NASP通过两种独特的H3结合模式维持组蛋白H3 - H4的稳态

组蛋白伴侣调节组蛋白代谢的各个方面。NASP是H3-H4二聚体的主要组蛋白伴侣，对防止组蛋白降解至关重要。在这里，我们确定了NASP的两种不同的组蛋白结合模式，并揭示了它们如何合作以确保组蛋白H3-H4的供应。我们确定了sNASP二聚体与两个H3 α3 peptides的复合物和sNASP - H3 - H4-ASF1b共伴侣复合物的结构。这确定了NASP的不同功能，并确定了两种不同的结合模式，分别涉及H3 α3螺旋和H3 αN区域。功能研究表明，H3 αN相互作用是NASP在细胞中的主要结合方式，NASP屏蔽H3 αN区域对于维持H3 - H4组蛋白可溶性库至关重要。总之，我们的研究揭示了NASP作为一种主要的H3-H4伴侣蛋白在保护组蛋白稳态中的分子基础。

组蛋白伴侣形成一个蛋白质网络，参与组蛋白代谢的各个方面，包括组蛋白折叠、翻译后修饰、运输、核小体组装和拆卸、组蛋白回收和周转、储存和降解。因此，组蛋白伴侣直接或间接影响基因组的稳定性和完整性、基因转录、DNA复制和修复。组蛋白伴侣蛋白是一类缺乏序列相似性的蛋白质，它们通过进化以多种方式保护组蛋白。因此，对组蛋白及其伴侣蛋白复合物的结构研究对于揭示组蛋白伴侣蛋白功能的分子基础和功能研究至关重要。DAXX - H3.3 - H4复合物的结构解释了DAXX的组蛋白H3.3变异特异性，而结构引导的TONSL功能研究揭示了独特的组蛋白伴侣和读取器在DNA复制和修复中的功能。最近，结构引导的蛋白质组学揭示了DNAJC9’s的双重组蛋白和热休克共同伴侣功能，将ATP资源的蛋白质折叠与核小体组装途径联系起来。在这里，我们重点研究核自身抗原精子蛋白（NASP）的结构及其与多种组蛋白底物的相互作用。NASP是一种保守的H3-H4组蛋白伴侣蛋白，在组蛋白代谢中起中心作用，但sNASP护送和保护组蛋白底物的分子基础尚不清楚。

在人类中，NASP有两个非等位基因剪接变体，睾丸NASP (tNASP)和体细胞NASP (sNASP)。tNASP在睾丸、卵巢和转化细胞中高表达，而sNASP则普遍表达。tNASP被认为是HSP90的共同伴侣，并参与H3-H4二聚体的早期折叠，而sNASP在伴侣网络中具有更广泛的作用。sNASP是包含组蛋白伴侣ASF1 （a和b）、RbAp46/48和组蛋白乙酰转移酶HAT1的多伴侣复合物的一部分，参与新合成的H3-H4二聚体的乙酰化和转运。这种多伴侣复合物缓冲了在复制应激过程中积累的新的可溶性H3 - H4二聚体，也可能重新乙酰化驱逐H3 - H4二聚体。值得注意的是，sNASP和tNASP是维持细胞周期中H3-H4二聚体的可溶性池和保护它们免受伴侣介导的自噬降解所必需的。最近，sNASP也被提出在细胞核中维持单体H3的可溶池。与其作为主要H3-H4伴侣的作用一致，NASP基因的纯合缺失在小鼠中具有胚胎致死性。

NASP广泛分布在真核生物中，其组蛋白伴侣的功能在很大程度上是保守的。分裂酵母的同源基因Sim3、拟南芥的同源基因NASP和出芽酵母的同源基因Hif1p可以结合并陪伴组蛋白CENPA和H3（带或不带H4）。此外，非洲爪蟾的同源物NASP.S（也称为N1/N2）和NASP.L（也称为N1/ N2样）可能在爪蟾卵母细胞中储存母体H3-H4二聚体。NASP及其同源物共享一个非典型四肽重复（TPR）结构域。它们构成了SHNi-TPR （Sim3Hif1-NASP interrupted TPR）家族，预计有4个TPR基序，其中TPR2基序被一个长酸性区域中断，紧接着TPR4基序的一个capping helix区域中断，以及一个包含核定位信号（NLS）的无序c端区域。最近确定的Hif1p结构主要证实了非典型SHNi-TPR结构域的结构特征。然而，目前还无法获得与组蛋白H3和H4结合的NASP家族伴侣蛋白的结构。

各种研究已经在体外对NASP及其与多种组蛋白底物的相互作用进行了生物化学表征。sNASP可以在溶液中形成单体和二聚体，它可以结合组蛋白H3单体和H3 - H4二聚体，它可以与ASF1 （a和b）结合，共同伴侣H3 - H4。此外，sNASP和tNASP都表现出对典型H3及其变体的核小体组装活性。Ladurner实验室最近的研究表明，sNASP可以通过其TPR结构域的中心通道与H3 C末端表位结合，但伴侣蛋白使用二级相互作用位点与ASF1共同伴侣蛋白复合体中的H3 - H4结合。本文报道了sNASP二聚体、sNASP与H3 α3 peptide的复合物以及sNASP - H3 - H4 - ASF1b共伴侣复合物的晶体结构。我们确定了NASP的两种不同的H3结合模式，我们的功能研究表明，H3 αN结合模式代表了细胞中的主要结合模式，在与ASF1 （a和b）和HAT1的共伴侣复合物中采用。此外，我们证明了NASP对H3αN区域的屏蔽对于维持H3 - H4组蛋白可溶性库是必不可少的。总之，我们的研究提供了NASP作为维持组蛋白稳态的主要H3-H4伴侣蛋白功能的分子基础。

1、sNASP二聚化的结构基础

人类NASP有两个剪接变体sNASP和tNASP，其中tNASP含有较长的酸性区域。我们专注于TPR结构域的结构研究，TPR结构域负责组蛋白H3和H4的sNASP和tNASP识别，以及核小体组装活性。为了便于结晶，我们构建了一个包含人类sNASP的TPR结构域和封盖螺旋区域的结构体，删除了酸性区域(a.a 30-340，删除了a. 101 - 159；以下简称“sNASP核心”，sNASPc)（图1A和补充图S1A）。在凝胶过滤纯化过程中，sNASPc在色谱上显示出两个峰（构象）。我们从每个峰中收集馏分，并重新进行凝胶过滤分析；在我们的实验条件和分析的时间尺度上，这两种构象都表现得相对稳定，没有明显的交换（补充图S2A，B）。二聚体和单体构象通过尺寸排除色谱耦合多角度光散射（SEC-MALS）进一步证实（图1B和补充表S1）。有趣的是，人类sNASP在体外被证明是同二聚体。

经过广泛的努力，我们从二聚体凝胶过滤馏分中获得了晶体，并求解出了sNASPc二聚体构象的3.30Å晶体结构（立体视图见图1C和表4）。结构中的两个原聚体由一个2重对称轴相连，每个原聚体包含4个TPR基序。每个TPR1-3基序都采用标准折叠，而TPR4是TPR4的一个变体，其预测的第二螺旋和capping区域共同形成一个非常长的延伸-螺旋（即α89）。扩展后的α89由sNASPc的Tyr261到Gly324（64个残基）组成，在Glu305处有一个扭结，扭结后的α89螺旋长度约为95Å (65Å + 30Å)。α89和α89′捻一个另一个左撇子的方式形成一个反平行的卷曲螺旋结构, C端三分之一的α89′sNASPc的原体进一步包装对α7和α89的氨基端三分之一的sNASPc原体,反之亦然。因此,C端。α89和α89′的三分之一螺旋线每个函数就像一个“限制螺旋”,形成了独特的建筑domain-swapping和dumbbellshape二聚体(图1 c)

α89和α89′之间的螺旋状相互作用共由66个残基（每个螺旋33个残基）组成，其中主要的相互作用是疏水相互作用和范德华接触，少量氢键和盐桥进一步稳定了二聚体（图1D）。此外，这些相互作用残基中的大多数在不同物种之间是保守的。与广泛的相互作用一致，许多不同的突变体沿着二聚体界面具有单甚至双突变，但未能破坏二聚体，只有一个突变体用谷氨酸取代了6个疏水残基(V265E I272E L282E V286E I300E L307E；发现6E突变体终止了二聚体的形成（图1E）。稳定性测量显示，sNASPc 6E突变体的弯曲温度（Ti = 38.9◦C）低于野生型sNASPc二聚体（Ti = 58.9◦C）和单体（Ti = 58.8◦C），这意味着sNASPc 6E突变体虽然是单体，但与sNASPc单体具有不同的构象。

根据我们的结构观察，来自HeLa S3的共免疫沉淀实验显示，外源性表位标记的sNASP野生型（wt）降低了内源性s-和t- NASP，而这些相互作用在sNASP 6E突变体中受损（图1F和补充图S2E）。这支持了NASP可以通过α89介导的线圈状相互作用在体内形成同质和异质二聚体。我们注意到sNASP 6E突变体的表达水平始终低于wt，这表明突变或自身无法二聚化影响了稳定性。然而，破坏sNASP二聚化并不影响其在体内的组蛋白结合，因为wt和6E突变体都有效地拉低了组蛋白H3（图1F）。

图1 sNASPc二聚体的结构与生化分析

2、H3的sNASP识别的结构基础

接下来，我们对sNASP和H3之间的相互作用进行了结构和生化分析。作为第一步，我们的等温滴定量热（ITC）分析显示，H3的α3区（残基116-135）和N端区（残基1-59）与sNASPc二聚体的结合在微摩尔尺度上具有相当的亲和力（Kds分别为0.7和1.2 μM）， H3的N区（残基40-59）构成了N端区域的主要结合位点（Kd为5.3 μM）（图2A，B，E）。由于sNASPc以二聚体和单体的形式存在，我们还研究了H3αN和α3区域与sNASPc单体的相互作用。有趣的是，ITC结果显示sNASPc二聚体和单体与H3αN肽（Kds为5.3 vs. 5.2 μM）和H3 α3肽（Kds为0.7 vs. 1.0 μM）的亲和力非常相似。因此，sNASPc二聚体和单体与H3相互作用的结合模式可能相似。我们的ITC结果进一步揭示了sNASP的酸性区域对于与H3的αN区和α3区结合都不是必需的。我们还进行了不同盐浓度（50和400 mM NaCl）下的ITC实验，以评估结合亲和力是否相应调节。sNASPc二聚体与H3αN的结合亲和力确实受到盐浓度的调节，在50、200和400 mM NaCl条件下，Kds分别为0.2、5.3和14.9μM。sNASPc二聚体与H3 α3的结合亲和力也有类似的趋势，在50、200和400 mM NaCl条件下，Kds分别为0.06、0.7和1.8μM。这表明sNASPc二聚体在低盐浓度下以亚微摩尔亲和力与H3αN和α3结合，并且在所有盐浓度下对H3 α3的亲和力略高。据报道，sNASP与MBP-H3 （a.a.116 - 135）融合肽结合，在200 mM NaCl下具有非常高的亲和力（报道Kd为0.061μM），而我们只能在50 mM NaCl下观察到sNASPc二聚体与H3 α3 （a.a.116 - 135）肽之间的高亲和力（Kd为0.061 M）。这种小的不一致可能是由于用于ITC检测的不同肽（合成肽与MBP融合肽）。有趣的是，先前的研究表明，H3的N端79残基足以结合细胞提取物中的sNASP和tNASP，而另一篇报道则发现了sNASP与H3的C端α3螺旋之间的相互作用。因此，我们的结果很好地证实和调和了这些发现。此外，由于sNASPc二聚体和单体似乎相对稳定，我们使用凝胶过滤法来评估它们在与H3αN和α3肽结合时是否会交换。结果支持sNASPc二聚体和单体之间没有明显的交换，即使在过量的H3αN和α3多肽存在的情况下。

为了进一步了解sNASP对H3的识别，我们开始在H3αN或α3肽存在的情况下结晶sNASPc二聚体和单体。由于最初的试验不成功，我们制作了一个与sNASPc和H3.3α3 （a.a 116 - 135）片段共价连接到一个表达盒的共价复合物。从大肠杆菌中表达并纯化了sNASPc - H3 α3。所得的sNASPc - H3 α3共价配合物在凝胶过滤纯化的色谱上显示出二聚体和单体构象（以下分别称为sNASPc - H3 α3二聚体和单体）对应的两个峰。经过对sNASPc - H3 α3二聚体和单体的大量结晶试验，我们成功地解出了sNASPc - H3 α3二聚体的2.85 Å晶体结构（立体视图见图2C）。原聚体sNASPc和sNASPc '在结构内形成二聚体，就像上面描述的载脂蛋白sNASPc二聚体结构一样，每个原聚体都接合一个H3 α3分子（图2C）。与原聚体sNASPc结合的H3 α3分子似乎来自与另一个原聚体sNASPc’融合的H3 α3片段，反之亦然。这两个H3 α3分子中的每一个都采用与核小体结构高度相似的螺旋构象，并被包含在每个sNASPc原聚体凹侧的凹槽内。结合槽是由一个原聚体的TPR3和TPR4基序的保守残基和另一个原聚体的“旋盖螺旋”区域形成的，这意味着这种结合模式需要二聚化。此外，该沟槽是两亲的，其一侧有疏水袋，周围有许多带负电荷的保守残基。

H3 α3与sNASPc的保守残基形成广泛的相互作用，形成凹槽（图2D）。最突出的特点是H3 Arg129和Ile130的主链羰基与sNASPc Arg242的侧链建立了3个氢键，形成螺旋盖相互作用。另一个特点是H3 Leu126和Ile130的侧链被结合到由NASPc 7中的Arg242、Ala245、Glu246和Tyr249， sNASPc α8中的Ser271和Ile275， sNASPc α89中的Leu306‘、Glu309’、Ile310‘和Lys313’组成的疏水口袋中。结果表明，H3 α3的结合可以稳定sNASPc:sNASPc二聚体。此外，H3 α3的5个带电残基参与了多种盐桥和氢键相互作用：H3的Lys122和Arg129与sNASPc α89‘的Glu309‘建立了盐桥；在sNASPc ' α7中，Asp123与Tyr 249和Tyr257形成两个氢键，在sNASPc'α89'中与Lys313’形成盐桥；H3的Arg128与snaspc3的Glu97有两个盐桥；H3的Arg131分别与sNASPc 7中的Glu246和sNASPc 5中的Gln204形成盐桥和氢键。H3的Ile124和Ala127与周围sNASPc残基之间的范德华接触可能进一步稳定了H3 α3与sNASPc之间的相互作用。值得注意的是，一些排在凹槽上的带负电荷的残基，包括sNASPc的Glu215和Glu217以及sNASPc '的Glu302’、Glu305’、Glu312’和Asp316’，并没有直接参与与H3 α3的结合（图2D）

我们的ITC分析显示，sNASPc单突变体R242A和L306A以及三突变体E246A Y249A L253A （EYL3A）都破坏了sNASPc二聚体与H3 α3之间的复合物形成，而其他sNASPc突变体（二聚体构象）仅对与H3 α3的结合产生中间影响（图2E，F）。我们重点研究了突变体EYL3A、R242A和L306A，这些突变体在很大程度上取消了结合。这些突变体与我们的结构观察一致，sNASPc的Arg242参与了突出的螺旋盖相互作用；NASPc的Glu246、Tyr249和Leu253位于凹槽的中心，Glu246和Tyr249进一步参与形成疏水袋；sNASPc '的Leu306‘也参与了疏水口袋的形成（图2D）。有趣的是，Glu246、Tyr249和Leu253在sNASP和H3 α3之间的相互作用中起重要作用，进一步证实了我们的结构数据。由于突变体R242A、EYL3A和L306A破坏了sNASPc二聚体与H3 α3之间的相互作用，我们进一步通过弯曲温度（Ti）来评估它们的折叠。sNASPc R242A二聚体（Ti = 55.4◦C）和sNASPc L306A二聚体（Ti = 54.7◦C）的弯曲温度接近野生型sNASPc二聚体（Ti = 58.9◦C），这意味着它们具有相似的结构构象。sNASPc EYL3A二聚体比sNASPc二聚体具有更低的弯曲温度（Ti = 48.8℃），这表明EYL3A突变可能导致局部构象畸变。此外，我们的ITC结果显示，H3的αN区与sNASPc二聚体及其突变体R242A和EYL3A结合，以及与H3 α3预结合的sNASPc二聚体具有相似的亲和力（图2G）。这表明sNASPc二聚体上的H3 α3-结合槽不参与H3的αN区结合，sNASPc二聚体可以同时结合H3的αN区和α3区。这也表明sNASPc EYL3A二聚体是折叠的，因为它与野生型sNASPc一样有效地结合H3αN。有趣的是，ITC结果显示sNASPc R242A单体和sNASPc EYL3A单体也失去了与H3 α3的相互作用，就像它们的二聚体形式一样，这进一步支持了sNASPc二聚体和单体的H3 α3-结合模式相似。

总之，我们的结构和生化分析提供了sNASP如何与H3结合的分子基础。

图2 sNASPc与H3相互作用的结构和生化分析

3、sNASP与ASF1b共伴侣关系的结构基础

sNASP是H3-H4二聚体的主要组蛋白伴侣，它与组蛋白伴侣ASF1和HAT1-RbAp46乙酰转移酶全酶合作，维持细胞内H3-H4的可溶性来源。通过生化分析研究了sNASP、H3-H4二聚体和ASF1 （a和b）之 间的相互作用，但这种重要而神秘的共伴侣复合物的结构基础仍然难以捉摸。为了探索这一点，我们将纯化的sNASPc二聚体与H3 - H4四聚体和ASF1b （a.a. 1-158）或ASF1a （a.a .1-155）混合。按1：1：2.4比例（sNASPc二聚体：H3 - H4四聚体：ASF1），成功重组了共伴侣配合物sNASPc - H3 - H4 - ASF1b和sNASPc - H3 - H4 - ASF1a异质四聚体。重组不依赖于子组分的混合顺序。此外，经SEC-MALS分析证实，每种重组的共伴侣复合物的化学计量比为1:1:1:1 (sNASPc、H3、H4和ASF1b或ASF1a)（图3A）。这一观察结果表明，sNASPc在sNASPc - H3 - H4 - ASF1b和sNASPc - H3 - H4 - ASF1a异四聚体中采用单体构象，并且在与H3 - H4二聚体和ASF1b或ASF1a结合后，sNASPc从二聚体转变为单体构象。由于我们试图结晶sNASPc-H3-H4 - ASF1b和sNASPc-H3-H4 - ASF1a异质四聚体的尝试没有成功，我们构建了sNASPc-GGGSGGGS-ASF1b的共价盒（a.a.1-158)（称为sNASPc-8G-ASF1b），以促进结晶，遵循我们用于其他几种共伴侣配合物结构测定的类似设计。sNASPc-8G-ASF1b盒体虽然具有共价连接体，但在溶液中与H3和H4形成1:1:1的络合物（以下简称sNASPc8G-ASF1b-H3-H4异源四聚体）；图3 A)。需要指出的是，与非共价sNASPc-H3-H4 -ASF1b和sNASPc-H3-H4 - ASF1a异质四聚体相比，共价sNASPc-8G-ASF1b-H3-H4 - ASF1a异质四聚体在SEC柱上的停留时间不同（图3A）。这可能是由于sNASPc- 8G -ASF1b盒内的共价连接体可能抑制了共伴侣复合物内sNASPc单体和ASF1b之间的相对运动。

我们成功地求解了共价sNASPc- 8G - ASF1b - H3 - H4异质四聚体的2.85 Å晶体结构（图3B），其中sNASPc确实采用单体构象。对sNASPc单体和二聚体结构的比较表明，二聚体结构中长α89螺旋的中心4转（残基285-298）在单体结构中转变为无序环（图3C）。结果，α89在单体结构中分成两个螺旋，α8和α9，其中α9被折叠成典型的封盖螺旋。单体结构中的TPR1-4基序与二聚体结构中的对应部分吻合较好，单体结构中的α9 capping螺旋与二聚体结构中的α89’ helix的C端重叠较好，总体rmsd为0.82Å。有趣的是，sNASPc-8G-ASF1b-H3-H4异源三聚体中H3-H4-ASF1b部分的结构与ASF1-H3-H4异源三聚体的结构高度相似。H3的α3螺旋被ASF1b隔离并结合，因此sNASPc上的H3 α3结合槽是空的（图3B），这与之前生化研究的观察结果一致。此外，sNASPc仅结合H3的αN区，正如预期的那样，sNASPc和ASF1b之间的相互作用由H3- h4二聚体桥接（图3B）。值得注意的是，H3的αN区采用扩展环构象，当H3被修饰或结合K56的因子结合时也观察到，但不同于它在核小体结构中形成的-螺旋结构（图3D）。

H3的扩展αN区与sNASPc凸面上的α4、α6螺旋和连接α5、α6螺旋的环（Loop56）中的几个保守残基相互作用（图3D、E）。H3 Ile51侧链与sNASPc α4中的Asp181、Asp184、Leu185和Ile188有大量的接触。H3 Arg52的主链羰基和酰胺分别与sNASPc α4中的Trp180和Asp184侧链形成氢键，其侧链分别与sNASPc α6中的Glu224和Gln221形成盐桥和氢键，并与sNASPc α6中的Glu225有接触。H3 Tyr54侧链穿透NASPc α4中Ile173、Leu176、Glu177和Trp180包围的口袋，sNASPc Loop56中Ser216包围的口袋，其芳香环与sNASPc Trp180侧链形成明显的堆叠作用，其羟基与sNASPc Ile173和Glu177主链形成氢键。此外，H3 Gln55和Ser57分别与sNASPc Loop56中的Asn218和Glu217有一定的接触。

为了测试sNASPcH3相互作用的保守残基在sNASPc - H3 - H4 -ASF1b和sNASPc -H3 - H4 - ASF1a异源四聚体中的作用，我们使用GST-ASF1a-H3-H4复合物拉下sNASPc wt和突变体（图3F）。与sNASPc wt的结合相比，sNASPc突变体E177A W180A D181A （EWD3A）、L185A I188A和E224A E225A破坏了相互作用，而sNASPc突变体W180A和N218A Q221A不同程度地减少了结合（图3F中2-7车道）。同时，在αN区缺失的H3 （H3 △55，a.a 1 - 55位的缺失）破坏了与sNASPc的相互作用（图3F中的1号通道），H3突变体I51A R52A Y54A也减少了与sNASPc的结合（图3G）。此外，我们对同一组突变体进行的ITC分析显示，除了突变体sNASPc N218A Q221A外，所有突变体都破坏了sNASPc二聚体与H3αN肽之间复合物的形成（图3H，I）。因此，这些结果支持了我们的结构观察结果，并证实了sNASPc - H3αN相互作用对sNASPc-H3 - H4 - ASF1b和sNASPc-H3 - H4-ASF1a共伴侣复合物完整性的重要性。这些突变体，包括sNASPc EWD3A二聚体（Ti = 61.6℃）， sNASPc L185A I188A二聚体（Ti = 60.4℃）和sNASPc E224A E225A二聚体（Ti = 54.1℃），具有接近野生型sNASPc二聚体（Ti = 58.9℃）的弯曲温度，这意味着它们具有相似的结构构象和相互作用的损失不是由于蛋白质展开。GST下拉实验和ITC实验刚刚提到的表现与sNASPc二聚体及其突变体(二聚体构象)和identifed关键突变,在sNASPc EWD3A二聚物,失去了与H3αN的ITC结果进一步揭示了失去约束力sNASPc EWD3A单体H3αN,这表明sNASPc二聚物和单体结合H3αN区域以类似的方式,如上所示的H3 α3绑定模式。

综上所述，我们的结构和生化分析为NASP用于与ASF1共同伴侣组蛋白H3-H4的第二种组蛋白结合模式提供了分子基础。

图3 sNASPc和ASF1b共伴侣复合物的结构和生化分析

4、不含ASF1的sNASP参与H3-H4二聚体的模型

sNASP可能在H3-H4折叠早期以及组蛋白的运输、修饰和储存过程中参与H3-H4二聚体。在描述了sNASP如何识别H3并与ASF1b共同伴侣和H3 - H4二聚体一起，我们进一步探索了sNASP的双H3αN -和α3结合模式如何在没有ASF1的情况下陪伴H3 - H4二聚体。

sNASP以二聚体而不是四聚体的形式与组蛋白H3-H4结合。我们使用GST下拉研究sNASPc上的H3αN -和α3-结合位点是否参与了它与H3 - H4二聚体的相互作用。由于GST标记的sNASPc及其突变体在纯化过程中无法分离为二聚体和单体峰，因此用于GST下拉的这些蛋白的构象是二聚体和单体的混合物。与sNASPc wt相比，我们的下拉图显示sNASPc突变体EWD3A (E177A W180A D181A；H3αN结合缺陷)和EYL3A (E246A Y249A L253A；H3αN -和α3-结合缺陷（H3αN -和α3-结合缺陷）都在相似程度上降低了H3 - H4的结合，而组合突变体EWD3A + EYL3A （H3αN -和α3-结合缺陷）表现出加性效应，并且强烈降低了H3 - H4的结合（图4A和补充图S8A）。同时，GST标记的sNASPc wt可以拉下H3△55 - H4二聚体（缺少H3αN区）和H3 (I51A R52A Y54A) - H4二聚体（H3αN区突变），但效率远低于野生型H3 - H4（图4A中的第6道，图4B）。此外，GST标记的sNASPc EYL3A （H3 α3结合缺陷）与H3 (I51A R52A Y54A) -H4二聚体的结合明显受损（图4B）。这些结果表明sNASPc通过其H3αN -和α3结合位点与H3 - H4二聚体结合，这两个结合位点分别位于sNASPc TPR结构域的凸侧和凹侧。由于sNASPc不包含TPR2基序中的酸性区域，我们构建了一个包含酸性区域的sNASP（30-340）。与sNASPc类似，GST标记的sNASP (30-340) EWD3A + EYL3A （H3αN -和α3-结合缺陷）几乎完全失去与H3 - H4二聚体的结合，进一步支持酸性区域不影响体外组蛋白结合。综上所述，我们的结果支持sNASP上的H3αN -和α3结合位点是体外H3 - H4二聚体的主要相互作用位点。

典型的H3 -H4二聚体结构/折叠叠加在sNASPc结合的H3 α3-螺旋上显示出大量的空间位挡（图4C），表明sNASP的H3 α3结合模式与核小体结构中观察到的典型组蛋白折叠构象的H3 - H4二聚体不兼容。这表明H3 α3螺旋将脱离组蛋白折叠以释放空间位阻。与这一观点一致的是，GST-sNASPc EWD3A突变体保持了α3结合模式，在下拉区保留的H3多于H4（图4A）。因此，sNASP的H3 α3结合模式可能能够在体外破坏H3 - H4二聚体的稳定性，反映出单独结合H3或部分折叠的H3 - H4二聚体的倾向。sNASPc二聚体- H3 - H4复合物的SEC-MALS分析显示为2:2:2的复合物和一些高阶复合物（补充图S8E），而sNASPc单体- H3 - H4复合物的SEC-MALS分析仅显示为1:1:1的复合物（补充图S8F）。这些2:2:2和1:1:1的复合物之前也被观察到。这表明sNASP二聚体和单体可以分别参与两个和一个H3 - H4二聚体，其中H3 α3螺旋可能从组蛋白折叠中展开。然而，需要更多的结构研究来充分揭示这些2:2:2和1:1:1 sNASP复合物中H3-H4二聚体的构象。

为了解决这两种结合模式的保守性，我们用青蛙（X. laevis） NASP.S（也称为N1/N2）进行了下拉，它是sNASP的同源物，参与爪蟾卵母细胞中H3-H4二聚体的储存。这表明H3αN -和α3-结合位点在蛙的NASP.S中是保守的（图4D）。有趣的是，尽管sNASPc和出芽酵母同源物Hif1p的结构看起来很相似，总体rmsd为2.38Å，但Hif1p的H3αN -和α3-结合模式并不保守，正如之前对H3 α3 -结合位点提出的那样。综上所述，这些结果提示了一个相互作用模型，sNASP利用其H3αN -和α3 -结合位点在体外与H3 - H4二聚体相互作用。如果H3 α3-结合位点参与了复合物的形成，sNASP与H3 - H4二聚体结合，H3 α3螺旋从组蛋白折叠中展开。这种双H3αN -和α3-结合模式也可能与蛙的NASP. S蛋白（也称为N1/N2）储存H3 - H4有关。

为了测试H3αN -和α3结合模式对体内sNASP伴侣功能的重要性，我们对HeLa S3细胞中条件表达sNASP- Strep - HA wt和突变体的sNASP复合物进行了共免疫沉淀分析（图4E）。我们重点研究了ASF1 （a和b）和组蛋白乙酰转移酶HAT1，它们通过与组蛋白相互结合与sNASP形成共伴侣复合物。与sNASP wt相比，EWD3A突变体失去了与组蛋白H3和H4、ASF1 （a和b）和HAT1的结合（图4E）。相比之下，EYL3A突变体只是适度减少了H3和H4的结合，但没有消除与ASF1或HAT1结合的共伴随（图4E）。这些结果验证了我们通过结构分析确定的两种独立的H3结合模式，并表明与H3 N区的相互作用代表了细胞中sNASP的主要H3 - H4结合模式，以及与ASF1 （a和b）和HAT1的共伴侣复合物所采用的模式。虽然sNASP与H3 α3区域的相互作用与ASF1 （a和b）与该位点的相互结合不相容，但这种相互作用可能在组蛋白交接事件中发挥作用，其中ASF1 （a和b）可能通过与H4 C -末端的相互作用短暂地与H3 - H4二聚体结合。

综上所述，我们的研究结果证实了sNASP的双重H3αN -和α3-结合模式在体外和体内的重要性，认为它们同时在核小体组装链中陪伴H3和H4。

图4 sNASPc与H3-H4二聚体的相互作用

5、NASP H3αN -和α3-结合在体内的功能意义

在细胞周期中，NASP对于维持组蛋白H3-H4的可溶池至关重要。为了研究H3αN -和α3-结合模式在这一功能中的作用，我们通过将降解标签（dTAG, FKBP12^F36V）整合到具有两个NASP等位基因的框架中，生成了有条件表达NASP的人HCT116细胞。在此背景下，我们有条件地表达sNASP-Strep-HA wt和组蛋白结合突变体。添加dTAG-13分子可以有效和稳定地去除内源性s-和t-NASP亚型，通过全细胞提取物的western blot（图5A）和免疫荧光证明了这一点。根据先前的结果，NASP的缺失减少了可溶性组蛋白H3-H4的数量（图5B，C），但对细胞周期进程和细胞增殖没有显著影响。为了测量可溶性组蛋白池，我们分别量化了组蛋白H3和H4的水平，以及H4在赖氨酸5上的乙酰化（H4K5ac），这是HAT1在新合成的组蛋白上引入的一种修饰。在dTAG-13分子处理的NASP-dTAG细胞中，条件表达sNASP wt挽救了可溶性组蛋白池（图5C，D），表明维持可溶性组蛋白池并不需要tNASP。H3 N结合突变体（EWD3A）未能挽救NASP-dTAG细胞中H3、H4和H4K5ac的水平（图5C，D），表明与H3αN区域的结合对于sNASP伴侣蛋白维持可溶性组蛋白H3 - H4库的功能至关重要。有趣的是，sNASP EYL3A有效地挽救了H4和H4K5ac的水平，但仅部分恢复了H3的水平。综上所述，与我们的结构和生化结果一致，这些数据表明H3αN结合模式是sNASP主要用于陪伴H3 - H4组蛋白库的模式，而H3 α3结合模式在调节H3代谢方面具有更具体的作用。

图5 在表达NASP-FKBP12^F36v（NASP- dTAG）或对照细胞（−）的HCTT16细胞的全细胞提取物中，NASP通过伴随H3αN来维持可溶性组蛋白

总之，通过对sNASP的结构和功能特征及其与组蛋白底物的相互作用，我们揭示了NASP作为H3-H4主要伴侣的分子基础。综上所述，本研究支持NASP通过H3αN结合模式与ASF1一起陪伴H3 - H4，维持可溶性组蛋白H3 - H4的供应。此外，我们的数据与模型一致，即主要作用于组蛋白供应链上游的NASP，通过其H3 - α3结合模式，与单体H3和部分折叠的H3 - H4相结合，正如生化数据所揭示的那样。

我们的结构基于sNASPc结构，包含sNASP的核心。由于tNASP与sNASP的不同之处在于在酸性区域有一个插入（图1A），因此sNASPc的结构很可能是sNASP和tNASP的代表。我们还注意到，在癌细胞中H3-H4的陪伴中没有对tNASP的特定要求，这与大多数缺乏这种亚型的体细胞一致。除了富含D/E残基外，酸性区域在物种间没有任何保守基序。我们发现NASP与组蛋白H3和H4的相互作用采用双结合模式，而NASP的酸性区域并不是这种相互作用所必需的。有趣的是，据报道，NASP的酸性区域是与连接蛋白H1相互作用所必需的，但NASP如何陪伴H1的结构基础仍然未知。

据报道，NASP在体外形成单体和二聚体。我们的sNASPc结构表明，NASP通过长α89螺旋形成一个区域交换二聚体。至少在脊椎动物中，参与二聚化的残基大多是保守的。一致地的是，我们观察到重组青蛙NASP.S（也称为N1/N2）在溶液中既可以形成单体，也可以形成二聚体。我们还发现，在人类细胞中，sNASP可以与tNASP同二聚，甚至异二聚。这表明sNASP和tNASP可能在组蛋白供应中共同作用，尽管我们注意到我们的共免疫沉淀表明细胞中NASP同源和异源二聚体并不丰富。NASP二聚化在体内的功能意义尚不清楚。虽然我们已经证明NASP在体外和体内结合组蛋白的能力并不需要二聚化，但我们假设它通过将组蛋白（H3单体或部分折叠的H3 -H4二聚体）和HSP90桥接在一起，在组蛋白的早期折叠中起作用。在这种情况下，tNASP二聚体的一个原聚体可能含有组蛋白H3或部分折叠的H3 - H4，而另一个原聚体可能作为共伴侣结合到HSP90上，从而促进H3 - H4二聚体的折叠（和二聚化）。我们还阐明了在sNASPc-H3-H4-ASF1b共伴侣复合物的背景下获得的NASP“单体”结构。NASP二聚体和单体的转变涉及长α89螺旋向α8螺旋和α9盖螺旋的转变。我们设想二聚体和单体之间的这种转变可能对不同细胞背景下NASP与不同组蛋白底物的相互作用有反应。本研究中描述的sNASPc 6E突变体破坏sNASP二聚体的形成，并通过H3αN结合模式维持组蛋白结合，尽管其构象与野生型sNASPc单体不同。因此，该突变体为探索NASP二聚化在组蛋白供应中的功能意义提供了工具。

我们的研究提供了NASP的H3 α3-和αN-双结合模式的分子决定因素，其中前者先前通过核磁共振分析提出。结构和生化结果表明，NASP的H3 α3-和αN-结合模式都参与了与H3 - H4二聚体的结合，并且NASP的H3 αN-结合模式参与了体外与ASF1的伴侣分子复合物的形成（a和b）。在没有ASF1的情况下，尚不清楚一个NASP分子上的αN-和α3-结合位点是否与同一H3-H4二聚体结合，还是与两种不同的H3-H4二聚体结合。虽然我们更倾向于前者，但NASP与部分折叠的H3-H4二聚体的配合物的晶体结构可以帮助解决这个问题。有趣的是，在没有H3结合的情况下，sNASPc和青蛙的NASP.Sc在下拉过程中保留的H3多于H4。一种可能的解释是，NASP的H3 α3结合模式可能会在体外破坏H3 - H4二聚体的稳定性，而H3 αN结合模式则会在体外稳定H3 - H4二聚体。αN结合模式的破坏会将平衡转变为H3 - H4二聚体的不稳定，这就解释了为什么这种突变体比H4更有效地保留了H3。或者，它可能通过α3-螺旋结合模式反映与H3单体的结合。我们的细胞数据显示，H3 αN结合模式是NASP的主要H3 - H4结合模式，也是ASF1 （a和b）和HAT1在体内的共伴侣复合物所采用的模式。因此，在体内，H3 α3结合模式似乎在陪伴主要的H3 - H4库方面作用有限。然而，在组蛋白供应链中，NASP与H3 α3的结合可能在NASP和ASF1之间的组蛋白切换事件中起重要作用，其中H3 α3螺旋可以在两个伴侣蛋白之间短暂交换。此外，H3 α3的结合模式与NASP在H3 - H4二聚体折叠早期的功能非常吻合，NASP将保持H3 α3，这可能使H3 α2区域处于良好的构型，以便与H4配对。有趣的是，RbAp46以一种与组蛋白折叠形成不相容的方式结合到H4的α1螺旋上，并被认为将H4的α1螺旋与H3-H4核心分离。因此，由NASP - H3-H4 - RbAp46组成的复合物可能在H3-H4合成后早期，ASF1结合之前发挥重要作用。几种蛋白参与组蛋白H3和H4的折叠，包括新发现的组蛋白伴侣DNAJC9和分子伴侣HSC70和HSP90。因此，在我们的实验中，当NASP缺乏与H3 α3区的结合时，这些伴侣蛋白可能会补偿NASP的功能。有趣的是，在我们的互补实验中，H3 α3结合缺陷突变体EYL3A挽救了H4/H4K5ac水平，而仅部分挽救了H3水平。这是Apta-Smith等人提出的可溶部分中H3部分以单体形式存在的新证据。然而，我们发现H3 αN结合模式是NASP主要用于维持细胞中H3 - H4二聚体池的模式，这意味着NASP屏蔽H3 αN端（特别是αN区）对于保护组蛋白不被降解是必要的。保护可溶性组蛋白库不需要ASF1的功能，这强调屏蔽αN区而不是与ASF1共同陪伴对于防止降解至关重要。这表明自由组蛋白H3尾部可能是降解或诱导不稳定的信号。在缺乏NASP的情况下，可溶性H3和H4通过伴侣蛋白介导的自噬降解。可溶性组蛋白池主要由新合成的组蛋白组成，只有少量来自驱逐组蛋白或旧组蛋白，它们携带不同的PTMs组。然而，在DNA损伤和转录之后，被驱逐组蛋白的比例可能在局部增加，目前尚不清楚它们是否也由NASP陪同并重新并入染色质中。探索H3尾部的PTMs是否会影响其与NASP的相互作用，从而影响被逐出的H3 - H4二聚体的稳定性，将是一件有趣的事情。例如，H3 Tyr54的磷酸化（在高等真核生物中保守的残基）预计会破坏NASP的αN结合模式，从而可能诱导H3 -H4二聚体降解。这项研究可以深入了解携带不同H3尾部PTMs的新组蛋白和被驱逐的旧组蛋白是否由不同的组蛋白代谢途径处理。

这与一篇发表于《基因与发育》杂志上，关于NASP二聚体结构和NASP与ASF1和组蛋白H3-H4复合物的研究结果总体上是一致的。