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摘要
C1orf106基因多态性与炎症性肠病（IBD）风险增加相关。然而，C1orf106的功能和疾病相关多态性的后果尚不清楚。本研究表明，C1orf106通过调节cytohesin-1（一种控制ARF6激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子）的降解来影响粘附体连接的稳定性。通过限制cytohesin-1依赖性ARF6的激活，C1orf106稳定粘附体连接。与该模型一致，C1orf106-/-小鼠表现出肠上皮细胞屏障缺陷，这种表型在IBD患者中观察到，赋予肠道病原体易感性增加。此外，IBD风险变异增加了C1orf106泛素化和转化为功能损伤的结果。这些发现阐述了一种遗传多态性调控肠上皮屏障完整性的机制，并阐明了细胞连接控制的基本机制。
背景介绍
肠道上皮细胞是维持肠道内稳态所必需的，并参与许多生理过程，包括营养吸收、生物保护和肠道损伤后的修复。炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道慢性炎症性疾病，在IBD患者中观察到异常的肠通透性。据报道，一些IBD患者的家庭健康成员肠道屏障发生了变化，虽然潜在的机制尚未明确，但也表明宿主遗传可能是细胞内在屏障缺陷的基础。通过全基因组关联研究，C1orf106被确定为IBD易感基因，随后的外显子组测序显示，C1orf106 （*333F）的编码变异增加了IBD的风险。在这里，我们阐明了C1orf106的功能，并发现它在上皮稳态中的作用。我们报告了一种机制，是一种与IBD 相关的机制，即C1orf106的风险变异降低了细胞连接完整性，说明这种变异增加了IBD的易感性。
结果分析
C1orf106在人的肠道和肠上皮细胞系中高表达，但在骨髓细胞和小鼠骨髓源性巨噬细胞中表达水平较低。在人结直肠癌细胞系Caco-2细胞中，随着细胞分化并形成单层极化上皮（肠上皮的一个特征），C1orf106蛋白表达增加（图1A）。为了解释C1orf106的功能，我们利用人胚胎肾（HEK）293T细胞中免疫沉淀的表位标记的C1orf106，通过基于串联质谱的亲和蛋白质组学来鉴定与C1orf106相互作用的蛋白。Cytohesin-1和cytohesin-2是两个最重要的相互作用物（图1B）。Cytohesin-1是控制ARF6鸟苷三磷酸酶（GTPase）激活的鸟嘌呤交换因子（GEF）之一。由于GEF的参与，ARF6的功能是控制质膜蛋白质的再循环。共免疫沉淀实验通过在HEK293T细胞中过表达C1orf106和cytohesin-1和-2以及Caco-2细胞中的内源性蛋白证实了C1orf106与cytohesin-1和-2之间的相互作用（图1C和D）。结构域定位实验进一步表明，C1orf106的N端结构域与cytohesin-1的N端结构域特异性相互作用（图1C和E）。
为了在生理相关模型中研究这些蛋白之间的功能相互作用，我们生成了C1orf106-/-小鼠，并检测了该模型系统中cytohesin-1的稳态水平。我们发现，与从C1orf106+/+小鼠分离的细胞相比，从C1orf106-/-小鼠分离的细胞中分离的，结肠和小肠上皮细胞中的细胞cytohesin-1蛋白水平持续增加1.5至2倍（图1F）。与这些发现一致的是，来自结肠类器官的C1orf106-/-上皮单分子层在膜和细胞质蛋白组分中也表现出cytohesin-1蛋白水平的增加（图1G），但是cytohesin-1mRNA水平没有差异。这些数据表明，cytohesin-1的增加是转录后调控的，而不是由于蛋白质在细胞膜和细胞质室中的不同定位。与这一假设相一致的是，C1orf106表达的增加显著降低了过表达或内源性cytohesin-1的水平，表明C1orf106表达足以调节cytohesin-1的稳态水平（图1H）。Cytohesin-2也观察到类似的结果。这些数据表明，C1orf106的表达限制了cytohesin的稳态水平。
图1 C1orf106调节cytohesin-1（CYTH1）水平
接下来，我们研究了泛素化和蛋白酶体降解是否调节cytohesin-1水平。MG132（一种蛋白酶体抑制剂）处理细胞之后，增加了cytohesin-1稳定性，这表明cytohesin-1是可以被蛋白酶体降解的。过表达C1orf106可以增加泛素化的cytohesin-1水平（图2A）。对结肠上皮细胞的分析表明，C1orf106-/-的细胞在稳态下cytohesin-1的泛素化水平降低（图2B）。这些数据表明，C1orf106的表达通过泛素介导的蛋白酶体降解限制了cytohesin-1的水平。
C1orf106有一个被推测为功能未知的结构域DUF3338，预计它参与蛋白与蛋白相互作用，但它缺乏酶活性。因此，我们假设C1orf106作为泛素连接酶的辅助因子，来泛素化cytohesin-1。为了了解c1orf106介导的cytohesin-1蛋白水平控制机制，我们在蛋白质组学数据中发现了可能介导泛素化的c1orf106结合蛋白。重要的是，SKP1-CUL1-Fbox (SCF) E3泛素连接酶复合物的每个亚基和两个F-box底物接头蛋白BTRC1和FBXW11都被认定为C1orf106的相互作用物（图1B）。SCF泛素连接酶复合物在调节特定底物蛋白的泛素化和随后的降解中发挥重要作用。我们进行了免疫共沉淀实验，以确定SCF复合体中的哪些蛋白与C1orf106特异性相互作用（图2C和D），结果我们发现的是底物接头蛋白BTRC1和FBXW11，这表明C1orf106可能作为底物辅因子（图2C和D）。
为了验证SCF复合物介导cytohesin-1泛素化的假设，我们下调了BTRC1和FBXW11的表达，并评估了cytohesin-1的表达水平。用FBXW11小干扰RNA（siRNA）处理的细胞表现为更为显著增加的cytohesin-1表达水平（图2E），这说明含有FBXW11而不含BTRC1的SCF复合物调节cytohesin-1的稳定性。接下来，我们测试了MLN4924的作用，MLN4924是nedd8激活酶的小分子抑制剂，该酶是neddylation(拟素化)和激活cullin-RING泛素E3连接酶（包括SCF复合物）所必需的。用MLN4924处理人结肠HT-29细胞导致内源性cytohesin-1水平的剂量依赖性增加（图2F）。综上所述，这些结果表明cytohesin-1水平受SCF泛素连接酶复合物的泛素化和随后的蛋白酶体降解的动态调节。
图2 C1orf106通过SCF泛素连接酶复合物调节CYTH1的泛素化
接下来，我们试图了解c1orf106介导的cytohesin-1降解如何改变上皮细胞功能。Cytohesin-1作为GEF调节ARF6的活性，ARF6是一种GTP酶，控制膜受体再循环的速率，并介导控制肌动蛋白重塑的信号通路。因此，我们假设C1orf106-/-细胞中cytohesin-1蛋白水平的增加会增加ARF6的激活水平。为了验证这一假设，我们评估了类器官源性肠上皮单层中活化的ARF6（ARF6-GTP）的水平，发现尽管ARF6的总水平相当，但C1orf106-/-细胞中的ARF6-GTP水平是C1orf106+/+细胞中的1.5倍（图3A）。鉴于活化的ARF6-GTP定位于质膜，我们接下来分析了ARF6在这些细胞中的定位。免疫染色证实C1orf106-/-上皮单层质膜上ARF6水平升高（图3B）。对来自C1orf106+/+和C1orf106-/-上皮单分子层的不溶性膜组分的分析表明，C1orf106-/-细胞的膜组分中ARF6水平升高，进一步支持了这些细胞中膜相关ARF6-GTP水平升高的发现。
ARF6在调节重要粘附连接蛋白的表达水平中起关键作用，并且已知在上皮细胞中激活ARF6可增加钙粘蛋白E的内化。因此，我们假设C1orf106-/-肠上皮细胞中cytohesin-1和ARF6-GTP水平的升高会导致钙粘蛋白E表面水平的降低。正如预测的那样，C1orf106-/-肠单层上皮中钙粘蛋白E的免疫染色显示，与C1orf106+/+细胞中的比例相比，细胞内含有点状钙粘蛋白E的细胞比例增加了三倍以上（图3C）。在C1orf106-/-小鼠的结肠组织切片中也观察到细胞内点状钙粘蛋白E的增加（图3D）。我们检测到上皮紧密连接蛋白occludin、ZO-1、claudin1或claudin2的定位没有差异，mRNA或蛋白水平也没有差异（图3B至D）。这些数据证实了钙粘蛋白E的特异性作用。C1orf106-/-结肠类器官中钙粘蛋白E的染色模式沿连接处排列紊乱，并显示细胞质中斑点形成增加。此外，在分化的人Caco-2细胞中敲低C1orf106后，也观察到钙粘蛋白E无序。内化的钙粘蛋白E与细胞内ARF6点共定位，这与ARF6在钙粘蛋白E内化中的作用一致。ARF6调节肌动蛋白动力学是已知的。在C1orf106-/-细胞中，我们观察到肌动蛋白沿内细胞膜呈明显的囊泡染色，这进一步支持了ARF6在这些细胞中动力学改变的作用。为了证实钙粘蛋白E沿着细胞表面的定位减少，我们对细胞外膜结合蛋白进行了生物素化，然后在新鲜分离的C1orf106+/+和C1orf106-/-小鼠的结肠上皮细胞和类器官来源的单层中进行了生物素化的钙粘蛋白E免疫印迹分析。尽管钙粘蛋白E的总表达量相似，但我们发现，与C1orf106+/+细胞相比，C1orf106-/-细胞中表面钙粘蛋白E的表达量减少了两倍以上（图3E和F）。这些数据表明，C1orf106通过调节cytohesin降解来限制ARF6的激活，在维持粘附连接方面发挥了关键作用。
上皮连接的完整性在肠道内稳态和损伤后的组织修复中很重要。接下来，我们通过测试荧光标记分子通过肠道屏障的能力来监测上皮屏障的完整性。C1orf106-/-和C1orf106+/+小鼠对FITC（异硫氰酸荧光素）-葡聚糖（4 KDa）具有相似的通透性（图3G）。然而，C1orf106-/-结肠组织对一种较小的化合物Lucifer黄（0.4 KDa）的渗透性显著增加（图3H）。总之，这些数据表明，C1orf106的损失增加了对较小溶质的渗透性。为了进一步证实这一发现，我们测量了上皮电阻（TEER），以评估来自于稳定敲除C1orf106的类器官和Caco-2细胞的C1orf106+/+和C1orf106-/-单层膜的屏障功能。与对照细胞相比，C1orf106缺陷的细胞中最大的TEER显著降低，这表明上皮屏障完整性受损。
为了测试钙粘蛋白E循环的变化是否会改变C1orf106-/-细胞在损伤后修复上皮连接的能力，我们通过用EGTA处理细胞以破坏细胞外钙粘蛋白E相互作用，然后用正常培养基处理，对类器官来源的单层进行钙开关试验；在本实验中，我们监测钙粘蛋白E染色，以评估恢复时间2小时后连接的重组。虽然C1orf106+/+和C1orf106-/-单分子膜同样被EGTA破坏，但与C1orf106+/+单分子膜相比，C1orf106-/-单分子膜在恢复2小时后表现为重组的缺失。在恢复阶段钙开关后，同时也测量TEER，与C1orf106+/+单层膜相比，C1orf106-/-单层膜在基线和恢复阶段表现出较低的TEER。选择性敲低cytohesin-1足以挽救C1orf106-/-单层细胞的基线TEER，表明cytohesin-1是C1orf106-/-细胞中观察到的屏障表型的关键介质(图3I)。
图3 C1orf106通过ARF6激活控制表面钙粘蛋白E水平
在类器官来源的上皮单层中，与C1orf106+/+细胞相比，C1orf106-/-细胞在肝细胞生长因子诱导的细胞迁移期间的迁移率显著增加。这些发现表明，C1orf106的缺失降低了连接完整性，导致细胞在稳态下迁移增加，而生长因子刺激不能弥补这一缺陷。
对微生物病原体和生态失调的易感性增加通常与IBD有关。为了确定C1orf106-/-小鼠是否破坏了上皮屏障的完整性，导致细菌传播增加，我们用细胞外肠道小鼠病原体啮齿枸橼酸杆菌（Citrobacter rodentium）对C1orf106+/+和C1orf106-/-小鼠进行了试验，该细菌诱导结肠病变，类似于与克罗恩病相关的临床肠致病性大肠杆菌菌株。此外，上皮防御在感染后早期限制啮齿枸橼酸杆菌至关重要。C1orf106-/-小鼠在第5天表现出明显增加的啮齿枸橼酸杆菌负荷（图4A）。值得注意的是，在第5天，C1orf106-/-小鼠中，啮齿枸橼酸杆菌向肠系膜淋巴结和脾脏的移位也显著增加（图4A）。尽管C1orf106-/-小鼠在感染后12天能够控制啮齿枸橼酸杆菌感染，但与C1orf106 +/+小鼠相比，它们表现出显著缩短的结肠长度和更严重的组织病理学，包括隐窝损伤（图4B至D）。感染后12天，C1orf106-/-小鼠的细胞因子反应未受损。此外，免疫细胞类型（如T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和先天淋巴样细胞）的水平在基线时保持不变。白细胞介素-22、脂钙素-2、粪便免疫球蛋白A（IgA）、粪便白蛋白和抗菌肽的水平在基线时也没有改变，这表明这些不会导致细菌防御的早期损伤。C1orf106-/-小鼠也表现出从葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎中恢复受损，表现为更大的体重减轻、结肠长度缩短和更严重的组织病理学，这与从肠道损伤中恢复的能力受损相一致。
深外显子测序已经鉴定出C1orf106,*333F的编码变异，该变异与IBD风险增加有关。与野生型C1orf106（C1orf106 WT）相比，瞬时转染期间C1orf106 *333F的表达可重复性降低，尽管mRNA水平相当，这表明该风险变异表达不良或不稳定（图4E）。为了检验C1orf106 *333F蛋白水平的下降是否由于蛋白酶体的泛素化和降解，我们用MG132处理细胞；用该蛋白酶体抑制剂处理后，C1orf106 *333F蛋白恢复到WT水平（图4F）。与WT相比，我们还观察到C1orf106 *333F的泛素化增加，这表明IBD风险多态性增加了C1orf106的蛋白质周转，导致功能蛋白的表达减少（图4F）。与这些结果一致，我们在LS174T细胞中使用环己胺测定，发现C1orf106 *333F的半衰期为10.2小时，而C1orf106 WT的半衰期几乎为17小时。为了研究C1orf106 *333F半衰期缩短的表型效应，我们分别用C1orf106 WT或C1orf106 *333F转导C1orf106-/-类器官。C1orf106 *333F的表达不足以恢复C1orf106的WT水平，介导cytohesin-1的降解，或增加C1orf106-/-单层细胞的TEER（图4G和H）。C1orf106 *333F的表达破坏了钙粘蛋白E和肌动蛋白在单层肠上皮细胞和人肠细胞中的组织和染色（图4、I、J）。综上所述，这些数据提示了一种机制，通过*333F多态性降低C1orf106蛋白的稳定性，从而通过破坏cytohesin-1的转换和降解而损害肠道上皮的完整性，从而增加对IBD的易感性。
图4 体内C1orf106维持肠道屏障功能，IBD风险变异改变了C1orf106的稳定性
讨论
我们的研究结果通过调节肠上皮细胞的完整性确定了C1orf106在IBD中的关键功能。我们已经证明，C1orf106作为一种分子变阻器，通过SCF复合物依赖的降解来限制cytohesin的水平，从而调节屏障的完整性。考虑到C1orf106和CDH1（E-cadherin）的多态性与溃疡性结肠炎（IBD的一种形式）的风险增加相关，C1orf106调节钙粘蛋白E表面水平的发现值得注意。增加C1orf106的稳定性可能是一种潜在的治疗策略，以增加治疗IBD的上皮屏障的完整性。
