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miwenyilab
摘要
正常情况下，环状GMP-AMP酶（cGAS）对于保持细胞和组织内稳态是必须的。本篇文章研究表明泛素蛋白酶体系统（UPS）在循环细胞中会降解核cGAS，而SPSB3-CRL5复合物作为cGAS靶向底物受体来降解核cGAS。在核小体上结合的cGAS与SPSB3形成的复合物的冷冻电镜扫描结构揭示了在cGAS的C端上一个高度保守的NN最小degron基序，能够定位SPSB3的募集、泛素化以及cGAS蛋白稳定性。
在有丝分裂中，当核膜分解时，cGAS被迅速募集到染色体上，随后重新定位到核内部。这种状态是通过将cGAS紧密拴在核小体表面的酸性贴片上来实现的，这些酸性贴片掩盖了DNA结合和酶激活所需的基本元件。然而，细胞是如何在总监控基因进程中协调染色质中cGAS表现仍不清楚。
1. cGAS核内降解
为了确定核内cGAS的命运，研究人员实用活细胞成像分析系统对cGAS进行了追踪。在有丝分裂后，核内cGAS的富集在后代细胞循环的时候出现了进行性下降。质量图谱稳定细胞术（QIBC）分析表明核内cGAS水平从G1期到G2期持续性下降，主要是在G1期积累，且通过补充胞质内cGAS水平平行积累。在有丝分裂期间，当cGAS与染色质共定位时，记录的cGAS水平不会再有变化，而大量cGAS逐渐减少主要是在核内池而不是在细胞质内。
核内cGAS输出可能是由于观察到的亚细胞cGAS分布变化的原因。然而，由钩端霉素B导致的化学抑制，并不会影响核内cGAS的降低。研究表明cGAS不会从细胞核转运到胞质溶胶。为了解释cGAS核内丢失的现象，研究人员考虑可能是通过UPS系统使蛋白降解的。活细胞成像分析发现封锁蛋白酶体能够稳定胞内cGAS，可在几种人细胞系中观察到此类现象。这些结果表明UPS在对核内cGAS蛋白水解起一个重要的作用。
2. cGAS调控下CRL5-SPSB3的鉴别
为了确定参与核内cGAS降解的因子，研究人员使用RNA干扰（RNAi）为基础的基因筛查靶向972个与UPS相关联的基因，并使用共聚焦显微镜观察核内cGAS富集程度。发现siRNA介导的蛋白酶体不同亚基的敲除消除了核 cGAS 降解。研究人员通过鉴定了CRL5复合物的所有组成部分——CUL5,RBX2,NEDD8,TCEB1和TCEB2,CUL5特异NEDD8的E2泛素结合酶UBE2F以及表征不明的底物受体SPSB3。含有 SPRY 结构域和 SOCS-box（SPSB） 的蛋白通过其SOCS box与连接到 CUL5-RBX2 复合物的延伸蛋白 B-延伸蛋白 C（ELOBC）异二聚体接头结合，并通过 SPRY 结构域的特异性蛋白泛素化募集底物。
与SPSB3相比，其他SPSB家族成员中没有一个在筛查中作为要点，表明SPSB3是掌控核内cGAS蛋白稳定性的独特重要性。使用活细胞成像、共聚焦显微镜以及WB分析可知，SPSB3和CUL5的敲除使得核内而不是胞质内的cGAS进行降解，而cGAS转录水平并未受到影响。SPSB3和CUL5的减少在整个分裂相期间使CGAS的降解减缓。相对的，SPSB3的过表达拯救了核内cGAS的水平。相同的是，这些数据证明了CUL5-RBX2-ELOBC E3连接酶聚集的规则以及其底物受体SPSB3，以下称为CLR5–SPSB3，能够控制核内cGAS的水平。
3. CLR5SPSB3调控cGAS泛素化
图1
SPSB3与cGAS高效结合，促进了cGAS泛素化，也减弱了由MLN4924带来的效果，但缺失SOCS box的SPSB3并不会影响到cGAS的泛素化。通过敲低SPS3，观察到诱导的大量cGAS是通过K48泛素链进行泛素化，有效调控了融合到核定位信号的cGAS，验证SPSB3靶向CLL5泛素连接酶活性是拮抗核内cGAS池。
为了进一步确定cGAS是由SPSB3识别，使用由ELOBC异二聚体稳定的SPSB3组成核心结构部分的截短对SPSB3体外靶向进行重组结合。cGAS非N端结构的敲除并不会影响与SPSB3的结合，表明SPSB3识别的是催化核心。在体外泛素化分析发现CRL5-SPSB3复合物发挥功能的最小基序可以促进cGAS全长的泛素化以及其结构域。
为了确定哪些赖氨酸残基被CRL5-SPSB3靶向，研究人员通过使用光谱分析对泛素化的cGAS进行研究，发现由CRL5-SPSB3靶向的五个位点，均坐落在催化核心区域。相邻赖氨酸配对427-428（以下称KK）是被CRL5-SPSB3泛素化的、N端赖氨酸残基的最小基序。KK的替代在很大程度上消除了细胞中的cGAS泛化和核降解，从而抑制了这些残留物在决定cGAS蛋白质稳定性方面的关键作用。
总的来说，以上实验结果证明了 CLR5–SPSB3 对 cGAS 的泛素化，并确定了催化核心内特定赖氨酸对的保守靶向作为 cGAS 降解的潜在机制。
4. cGAS-SPSB3复合物结构
图2
在核内部，cGAS是通过组蛋白H2A-H2B在核小体表面行程形成酸性贴片，从而紧紧附着于染色质上。考虑到核内cGAS调控的机制，研究人员假设SPSB3可能识别核小体结合的cGAS。免疫共沉淀实验和尺寸排阻色谱（SEC）表明SPSB3-ELOBC与核小体结合的cGAS形成了复合物。人的cGAS能够在体外交叉结合单个核小体，在人体特异性第三DNA结合位点——C位点的基础表面以及核小体DNA之间。突变点分析表明C位点残基并不包括在cGAS与SPSB3结合位点中。
通过冷冻电镜结构分析发现，因此核小体核心颗粒和cGAS（位点 C））催化核心结构域与SPSB3-ELOBC异源三聚体复合物。两个不同的cGAS-SPSB3复合物的整体拓扑结构是相同的，但是结合WT型cGAS的复合物并不是完全被解析出来。
因此进一步聚焦到SPSB3-cGAS复合物的结构分析。该复合物的最终重构 3.5 Å 揭示了由 cGAS（氨基酸 497-515）上的 C 端螺旋和从 SOCS 盒结构域相对面的 SPSB3 弯曲的β夹心核心延伸的五个可变环贡献的分子间界面。cGAS与SPSB3通过氢键以及静电相互作用力互相连接。明显的是，联系组成这些主要连接的通过所有脊椎动物DNA感应cGAS酶和SPSB3受体所分享，从而定义了一个cGAS蛋白被E3泛素连接酶靶向的保守机制。
通过模拟 CRL5-SPSB3 对 cGAS 的泛素化，将驱动（下缩）的 ELOBC-CRL5-ARIH2 E3-E3 复合物对接到 SPSB3-cGAS-核小体组装体10（图 3e）。在该模型中，cGAS 和泛素结合的 ARIH2 位于弯曲和拉长的 CRL5–SPSB3 核心的两端，促进 ARIH2 穿过 SPSB3 结合的 cGAS 底物进行泛素连接。明显的是，ARIH2活性位点晶体半胱氨酸由cGASLys427和428并列，合理化该特定底物位点的优先连接。人cGAS能够通过C位点连接桥接单个核小体，位点在体外能够与第二个核小体结合。然而，cGAS-核小体复合物到cGAS–SPSB3–ELOBC–CLR5复合物导致了第二个核小体和CRL5催化亚单位之间的空间冲突。因此，单核小体-cGAS复合物是CRL5-SPSB3泛素化的底物。
使用生物层干涉测量法（BLI）分析相互作用，发现SPSB3 以亚微摩尔亲和力探测cGAS（图 4a）。值得注意的是，cGAS上保守的NN基序是 SPSB3 识别的主要贡献者。在支持的cGAS识别上的单点突变削弱了与SPSB3之间的连接，且所有四个cGAS残基的结合突变完全封锁了结合，更加确定他们在加强复合物形成的重要性。NN基序的突变抑制了cGAS由CRL5-SPSB3体外引起的泛素化。细胞cGAS和SPSB3共表达确定了cGAS(NN)失去了结合SPSB3和泛素化的能力。
图3
5. 核cGAS影响IFN信号调控
为了确定核内cGAS由CRL5-SPSB3控制的生物序列，研究人员接下来监控了cGAS活性中最突出的IFN响应情况。与WT cGAS相比，cGAS（NN）或cGAS（KK）诱导了IFNB1和IFN-刺激基因（ISG）表达的水平增加。因此，降解缺陷的cGAS（NN）的表达提高了cGAMP的产出量，无论是在WT型还是核小体结合缺陷活跃的cGAS突变体（R255A）。核cGAS的持续表达与type1 IFN在mRNA实验细胞中的持续响应是相对照的，但SPSB3的异位表达使Hela细胞中ISG的基础表达量降低。
研究人员发现SPSB3敲除提高了多种细胞系中type1 IFN信号，且这种相应严格依赖于cGAS。降解缺陷cGAS突变体的表达降低了细胞的对感染的易感性，提高了type1 IFN的表达量。总的来说，这些结果证明了核cGAS水平影响着细胞IFN水平，表明了细胞内在免疫CRL5-SPSB3的规则。
图4
讨论
本篇文章主要提供了一个关于核cGAS调控的完整结构模型。在有丝分裂中，染色质的暴露将cGAS募集到核小体中，使紧密的染色质束缚核cGAS池。而有丝分裂结束时，cGAS水平由SPSB3确定的泛素化调控，导致了下一次有丝分裂开始前的低核内蛋白水平。核内cGAS水平和细胞循环的协同可能是平衡自动响应的功能和风险所必须要有的，特别是在细胞循环复制阶段中基因复制之前。因此，除了核小体结合cGAS的移除，SPSB3还可能靶向结合cGAS的组件和游离的cGAS。SPSB3广泛的结合能力以及不可逆转的自然降解过程产生了高效的cGAS失活机制。而NN degron的保护和SPSB3表面的保护则是限制cGAS丰度、调整细胞内在免疫的条件。
cGAS上由CRL5-SPSB3调控的检查点可能会提供免疫靶向治疗的新方向。而cGAS-SPSB3的结构提供了合理设计cGAS靶向药的一个新视角。
