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摘要
染色体的形态在遗传中是非常重要的，周期性有丝分裂错误会导致染色体不稳定（CIN），从而引起肿瘤的发生。研究发现HPV16 E6的表达会导致有丝分裂驱动蛋白CENP-E的降解，其缺失产生纺锤体极附近长期不对齐的染色体(极性染色体),并且不能聚集。HPV16 E6通过E6AP和蛋白酶体依赖性方式引起有丝分裂驱动蛋白CENP-E的降解来诱导这种表型。本文首次从机制上揭示了人乳头瘤病毒如何诱导HNC中的CIN。
简介
一个多世纪以来，人们已经发现有丝分裂过程中出现的错误可能会导致癌症的发生。有丝分裂错误导致了非整倍体后代的出现，连续细胞分裂中反复出现的有丝分裂错误会导致染色体不稳定(CIN)。低CIN率可通过癌基因的获得或肿瘤抑制基因的丧失促进肿瘤的发展。较高的CIN率会导致细胞死亡，很可能是由于基本染色体的丢失和肿瘤抑制。因此，CIN是癌症的一个共同特征。
人乳头瘤病毒编码两种主要的癌蛋白，E6和E7。E6结合p53和宿主泛素连接酶E6AP(也称为UBE3A)，E6AP泛素化p53并使其降解。E7结合Rb，Rb通过释放E2F转录因子的抑制作用来加速细胞进入S期。因此，病毒E6和E7在宿主细胞中的共表达会导致细胞周期进程和增殖增加以及凋亡减少。且HPV16 E6和E7都被认为是导致CIN的各种有丝分裂缺陷的原因。此外，E6的表达导致染色体排列缺陷，在纺锤体极(极性染色体)附近产生长期不对齐的染色体。
本研究的目的是确定在HNC中人乳头瘤病毒的有丝分裂缺陷及其相关机制，证明HPV16 E6癌基因表达在HNC中引起一种特定类型的CIN，是由于染色体组装缺陷而导致的极性染色体。这种人乳头瘤病毒诱导的有丝分裂错误特别是由于E6表达并依赖于E6AP介导的有丝分裂马达CENP-E的前体降解。CENP-E的减少或其ATP酶活性的抑制导致极性染色体的特异性增加。得到最终结论:HPV16 E6癌基因的表达导致HNC中一种特殊类型的CIN，其特征在于极性染色体，由E6AP介导的CENP-E降解。
结果
1. 人乳头瘤病毒16型导致HNC染色体组装缺陷
为了确定HNC中人乳头瘤病毒引起的CIN的类型，研究人员观察切片引起CIN的细胞有丝分裂的缺点，根据DNA的位置推断出多极纺锤体。在人乳头瘤病毒+组织中观察到的最显著的有丝分裂缺陷是染色体错位。通过研究发现人乳头瘤病毒+细胞中染色体错位的发生率显著增加。在这些细胞中，有丝分裂纺锤体的可视化证实了未对齐的染色体位于或接近纺锤体极点，称之为“极性染色体”。由以上可知，人乳头瘤病毒会导致HNC肿瘤中错位染色体的特异性增加。
为了确定哪种人乳头瘤病毒癌基因负责诱导HNC中的极性染色体，检测了HPV16 E6和/或E7在细胞系中的表达。我们观察到E6的表达，无论有或没有E7的共表达，都导致极性染色体的显著增加，单独的E7表达不会导致任何有丝分裂表型的显著增加。与对照相比，E6和E7的共表达引起多极纺锤体的显著增加。因此，E6的表达足以导致在人乳头瘤病毒+ HNC中观察到的纺锤体极附近错位染色体的增加。
极性染色体在后期早期染色体分离成纺锤极后更有可能与主核结合，导致整个染色体非整倍性。先前的研究表明，当基于每个臂的平均同源变异进行聚类时，人乳头瘤病毒+头颈癌(HNSCCs)与宫颈鳞状细胞癌(CESCs)聚类，其中95%是人乳头瘤病毒+HNC。因此，研究人员将这一分析扩展到来自TCGA的鳞状细胞癌(SCC)样本。在HNC肿瘤、pdx、细胞系和表达HPV16 E6的NOK中观察到的极性染色体表型与在一大群人乳头瘤病毒阳性癌症患者中观察到的全染色体非整倍体相关。
图1
2. HPV16 E6通过降低CENP-E蛋白水平导致极性染色体
E6表达后观察到的极性染色体有两种形成机制。
首先，极性染色体可以在多极纺锤体聚焦后出现。在表达E6的细胞中，大多数未对齐的染色体出现在正常的双极纺锤体上，而＜20%出现在假双极纺锤体上。另一个公认机制是有丝分裂驱动蛋白CENP-E(61–64)的定位、表达和/或活性降低。为了确定E6的表达是否影响CENP-E的定位，进行了定量免疫荧光实验。由实验可知，E6表达显著降低了CENP-E的动粒募集，动粒着丝粒中CENP-E水平也显著降低。CENP-E受到细胞周期的严格调控，蛋白水平在G2和有丝分裂后期达到峰值，随后在有丝分裂末期发生定量蛋白酶体介导的降解，导致G1和S期的水平较低。因此，CENP-E蛋白表达减少可能是特异性的，也可能是E6表达细胞有丝分裂指数降低的间接结果。在表达E6的NOKs中，CENP-E的极性染色体和着丝粒定位减少可能是由于CENP-E蛋白水平的特异性降低。
为了证实在缺乏E6的NOK细胞中，CENP-E的减少诱导极性染色体，在NOK细胞中用siRNA去除了CENP-E，降低了CENP-E蛋白的表达，极性染色体数量随之增加。为了进一步证实CENP-E在NOKs中诱导极性染色体的作用，我们用GSK923295抑制了CENP E ATPase活性，这显著增加了极性染色体的发生率。以上这些数据表明CENP-E水平或活性的降低足以在NOK中诱导极性染色体。
人乳头瘤病毒+HNC样本通常表达HPV16 E6，具有降低的CENP-E水平，极性染色体数量也增加。HPV16+宫颈癌细胞(SiHa和CaSki)也具有显著更高水平的极性染色体和更低水平的CENP-E。因此，HPV16感染在大多数情况下会导致CENP-E缺失和极性染色体。
研究人员测试了CENP-E降低是否与p53缺失有关。之前已经在原代鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和肠中表明，p53缺失不会降低CENP-E蛋白表达或产生极性染色体。
为了确定PDZ结合基序是否是E6诱导的CENP-E降解所必需的，我们用E6的突变体(E6δ146151)转染了NOK，其依旧可以降解p53，但不能结合含有PDZ结构域的蛋白质。野生型E6和突变体的表达均会导致CENP-E蛋白减少，同时极性染色体增加。因此，可以得出结论，E6介导的CENP E的降解并不依赖于它与PDZ结构域的相互作用。
图2
3. E6调节翻译后CENP-E水平
目前尚不清楚E6表达后CENP-E蛋白水平降低是由于转录时减少还是转录后事件。CENP-E剪接由ERH(基本剪接的增强子)控制，ERH表达的减少降低了CENP-E蛋白的表达，产生极性染色体。由实验结果可知，E6表达没有降低CENP-E总RNA或mRNA，表明CENP-E蛋白水平的降低是由于翻译减少或蛋白更新增加导致的。用蛋白酶体抑制剂MG132处理后增加了CENP-E和p53的表达水平，与E6降低CENP-E的翻译后稳定性一致。脉冲追踪实验也显示，E6的表达急剧增加了p53水平降低的速率。在表达E6的细胞中，CENP-E水平也下降得更快。
结论是，E6通过增加其蛋白酶体降解速率来调节翻译后的CENP-E。
图3
4. CENP-E表达的恢复拯救了E6诱导的极性染色体
这些结果表明，E6通过增加CENP-E的数量来诱导CIN。为了直接验证这一点，我们在E6表达的NOKs中恢复了CENP-E的表达。使用四环素（tet）诱导后，这些可诱导的GFP-CENP-E表达NOK的亚克隆中CENP-E蛋白表达增加，并不影响有丝分裂指数。因此我们检测了是否GFP-CENP-E的诱导性表达恢复了E6表达NOKs的CENP-E水平，并挽救了染色体组装。尽管对照表达细胞中CENP-E蛋白水平增加了大约四倍，但是在E6表达细胞中它们没有增加。这进一步支持了观点：即使当CENP-E过表达，E6介导强有力的CENP-E蛋白降解。重要的是，GFP-CENP-E在有丝分裂期间恰好定位于细胞的着丝点上，但是在tet诱导后，在E6表达的细胞中几乎完全不存在。与对照相比，只有5%的E6细胞表达在动粒着丝粒处表达GFP-CENP-E。因此，在E6存在的情况下，tet诱导的GFP-CENP-E表达并不足以恢复着丝粒处的CENP-E水平或阻止极性染色体的发生。然而，用MG132抑制蛋白酶体将CENP-E蛋白水平增加到接近对照细胞的水平，并将着丝粒处的CENP-E水平恢复后，大大降低了极性染色体的发生率。
这些结果可说明由E6介导的CENP-E的高效蛋白酶体介导的降解会导致极性染色体。
图4
5. E6AP是E6介导的CENP-E降解和极性染色体形成所必需的
E6通过驱动自身、E3泛素连接酶E6AP和p53之间形成稳定的三元复合物，使p53降解。E6AP是E6诱导蛋白酶体介导的p53降解所必需的。为了确定E6AP是否在E6存在的情况下引起CENP-E的泛素化和蛋白酶体降解。通过实验可以确定，在无E6AP的NOK中表达E6或E6+E7时，CENP-E和p53水平保持稳定。定位在野生型NOK中的CENP-E动粒显著降低，表达E6后，CENP-E动粒水平在无E6AP的NOKs中保持稳定。重要的是，在缺乏E6AP的情况下，E6的表达不会导致染色体收缩缺陷。因此，细胞泛素连接酶E6AP对于E6介导的CENP-E降解和随后的极性染色体诱导是必需的。
图5
讨论
本研究证明了HPV16引起一种特定类型的CIN诱导的有丝分裂缺陷，其特征是染色体不能聚集，并在纺锤体极或其附近保持不对齐，这是由于有丝分裂驱动蛋白CENP-E的蛋白酶体降解增加所导致的。这个问题是由HPV16 E6癌基因引起的，并不依赖于HPV16 E7、p53和E6 PDZ结合域，并需要细胞E3泛素连接酶E6AP。
人乳头瘤病毒+宫颈癌中有丝分裂缺陷的图像典型地描述了极性染色体，对异常有丝分裂图像的检查揭示了细胞中大多数染色体在中期板上对齐，未对齐的染色体与中期平板完全分离，根据方向和预期由纺锤体极占据的位置以及中期板的宽度决定其最终位置。这表明无论癌症类型如何，极性染色体可能代表人乳头瘤病毒诱导的CIN的主要机制。实际上，HPV16感染也诱导宫颈癌细胞模型中的CENP-E变性和极性染色体。
前人研究已经提出E6间接引起中心体扩增，因为p53水平的降低允许四倍体细胞在胞质分裂失败后继续增殖，这使中心体数量加倍。E7可直接导致延长的S期中心粒过度复制。随着时间的推移，原发性p53缺失的mef经常胞质分裂失败，并作为四倍体或近四倍体细胞增殖，这表明中心体中少数极性染色体扩增的NOK纺锤体集中成双极纺锤体是p53降解的下游结果。
当细胞退出有丝分裂时，CENP-E蛋白通常会迅速降解。然而，对APC/C底物的筛选没有鉴定出CENP-E，并且SCF (Skp1-cullin-F盒)E3泛素连接酶的Skp1与CENP-E相互作用。研究人员证明了E3泛素连接酶E6AP在HPV16 E6存在的情况下负责CENP E的降解。E6介导的CENP-E降解的发生独立于PDZ结合域，后者介导了许多E6的蛋白相互作用。
CENP-E水平的降低对人乳头瘤病毒诱导的肿瘤发生有一定的影响。低比率的CIN可以通过允许细胞对各种核型进行采样来识别和选择那些在其微环境中提供增殖优势的核型，从而促进肿瘤的发生。CENP-E的杂合减少增加了极性染色体的发生率，导致非整倍性和低CIN率，这促进了脾淋巴瘤和肺腺瘤的发展。非整倍性，会由于复制缺陷、DNA损伤和染色体重排而导致基因组不稳定。最终主核分离下来形成微核的染色体片段或分离染色体或可激活促炎性cGAS/STING途径，并在随后的分裂中经常被分离。因此，HPV16 E6诱导的CENP-E降解可能通过引起低CIN率，从而增加非整倍性、炎症和DNA损伤而促进肿瘤发生。
责编：吕鉴可
