蛋白质降解剂进入临床—癌症治疗的新方法

正文部分：

21世纪之前，癌症的主要治疗方法为化疗、放疗和手术。尽管这三种方式仍然是癌症治疗的关键支柱，但细胞毒性化疗和放疗在毒性、发病率及非恶性细胞的非特异性靶向所致的长期不良反应方面具有公认的局限性。小分子抑制剂的发现开创了精准医学的新时代，其针对的是参与癌症发病机制的特定蛋白质的活性位点，而非癌细胞基本上不受影响。伊马替尼是一种构成型活性BCR-ABL1酪氨酸激酶融合蛋白（慢性髓系白血病的标志）的小分子抑制剂，是这些药物中第一个于2001年被FDA批准的药物。从那时起，数十种小分子抑制剂已被FDA批准，并在全球范围内用于实体肿瘤和血液肿瘤的治疗。

虽然小分子抑制剂的应用前景广阔，但其在肿瘤治疗中还存在许多局限性。其中一个最主要的缺点是，这些药物需要目标蛋白有一个合适的结合口袋才能发挥其抑制作用，使85%的蛋白质组无法用小分子抑制剂来“治疗”。此外，小分子抑制剂的局部浓度必须持续存在，才能发挥其治疗作用（占用驱动的药理学）。长期的、高浓度的药物暴露可能会增加某些不良反应的风险，并导致蓄积毒性。小分子抑制剂的持续治疗也可使其目标蛋白的突变，或诱导导致耐药性的补偿机制的激活。

异双功能蛋白降解剂，包括蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）蛋白降解剂，它可以消除而不是仅仅抑制目标蛋白。蛋白质降解剂的作用机制在20多年前首次提出，并于2019年首次进入临床试验，在癌症患者中的初步安全性、有效性和药代动力学结果正在出现。在此，作者概述了异双功能蛋白降解剂的开发进展，回顾了目前在癌症患者临床试验中使用的蛋白降解剂的临床前和临床数据，并考虑这些药物的前景和潜在挑战。

蛋白质降解剂的作用机制

泛素-蛋白酶体系统是蛋白质稳态的主要细胞途径，不需要的或错误折叠的蛋白质被多个泛素单位标记，从而被26S蛋白酶体降解。这种标记功能是通过E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶协同实现，E3亚群参与识别待降解的蛋白质底物。

异双功能蛋白降解剂是由结合目标蛋白质的配体、招募E3泛素连接酶的弹头和连接这两种结合剂的接头组成的。通过使目标蛋白和E3连接酶在物理位置上的接近，利用泛素连接酶机制将泛素转移到目标蛋白上，导致其被蛋白酶体降解（图1）。

图 1

异双功能蛋白降解剂具有与传统小分子抑制剂不同的药理学特征(图1)。首先，由于蛋白质降解剂协调形成一个短暂和可逆的三元复合物(由目标蛋白、E3连接酶和蛋白质降解剂组成)，并且由于随后的蛋白酶体降解在动力学上是不可逆的，蛋白质降解剂能以亚化学计量的方式促进多个目标蛋白的降解。因此，蛋白质降解剂从传统药理学的占用驱动转变为事件驱动。其次，由于靶蛋白与E3连接酶之间诱导的蛋白-蛋白相互作用，蛋白质降解剂三元复合物可以起正协同或负协同作用。因此，蛋白质降解剂对目标蛋白或E3连接酶的二元结合亲和力与三元复合物的整体结合亲和力和/或随后降解效率之间可能存在有限的直接关系。

最早的蛋白质降解剂例子是自然界中的肽类物质。完全由小分子组成的蛋白质降解剂在2008年首次被描述（图2）。“全小分子”蛋白质降解剂的发现，加上高质量的小分子E3连接酶配体的确定，引起了学术界与工业界的广泛关注，最终成立了多家以蛋白质降解剂为重点的公司，以探索该方式的人类治疗潜力。

图 2

蛋白质降解剂的设计与进展

靶点选择

蛋白质降解剂研发中需要考虑的关键问题就是目标蛋白的选择，这与其治疗潜力直接相关。考虑到相对较大的超出Lipinski类药五原则分子(如异双功能蛋白降解剂)的药代动力学负担，合乎逻辑的目标是那些已经尝试其他治疗方法但失败或根本无法尝试的靶点。Bekes等人提出了一个蛋白质降解剂靶点的原则框架，来指导靶点的选择。该框架包括6个方面，与其他治疗方式相比，这些领域将利用蛋白质降解剂独特的、事件驱动的药理学：①经典的不可用药靶点；②耐药突变；③基因扩增和/或蛋白过表达；④差异亚型表达或定位；⑤具有支架功能的蛋白质；⑥蛋白质聚集物。

E3连接酶的选择

人类基因组中有600多种E3连接酶，迄今为止，只有少数E3连接酶被成功用于靶向蛋白降解：MDM2、cIAP、VHL和CRBN。基于VHL的蛋白降解剂的发展首先是由一种强效和特异性的小分子VHL结合剂的发现所推动的，该结合剂利用了VHL的HIF1α结合部位中独特的羟脯氨酸识别元件。而基于CRBN的蛋白降解剂，是由于发现一类分子胶降解剂（免疫调节酰亚胺药物，IMiDs），与CRBN的底物识别功能结合并进行调节。这两种连接酶取得了优越的地位，是因为它们具有以下特点：①它们可以使用现有的、易获得的、在结构上能够识别连接体附着点的小分子结合剂；②具有灵活性，可降解各种目标；③相对普遍的表达就能实现高水平的系统降解。

除了CRBN和VHL之外，E3连接酶新配体发现前景广阔。越来越多的研究集中在组织特异性或肿瘤特异性E3连接酶的配体开发上。基于共价配体筛选的新平台显示出快速识别新的E3连接酶结合物的前景，目前已识别出RNF4、RNF114、DCAF16、KEAP1、DCAF11和FEM1B的共价工具配体。

靶配体设计

从历史上看，异双功能蛋白质降解剂利用的是“现成”的靶蛋白结合剂，这些结合剂最初被设计为抑制剂，而对进化为降解剂没有预见。随着对降解的新靶点的探索，特别是经典的“不可药物”靶点，对识别新的靶蛋白结合物的需求增加。DNA编码化合物库(DEL)技术是一种用于蛋白质降解剂中识别配体的补充方法，它与配体的结合位点和功能活性无关，并且可在没有任何进一步结构支持的情况下提供了潜在的连接子连接载体(在DNA条形码附着点)。2021报道了一项利用DEL发现ERα配体的初步研究，这些配体随后被转化为活性蛋白降解剂。DEL技术也可能有助于发现新的分子胶降解剂、E3连接酶配体和全蛋白降解剂。

连接子设计

目标蛋白和E3连接酶结合物之间的化学连接子(linker)同样是蛋白质降解剂中重要的组成部分。通常使用简单的烷基链或聚乙二醇作为连接子，由于蛋白质之间的空间冲突，连接子过短会妨碍有效三元复合体的形成；连接子过长可能会破坏三元复合物形成正协同效应。在某些情况下，连接子不是三元复合物中的旁观者，可以与蛋白质表面形成自己的接触。连接子的构象限制可通过降低自由度或锁定生物活性构象来进一步提高效力。这一策略已用于SMARCA2/4降解剂、AR降解剂，以及ER降解剂ARV-471中应用。此外，一项研究表明连接点与E3连接酶结合剂的变化影响了蛋白降解剂的整体水稳定性和CRBN新底物降解。

结构辅助设计

以结构生物学为基础的蛋白质降解剂的合理设计仍处于起步阶段。无论是通过X射线晶体学、低温电子显微镜还是建模，都很难获得对蛋白降解剂作用机制至关重要的三元复合体的三维结构图像。一项具有里程碑意义的研究中，BRD4-PROTAC MZ1-VHL的X射线晶体结构显示了三元界面中广泛的蛋白质-蛋白质接触，驱动三元复合物的协同作用，连接子参与蛋白-配体的相互作用，并解释了对BRD家族的特异性降解机制。该结构还揭示了一条涉及不同连接载体的连接子优化路径，构成了第一个报道的基于结构的蛋白降解剂连接子设计的例子。结构生物学随后被成功地用于SMARCA2/4-VHL三元复合物中，以优化蛋白质降解剂的连接子，提高降解效力。

药代动力学

口服给药是疾病治疗的理想给药形式，但是异双功能蛋白质降解剂分子本质上是双靶点药物，独特的结构导致分子量较大，溶解性较差，药物性质很难满足经典的Lipinski类药五原则。并且其体内外渗透性表现不佳，口服生物利用度通常偏低，吸收较差。但现有的报告表明，优化降解剂有望达到足够的口服吸收水平。然而，少数研究数据发现，烷基和聚乙二醇连接子线性脂肪链或醚结构有被氧化代谢的风险，，并与高蛋白质降解物清除率的趋势有关。设计构象限制的定制连接子可降低代谢和/或增强口服吸收，例如，通过引入溶解基团，如碱性胺。

蛋白质降解剂有望根据其作用机制中不可逆的和时间依赖性表现出非线性药效学。一旦蛋白质被降解，该蛋白质的恢复取决于其固有的重新合成速率。对于重合成速率较长的蛋白质，这种延迟可能导致某一时间点的蛋白质降解剂浓度与同一时间点观察到的降解之间出现较大的脱节。

临床前证据

上述蛋白质降解剂设计方面的突破为这些药物的早期临床试验铺平了道路。截至2023年1月8日，已有18种异双功能蛋白降解剂正在进行癌症患者的I-III期临床试验评估。以下总结,回顾了支持这些药物从实验室进入临床研究的临床前数据,仅包括已在科学会议上发表或提交的数据,在公司网站或行业活动上披露的数据不包括在内。

AR靶向蛋白降解剂

雄激素信号传导在驱动前列腺癌进展中的关键作用使AR成为备受关注的蛋白降解靶点。此外,一些阻碍AR通路的药物是mCRPC患者的标准治疗方法，并为新的AR靶向药物提供了基准。因此，靶向AR的5种蛋白质降解剂：Bavdegalutamide(ARV-110)、CC-94676、AC176、HP518和ARV-766,均在转移性前列腺癌患者中进行临床试验。

Bavdegalutamide是一种PROTAC蛋白降解剂，含有一个与AR配体结合域结合的环己基部分，并通过基于IMiD的部分与含CRBN的E3泛素连接酶结合，从而实现AR的多泛素化。在前列腺椎体癌(VCaP)和前列腺淋巴结癌(LNCaP)细胞系中，Bavdegalutamide诱导了AR的有效降解，其DC50为~1 nM。在VCaP细胞中近4000个可检测蛋白的蛋白质组学筛选中，，10 nM的Bavdegalutamide处理8小时导致AR选择性降解，Dmax为85%。除了野生型AR外，也降解了某些临床相关的AR突变体（特别是T878A、H875Y、F877L和M896V突变体），这些突变体与对新激素药物（阿比特龙/恩杂鲁胺）的耐药性相关。

与恩扎鲁胺（一种获准用于治疗男性前列腺癌的AR拮抗剂）相比，Bavdegalutamide对前列腺特异性抗原（PSA）的合成和细胞增殖的抑制作用更大，并能诱导前列腺癌细胞的凋亡。Bavdegalutamide的活性已在各种前列腺癌的动物模型中进行了测试，结果显示Bavdegalutamide对肿瘤生长的抑制作用更明显；Bavdegalutamide对肿瘤生长的100%抑制伴随着PSA水平>90%的降低；阿比特龙-Bavdegalutamide联合使用时可增强其临床活性并克服耐药性。

ER靶向蛋白降解剂

ER+乳腺癌占女性乳腺癌病例的大多数，几种阻断ER活性的内分泌疗法已被批准用于该疾病的各个阶段。内质网拮抗剂氟维司群的作用于内质网的核转位，从而导致该蛋白的蛋白酶体降解。然而，氟维司群治疗后，高达50%的基线ER水平仍保持不变。此外，在接受内分泌治疗期间，患者可能发生ER编码基因(ESR1)突变，其中一些突变可能降低细胞对氟维司群和其他试验性选择性ER降解剂(SERDs)的敏感性。为了解决氟维司群作为ER降解剂的不足，两种靶向ER的基于CRBN的蛋白质降解剂(ARV-471和AC682)正在临床开发中，用于治疗ER+乳腺癌。

在许多乳腺癌细胞系的临床前分析中，PROTAC ARV-471导致野生型ER的降解，DC50为1-2 nM；ER突变体，如Y537S和D538G，在暴露于ARV-471后也被降解。此外，ARV-471单药治疗在几种ER依赖性乳腺癌模型中具有抗肿瘤活性。

BTK靶向蛋白降解物

BTK是导致B细胞激活、增殖和存活的信号通路的关键组成部分。一些BTK的小分子抑制剂（如伊布替尼）已被批准或正在临床开发中，用于治疗B细胞恶性肿瘤；然而，这些药物的疗效受限于BTK的耐药性突变。四种基于CRBN的靶向BTK的蛋白降解剂（NX-2127、NX-5948、BGB-16673和HSK29116）已进入临床试验阶段。

BRD9靶向蛋白降解物

含溴结构域域蛋白9（BRD9）是异常BAF染色质重塑复合物的一个组成部分，该复合物还包含致癌的SS18-SSX融合蛋白，该蛋白与滑膜肉瘤的发展有关。两种基于CRBN针对BRD9的蛋白降解剂，CFT8634和FHD-609，正在晚期滑膜肉瘤患者中进行评估。

靶向参与癌症发病机制的其他蛋白质类的蛋白质降解剂

DT2216是一种基于VHL靶向抗凋亡蛋白BCL-XL的蛋白质降解剂，可有效降解BCL-XL（治疗16小时后DC50为63nM），对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞有细胞毒性作用，但对血小板无作用，DT2216被用于各种实体瘤患者的临床开发。DT2216与其他BCL-2家族成员具有亲和力，能选择性地降解BCL-XL，而不影响BCL-2、BCL-W或MCL-1的蛋白水平。

KT-413（以前称为KTX-120）是一种基于CRBN的蛋白质降解剂，针对IL-1受体相关激酶4（IRAK4），一种参与传递Toll样受体下游信号的蛋白质，是对病原体的先天免疫反应的一部分。KT-413除了目标蛋白外，还对Ikaros和Aiolos具有降解活性。此外，使用KT-413后还可观察到DNA复制和细胞周期基因的下调以及促凋亡和抗增殖基因的激活。

KT-333是一种靶向STAT3的蛋白降解剂，STAT3是一种参与细胞增殖和凋亡的转录激活因子。KT-333在实体瘤细胞系、淋巴瘤细胞系和原代免疫细胞中诱导STAT3的有效降解；在淋巴瘤细胞系中，STAT3的降解具有高度选择性。

ASP3082是一种靶向KRASG12D的蛋白降解剂，KRASG12D通过有丝分裂原激活的蛋白激酶通路调节细胞增殖和存活，该通路与多种实体瘤有关，包括胰腺癌、肺癌和结直肠癌。ASP3082在胰腺癌细胞中诱导KRASG12D有效降解。

CFT1946是一种基于CRBN针对BRAFV600X的蛋白降解剂，BRAFV600X一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的突变形式，是RAS的下游效应器，已在黑色素瘤、结直肠癌和肺癌等各种癌症中出现；几种小分子BRAFV600X抑制剂已被批准用于治疗BRAFV600E/K突变型癌症患者，使BRAFV600X成为蛋白降解剂技术的合理目标。CFT1946在黑色素瘤细胞系的近9000个蛋白质中以剂量依赖的方式选择性地靶向降解BRAFV600E，并抑制ERK磷酸化。CFT1946还显示出对人类细胞系中异位表达的非V600E BRAF突变体有降解作用。

现有临床证据

2019年，PROTAC AR降解剂Bavdegalutamide成为首个进入mCRPC患者I期临床试验的该类药物。将蛋白质降解剂用于癌症治疗的几项临床试验设计在2022年的科学会议上被提出。然而，迄今为止，正在进行的肿瘤学研究中仅公布了PROTAC AR降解剂Bavdegalutamide、PROTAC ER降解剂ARV-471和BTK降解剂NX-2127的临床数据，这些数据均显示出了良好的治疗效果。

蛋白质降解剂的未来发展方向

进入临床试验阶段的蛋白质降解剂分子主要以传统的AR、ER、BTK等为靶点，这些蛋白分别与前列腺癌、乳腺癌和慢性淋巴细胞白血病发病相关，并且已获批的药物可作为临床前和临床试验的基准。Bavdegalutamide、ARV-471和NX-2127显示了蛋白质降解剂用于癌症治疗的活性，其他药物必将紧随其后，下一步的关键是确定该方法是否符合临床上的期望，即用于经典不可治疗靶标的降解。

药物递送系统也可以成为一种有效的替代策略，通过将靶向蛋白降解剂包装到递送载体中，将其快速输送到疾病部位，可最大限度地减少全身性递送的潜在毒性。目前已报道了多种靶向递送系统，包括抗体-蛋白降解剂共轭物和蛋白降解剂，它们可以在肿瘤中通过光、叶酸或活性氧被选择性激活。此外，虽然本综述的重点是用于癌症治疗的蛋白质降解剂，但该技术也可能用于靶向参与其他疾病发展的蛋白质（例如，自身免疫性疾病的IRAK4），从而提供了更广泛的治疗潜力。

蛋白质降解剂面临的潜在挑战

尽管蛋白质降解剂在临床前和临床环境中都显示出了良好的属性，但当它们被更广泛地用于癌症患者时，可能会遇到某些障碍。尚未有临床数据解决的问题是，患者是否会对蛋白降解剂产生耐药性。关于这种现象的临床前报告是有限的，但迄今为止，大多数蛋白降解剂耐药的情况是通过影响泛素-蛋白酶体系统的改变而发生的，例如，E2泛素结合酶、E3泛素连接酶的成分或E3连接酶活性的调节器（如COP9信号体）的功能丧失，而不是目标蛋白的改变。这需要对长期使用蛋白降解剂治疗的患者进行评估，以确认临床前观察到的耐药机制是否也发生在临床环境中。

为其他靶点和癌症类型设计新型蛋白质降解剂的能力有该技术固有的局限性，包括要求其同时进入细胞内泛素-蛋白酶体与目标蛋白结合。此外，尽管靶向经典不可降解蛋白的蛋白降解剂是一个非常有趣和有潜力的领域，但识别降解物结合位点的困难不应被低估。蛋白质降解剂的DEL技术以及与蛋白质降解剂互补的技术可能会克服这些障碍。

在过去的20年里，蛋白质降解剂经历了真正的从实验室到临床的漫长历程。截至目前，实验室研究占据了这段旅程的大部分时间，包括蛋白质降解剂的设计、改进以及在体外和体内系统的严格测试。蛋白质降解剂在4年前刚刚进入临床开发阶段，初步的临床数据表明蛋白质降解剂用于癌症治疗的效果令人鼓舞和欣慰的，蛋白质降解剂可能为一系列疾病的治疗提供实质性的希望。