿命靶标的结合时间会更长，从而便于通过CompPASS质谱法对其进行鉴定。
图S2 FNIP1是CUL2FEM1B的特异性底物，如图3所示
蛋白质组学分析证实，FEM1BL597A与CUL2、长链蛋白B和长链蛋白C的结合受损（图3A）。相比之下，FEM1BL597A与几种被认为是候选底物的蛋白质的相互作用比FEM1B更强。其中包括在氨基酸限制期间抑制mTORC1信号传导的GATOR1复合物，以及卵泡素（FLCN）和FNIP1，它们也相互结合。未检测到FNIP1的同源物FNIP2。本文作者通过免疫沉淀和western blotting证实，FEM1B与GATOR1、FLCN和FNIP1的关联通过FEM1B中VHL盒的突变而稳定(图3B；图S2E)。相比之下，底物结合锚蛋白重复序列中的不变残基Cys186的突变，强烈降低了FEM1B对GATOR1、FLCN和FNIP1的识别（图3B）。
FEM1B过表达引发了CUL2和蛋白酶依赖性的FNIP1降解，而底物结合缺陷的FEM1BC186S、失活的FEM1BL597A或相关的适配器FEM1A则没有这种效果(图3C；图S2E和S2F)。耗尽FEM1B会导致相反的结果，内源性FNIP1水平升高（图3D）。nedd8修饰的CUL2FEM1B在体外与E2酶UBE2D3和UBE2R1孵育时也能使FNIP1多泛素化（图3E）。相反，FEM1B的表达不会诱导FLCN、GATOR1亚基或FNIP2的降解(图3B；图S2E-S2G)， CUL2FEM1B在体外没有使这些蛋白泛素化(图3E；图S2H)。本文作者得出结论，FNIP1是一个蛋白水解CUL2FEM1B底物，因此FLCN或GATOR1可能间接地与FEM1B相互作用，或者扮演与降解靶标不同的角色。
虽然FNIP1的缺失对分化影响不大（图S2I），但FNIP1，而不是GATOR1，共缺失恢复了FEM1B缺失对肌管形成的影响(图3F；图S2I和S2J)。因此，在缺乏FEM1B的情况下，FNIP1的积累促进了分化。在缺乏FEM1B和KEAP1的细胞中，FNIP1的缺失也阻止了肌生成（图3G），并导致NRF2重新进入细胞核（图3H），这证明正是FNIP1的稳定使成肌细胞绕过了还原应激。
图3 FNIP1是还原应力过程中关键的CUL2FEM1B底物
本文作者得出结论，FNIP1是CUL2FEM1B在还原应激过程中的关键靶点。先前的研究表明FNIP1参与线粒体生物发生，以及调节AMPK和mTORC1激酶。尽管在肾癌中已经检测到体细胞FNIP1变异，但其伴侣FLCN的突变会导致Birt-Hogg-Dube综合征，这是一种肾癌易感性，也是由线粒体活性异常或VHL、KEAP1或NFE2L2突变引起的。
4、FEM1B在FNIP1中检测到一个保守的Cys度
为了确定ROS是否调节CUL2FEM1B对FNIP1的识别，本文作者首先需要确定与FEM1B结合的FNIP1 degron。通过缺失分析，本文作者发现FNIP1的中心区域有一小段是CUL2FEM1B及其蛋白酶体降解所必需的（图4A和4B）。与预期的可转移基序一样，CUL2FEM1B很容易检测到与GFP融合的degron (GFPdegron)（图S3A和S3B）。与全长FNIP1一样，GFPdegron与底物陷阱FEM1BL597A结合更强（图S3A），但不与FEM1BC186S相互作用（图S3B）。接下来，本文作者将GFPdegron与mCherry一起表达，并使用GFP/ mCherry比率作为蛋白质降解的定量读数。FEM1B，而不是FEM1BL597A或FEM1BC186S，引发了GFPdegron的急剧丢失（图4C），而通过CRISPR-Cas9删除FEM1B，通过shRNA耗尽FEM1B，或蛋白酶体抑制保护GFPdegron免受降解(图4D；图S3C和S3D)。FNIP1 degron还介导了与重组FEM1B的强大相互作用以及CUL2FEM1B的泛素化（图4E和4F）。因此，通过CUL2FEM1B，FNIP1泛素化和降解需要一个中心降解蛋白。虽然这个度在FNIP1同源物中是保守的（图S3E），但在密切相关的FNIP2中没有发现，CUL2FEM1B不识别FNIP2（图S3F）。
图S3 FNIP1包含一个保守的Degron，用于CUL2FEM1B的识别，与图4相关
图4 FEM1B结合了FNIP1中的一个保守的Degron
考虑到CUL2FEM1B在还原性胁迫信号传导中的作用，本文作者很高兴地看到FNIP1片段包含三个不变的Cys残基（图S3E）。Cys585对于依赖FEM1B的GFPdegron降解至关重要（图5A）。Cys580和Cys582的同时突变严重损害了GFPdegron的清除，所有Cys残基的突变充分保护了报告基因免受CUL2FEM1B依赖性降解（图5A）。突变其Cys残基阻断了降解物与重组FEM1B的结合（图5B），并阻止了CUL2FEM1B的泛素化（图5C）。在全长FNIP1中，对Cys残基的依赖更加明显，其中三个Cys残基以及邻近的His残基都是FEM1B结合和蛋白酶体降解所必需的(图5D；图S4A)。
图S4 半胱氨酸残基对FNIP1 Degron功能至关重要，如图5所示
根据这一突变分析，用修饰cys的碘乙酰胺或n -乙基马来酰亚胺处理FNIP1 degron抑制了FEM1B对其的识别(图5E；图S4B和S4C)及其CUL2FEM1B依赖性泛素化（图5F）。在细胞中也进行了类似的观察，其中碘乙酰胺衍生物IA -炔破坏了依赖FEM1B的GFPdegron降解（图5G）。本文作者得出结论，还原应激E3连接酶CUL2FEM1B依赖于未修饰的Cys度来检测其基本底物FNIP1。
图5 FNIP1 Degron需要Cys残基
5、还原应力触发CUL2FEM1B检测FNIP1
考虑到Cys残基在CUL2FEM1B识别中的作用，本文作者接下来测定了FNIP1在正常条件和还原应力下的氧化状态。尽管用多种蛋白酶甚至合成肽处理FNIP1免疫沉淀，但本文作者无法通过蛋白质组学方法检测到整个degron。这种肽也没有出现在Cys氧化的整体分析中，这表明它逃避了质谱分析。FNIP1中另外30个Cys残基阻碍了选择性衍生化。然而，由于degron容易形成二硫键（图S5A），本文作者可以使用硫氧还蛋白TRX分析其氧化。
TRX含有一个活性位点Cys残基，在第二个TRX Cys靶向混合二硫化物释放还原蛋白之前攻击细胞内的二硫化物键。缺乏第二个Cys的ATRXC35S变体不能分解混合二硫和共价陷阱氧化蛋白；TRXC35S捕获的蛋白质越多，它在细胞中被氧化的程度就越高。
在正常条件下，本文作者发现GFPdegron被TRXC35S有效捕获，而不含cys的报告基因（图6A）。A -酮戊二酸通过增加线粒体TCA循环的通量来增加ROS，或抗霉素A通过抑制线粒体复合物III来增加ROS，增强了GFPdegron或全长FNIP1的TRXC35S捕获(图6B；图S5B)。重要的是，CUL3KEAP1抑制后的ROS耗尽保护了degron免受TRXC35S的影响，这证明了还原应激期间degron氧化的逆转（图6C）。
一些观察结果表明，降解氧化控制CUL2FEM1B对FNIP1的识别。即使在没有还原剂的情况下短暂孵育degron也会破坏其与FEM1B的结合，而Tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride （TCEP）可以恢复这种结合（图6D）。在细胞中，用A -酮戊二酸或抗霉素A稳定GFPdegron(图6E和6F；图S5C)，依赖于呼吸链产生的ROS（图S5C）。粘噻唑增加了ROS并稳定了GFPdegron（图S5D和S5E），抗氧化酶GSR和TXRND1的损失（图S5F）也得到了类似的观察结果。相反，诱发还原应激的条件，如谷氨酰胺饥饿或CUL3KEAP1抑制导致的线粒体失活，会加速GFPdegron的周转(图6F；图S5G)。
图6 FNIP1 Degron是氧化还原敏感的
图S5 FEM1B识别出一个未经修改的FNIP1 Degron，与图6相关
6、FNIP1降解控制线粒体功能
本文作者推测FNIP1的降解可能会调节AMPK或mTORC1的活性，因为这些激酶控制线粒体的生物发生，而线粒体产生大多数细胞ROS。然而，尽管FEM1B的缺失略微改善了成肌细胞中mTORC1的氨基酸依赖性激活，但FNIP1共缺失刺激了这种激活，而不是降低了这种激活（图S6A）。缺乏FEM1B引起的AMPK活性的轻微增加也不受FNIP1共耗尽的影响（图S6B）。此外，其degron的突变不影响FNIP1与AMPK或mTORC1调节因子的结合（图S6C），这表明FNIP1的稳定性不影响成肌细胞中mTORC1或AMPK信号传导。
图S6 FEM1B和FNIP1控制代谢，与图7相关
或者，FNIP1的稳定性可能直接影响线粒体。的确，尽管FEM1B缺失并没有降低线粒体含量（图S6D），但在透射电镜下，FEM1B缺失细胞的所有线粒体都显示出严重染色的基质（图7Ab）。因此，在缺乏FEM1B的细胞中，线粒体会发生基质凝聚，这被认为是由于缺乏氧化磷酸化的底物。许多线粒体也表现出洋葱状嵴旋转（图7Ac），表明呼吸链成分在氧化磷酸化受损的反应中上调，并且在线粒体自噬开始时观察到一些线粒体含有大泡（图7Ad）。FNIP1共缺失挽救了这些表型（图7Af），表明FNIP1的稳定改变了线粒体形态，与氧化磷酸化的减少一致。
与这些发现一致，FEM1B缺失减少，但FNIP1缺失增加，线粒体膜电位（图7B）。缺乏FEM1B的细胞还包含一个碎片化的线粒体网络，聚集在细胞核周围（图7C），并且不产生线粒体ROS（图7D）。FNIP1缺失挽救了这些表型（图7B-7D），表明FNIP1稳定抑制，但其通过CUL2FEM1B的降解增加，线粒体输出产生ROS并抵消还原应激。
7、FEM1B和FNIP1是代谢调节因子
细胞质FNIP1降解如何改善线粒体活性？线粒体含有脂肪酸b氧化和TCA循环酶，将乙酰辅酶A （CoA）转化为氧化磷酸化的底物和氨基酸合成的原料。为了给这些反应提供能量，线粒体输入丙酮酸、脂肪酸或TCA循环中间体，将细胞质代谢与线粒体能量生产结合起来。
因此，本文作者想找出FNIP1的稳定性是否影响糖酵解作为丙酮酸的主要来源。消耗FEM1B降低了成肌细胞的糖酵解率，而呼吸链本身不受影响，通过耗氧量监测（图S7A和S7B）。细胞外酸化速率（反映丙酮酸下游乳酸分泌的速率）也因FEM1B的缺失而降低（图S7C）。液相色谱-质谱联用显示，FEM1B的缺失导致细胞中糖酵解和TCA循环中间体的缺失(图7E；图S7D)。此外，缺乏FEM1B会降低葡萄糖水平（图7E）以及葡萄糖摄取（图S7E）。
图7 FNIP1是一个线粒体守门人
然而，只有少数糖酵解中间体FNIP1共消耗后，葡萄糖进口仅轻度改善（图S7E）。质谱实验表明，成肌细胞从葡萄糖中获得很少的TCA循环中间体（图S7F），并且葡萄糖碳原子到TCA循环的通量不受FEM1B耗尽的影响（图S7G）。在还原性应激过程中，葡萄糖利用酶的共同耗竭也不能恢复分化（图S7H）。因此，尽管FEM1B影响葡萄糖代谢，但这可能涉及与FNIP1不同的底物。
本文作者注意到，成肌细胞从谷氨酰胺中获得大多数TCA循环中间体（图S7F），谷氨酰胺在进入线粒体之前被转化为谷氨酸。代谢组学分析发现，FEM1B的缺失降低了谷氨酸水平，而FNIP1的缺失则增加了其丰度（图7E）。FEM1B和FNIP1的共同缺失取消了这些表型。
类似的方式，其他线粒体穿梭体的前体成分在FNIP1缺失时增加，在FEM1B缺失时减少，在缺乏FEM1B和FNIP1的成肌细胞中保持不变。这包括瓜氨酸和鸟氨酸，它们补充了富马酸；脂肪酸载体乙酰肉碱及其前体泛酸酯；NADH穿梭甘油-3-磷酸（图7E）。因此，通过CUL2FEM1B降解FNIP1增加了几种代谢物穿梭体的可用性，这可能提供了启动tcac循环和诱导线粒体来源的ROS产生的方法。本文作者得出结论，CUL2 和FNIP1不仅感知而且减轻了还原型应激，而且这些蛋白是还原型应激反应的核心模块。
图S7 FNIP1和FEM1B控制了线粒体代谢物和穿梭物的丰度，与图7相关
讨论
持续缺乏ROS或还原应激会阻碍关键信号通路并增加死亡率。虽然线粒体不活为还原应激提供了生理触发器，但它也是通过抑制CUL3KEAP1和随后的NRF2积累引起的。KEAP1抑制是营养消耗、暴露于亲电毒素或种系或体细胞突变的常见结果，并且在癌细胞中经常发现KEAP1突变。因此，必须存在检测和缓解还原性应激的机制。
本文的研究结果表明，FNIP1的降解主要作为线粒体的守门人。FNIP1的稳定降低了线粒体来源的ROS，并诱导了线粒体形态的改变，这让人想起了缺乏氧化磷酸化的底物。稳定的FNIP1也耗尽了细胞中的代谢物穿梭，这降低了三羧酸循环中间体的水平，并抑制了产生呼吸链底物的反应。因此，FNIP1的稳定可能有助于具有高活性线粒体的细胞的抗氧化防御。FNIP1作为线粒体抑制剂的作用也可能与它在自噬之前被招募到受损的线粒体有关，因为需要关闭受损的细胞器以确保细胞存活。
重要的是，还原应激通过其显著的ROS缺失减少了FNIP1中的Cys degron，并触发了这个线粒体守门人的蛋白酶体降解。在缺乏FEM1B的细胞中，FNIP1的缺失增加了代谢物穿梭的水平，增加了线粒体膜电位，并恢复了线粒体活性。这些观察结果与小鼠FNIP1缺失的表型一致，FNIP1缺失导致糖酵解向氧化肌纤维转变，以大量线粒体为特征。本文作者的结论是，FNIP1降解增加线粒体输出以产生ROS并抵消还原应激。因此，CUL2FEM1B和FNIP1构成了一个泛素依赖的应激模块，可以调节线粒体输出到成肌细胞的代谢和氧化还原需求（图7F）。
虽然FNIP1是还原应激过程中的关键底物，但CUL2FEM1B也靶向其他蛋白；与FEM1A、FEM1B或FEM1B或FEM1C配对的CUL2泛素化组蛋白SLBP结合蛋白SLBP，FEM-1与蠕虫中的Gli转录因子结合。FEM1蛋白也在c端规则途径中发挥作用，以消除具有羧基端缺失或截断的蛋白质。因为FEM1A不与FNIP1结合，所以FEM1B很可能通过一个不同的位点检测这些靶点，可能协调它们与氧化还原调节的降解。本文作者还发现CUL2FEM1B与mTORC1抑制剂GATOR1结合，但不多聚化。相反，FNIP1缺失会增加氧化肌纤维，GATOR1的肌肉特异性缺失会导致糖酵解纤维的转换。本文作者推测GATOR1调控FEM1B，以防止FNIP1的过早降解或协调还原应激和mTORC1信号传导。因此，我们对还原应激反应的发现为解剖和调节后生动物氧化还原应激信号的复杂结构的治疗益处提供了一个起点，这是阐明后生动物在自然环境中如何完成组织稳态的重要一步。
