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摘要
生物体需要对缺氧做出反应以维持氧稳态。研究人员鉴定出一种被认定为半胱胺双加氧酶（ADO）的硫醇氧化酶，它是低氧亲和力的氨基末端半胱氨酸双加氧酶，通过人细胞中的 N--末端规则途径转导蛋白质的氧调节稳定性。ADO 能催化氨基末端半胱氨酸转化为半胱氨酸亚磺酸，与植物半胱氨酸氧化酶功能相关，都能介导对缺氧的反应。在人细胞中，ADO 可调节 RGS4/5 等 N--degron 底物，调节 G 蛋白偶联的钙离子信号和丝裂原活化蛋白激酶活性，其活性还涉及其他 N--半胱氨酸蛋白如白细胞介素 --32。多细胞真核生物中这种保守的酶促氧传感器的鉴定，为理解和靶向缺氧适应性反应开辟了途径。
背景介绍
氧稳态对于绝大多数的生命形式而言都有着至关重要的意义。它在各种生命活动中扮演着关键的角色，是维持生命正常运转不可或缺的因素。并且，在大多数人类疾病当中，氧稳态都遭到了不同程度的破坏。这种破坏可能会进一步加重疾病的发展进程，对人体健康产生严重的负面影响。先前的研究确定了缺氧诱导因子（HIF）脯氨酰羟化酶作为人类氧传感器。这些酶是低氧亲和力、依赖2-氧代戊二酸（2-OG）的双加氧酶，它们催化转录因子HIF的反式-4-脯氨酰羟化，使其成为蛋白酶解的靶标。通过这个过程，这些羟化酶调节对缺氧的广泛转录反应。尽管HIF的脯氨酰羟化作为一种信号机制是前所未有的，但后续研究揭示了不同的酶促蛋白质氧化系统，这些系统在所有四个真核生物界的代表中都能发出缺氧信号。在每个系统中，蛋白质氧化事件都与蛋白质降解相关。
值得特别注意的是 N - 末端规则（N-degron）途径当中的 Cys 分支。这一分支在整个 N - 末端规则途径中具有重要的地位和作用。它可能会对蛋白质的稳定性、降解以及生物学功能产生显著的影响。同时，深入研究这一 Cys 分支有助于我们更好地理解 N - 末端规则途径的运行机制和生物学意义。在蛋氨酸氨肽酶作用之后，N-末端半胱氨酸的氧化为精氨酰转移酶创造了一个底物，精氨酰转移酶催化添加这个N-末端不稳定残基，促进降解。虽然未定义半胱氨酸修饰酶，但已有研究证明，N-末端半胱氨酸氧化受一氧化氮影响。并且，根据体外研究，该氧化过程被认为可能是非酶促的。随后，在植物中表明N-末端规则途径的Cys分支控制乙烯反应转录因子（ERF-VII）的稳定性。在拟南芥中的进一步研究表明，半胱氨酸氧化由一系列植物半胱氨酸氧化酶（PCOs）催化。这些酶作为氧传感器，指导缺氧适应。这些发现促使我们进一步研究动物中 N -末端半胱氨酸氧化的机制。
结果分析
1、人细胞中植物和动物N - degron底物受氧调节的研究及相关蛋白反应实验
首先测试了HIF脯氨酰羟化酶抑制剂对其他物质的特异性。转染细胞暴露于缺氧及二吡啶基后，RAP1 - 50:GFP:V5报告蛋白积累，C2A突变体不积累，不影响转录水平。非特异性2 - OG双加氧酶抑制剂或HIF脯氨酰羟化酶抑制剂不能激活报告基因，却能诱导HIF（图1A）。细胞缺氧16小时后用环己酰亚胺处理，缺氧使报告蛋白半衰期延长（图1B），表明人细胞中存在不同于HIF脯氨酰羟化酶的铁和氧依赖活性，且依赖于第2位半胱氨酸作用于植物RAP2.12氨基酸序列。对RKO细胞实验，暴露于缺氧和二吡啶基时野生型RGS4和RGS4:GFP融合蛋白积累，突变型不积累（图1C）。人神经母细胞瘤SH - SY5Y细胞中内源性RGS4和RGS5蛋白反应相同（图1D）。在一系列细胞中研究RGS蛋白对分级缺氧的反应，生理缺氧下RGS4或RGS5蛋白逐渐积累（图1E），变化在蛋白质水平而非mRNA水平（除SH - SY5Y细胞中的RGS4），植物和人报告蛋白及内源性RGS蛋白受类似调节，人细胞可能用类似PCOs的酶调节稳定性。
图 1. 人细胞中氧对植物和动物 N - 末端规则（N - degron）底物的调节
2、ADO 在不同细胞中的作用及对相关蛋白的影响研究
人类基因组涵盖两种硫醇双加氧酶，其预测结构与PCOs（即半胱氨酸双加氧酶（CDO1）以及先前被认定为半胱胺（2-氨基乙硫醇）双加氧酶（ADO））类似。将编码上述酶类以及PCO1的基因与编码RGS4:HA的基因共同转染至人胚胎肾293T细胞。过表达的ADO以依赖于第2位半胱氨酸的方式对RGS4:HA的缺氧诱导予以抑制（图2A）。
接下来，运用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术在SH-SY5Y和RKO细胞中使ADO和CDO1失活。ADO的失活致使内源性以及转染的RGS4和RGS5蛋白无论氧含量水平如何均呈组成性地上调（图2B）。
在SH-SY5Y细胞中，使在N-末端规则途径中所提出的半胱氨酸氧化下游起作用的精氨酰转移酶ATE-1失活。在ATE1和ADO缺陷细胞中RGS5的上调相似，并且在ATE1缺陷细胞中ADO的过表达不能抑制RGS5（图2C）。因此，ADO是RGS蛋白氧依赖降解所必需的。这种活性依赖于ATE1的完整性，这与ADO在N-末端规则途径中位于ATE1上游的作用一致。
为确定 ADO 能否弥补植物中缺陷的 PCO，通过杂交产生了 PCO 耗尽的拟南芥突变体。其中四个已知的 PCO 基因通过转移 DNA 插入诱变失活，纯合的四重 pco1/2/4/5（4pco）突变体植物有严重发育缺陷且在有氧条件下上调缺氧响应基因（图2D），而三重 pco1/2/4（3pco）突变体植物无此现象。当把人 ADO（而非 CDO1）在 PCO1 启动子控制下引入 4pco 植物中时，空气中厌氧基因的组成性上调被纠正，植物正常发育（图2D和E）。
为了确定是否缺乏一种类似ADO的酶可能是酵母中与N-半胱氨酸相关的稳定性的原因，我们将ADO或CDO1引入酵母细胞，同时引入一个比率报告基因，在这个报告基因中，RAP2.12-萤火虫荧光素酶融合蛋白或一个C2A突变体的活性以海肾荧光素酶为参照进行归一化。人ADO的表达降低了RAP2-28-FLuc蛋白的活性，并赋予其缺氧调节能力，但对C2A突变体没有影响（图2F）。
图 2. ADO 控制 N - 末端规则（N - degron）途径的氧依赖型 Cys 分支
3、ADO 催化 N - 末端半胱氨酸双加氧作用的验证及相关特性研究
交叉互补表明ADO催化是一种类似于PCOs所催化的N - 末端半胱氨酸双加氧形式。为了测试这一点，在大肠杆菌中生产重组人ADO和CDO1，使这些酶与对应于人RGS4和RGS5的第2到15位残基的合成肽反应，并通过质谱检查产物。发现肽段被ADO修饰，质量增加了 + 32 Da，但不被CDO1修饰（图3A），并且这种修饰在厌氧条件下被抑制（图3B）。
为了确认双加氧作用，我们在18O2气氛中或在18O标记的水H218O存在下进行反应。这些实验表明在18O2中质量增加了 + 36 Da，在18O 标记的水存在下质量增加了 + 32 Da，这表明两个氧原子直接从分子氧中被掺入到肽段中，从而确认了双加氧作用（图3B）。因此，人ADO催化RGS4和RGS5中N - 半胱氨酸残基的双加氧作用，使其转化为半胱氨酸亚磺酸。
对人ADO的动力学测量（图3C）表明，在大气条件下，对RGS4和RGS5肽段的周转数值分别为20.1和16.9 s⁻¹，但对氧有明显的敏感性。因此，ADO类似于HIF脯氨酰羟化酶，表现出KMO2明显高于生理范围，这一特性可能是其在氧稳态中作用的基础。
图3. ADO催化RGS4/5肽的N-末端半胱氨酸的双加氧作用。
4、ADO对G蛋白信号调节的作用机制及相关实验验证
RGS4 与 RGS5 通过增强 Ga 偶联的鸟苷 -5′-三磷酸水解来调节异源三聚体 G 蛋白信号，从而减弱 G 蛋白信号。鉴于 ADO 的催化活性降低了 RGS4 与 RGS5 的水平，在这些蛋白水平增加的 ADO 缺陷细胞中，相关途径上理应呈现出 G 蛋白信号的减弱。Ga 蛋白能够调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的活性。与此相符，因精氨酰转移酶 ATE1 缺失而导致 N-末端规则途径存在缺陷的小鼠细胞及胚胎已被证实表现出 MAPK 激酶激活减少。因此，测定 ADO 缺陷的 SH-SY5Y 细胞中 MAPK（p44/p42）的磷酸化（图 4A）。此类实验表明，ADO 缺陷的 SH-SY5Y 细胞中磷酸化的 MAPK 水平降低，与 ATE1 缺陷的 SH-SY5Y 细胞中磷酸化的 p44/p42 水平相近。在 ADO 敲除（KO）细胞中，而非 ATE1-KO 细胞中，表达 ADO 可逆转磷酸化的 p44/p42 的减少（图 4B）。
为测试 ADO 对特定 G 蛋白偶联激动剂反应的影响，我们对卡巴胆碱进行研究。卡巴胆碱作为一种胆碱能激动剂，毒蕈碱受体通过 Gαq 与细胞内 Ca²⁺的调节偶联。在 ADO 缺陷细胞中观测到对卡巴胆碱反应的 Ca²⁺动员减弱（图 4C），但对受体非依赖性离子载体离子霉素无此现象（图 4D），且通过 ADO 的重新表达可逆转此种减弱。鉴于 RGS 蛋白与 G 蛋白信号通路之间相互作用的复杂性，我们无法确定这些效应完全是由 ADO 对 RGS4 和 RGS5 蛋白的影响所引发。然而，此项研究确定了 ADO 在 G 蛋白信号调节中的作用，这与其在调节 RGS 蛋白的 N-末端规则途径中作为半胱氨酸修饰酶的作用相一致。
图4. ADO调节G蛋白信号传导
5、ADO介导的人类蛋白质氧依赖性调节范围探究
为确定 ADO 所介导的人类蛋白质氧依赖性调节是否超出已明确的 RGS 蛋白范畴，首先促使重组 ADO 与一系列源自预测会经加工以生成 N - 半胱氨酸多肽的蛋白质的不同肽段进行反应，随后通过质谱对双加氧作用（质量增加 +32 Da）予以测量。此项实验揭示出 ADO 的底物依赖性催化活性范围自近乎零至与采用 RGS5 肽的实验中相近的水平。接着，运用现有抗体对与支持高白介素 - 32（图 5A）或低天冬酰胺合成酶以及 JunB 的 ADO 催化双加氧作用的肽底物相对应的内源性蛋白质水平予以查验。
上述实验在先前构建的 ADO 缺陷型 RKO 细胞中展开，原因在于 SH - SY5Y 细胞中未检测到白介素 - 32。免疫印迹显示，在缺氧细胞中白介素 - 32 的丰度有所增加，但 ASNS 或 JunB 并未增加，在 ADO 缺陷型细胞中白介素 - 32 呈组成性积累，且通过转染 ADO 的重新表达而减少（图 5B）。在野生型和 ADO 缺陷型 RKO 细胞中进行的实验证实了白介素 - 32 在蛋白质水平而非 mRNA 水平上受到调节（图 5C）。进一步的实验确认了白介素 - 32 肽与重组 ADO 反应后 N - 末端半胱氨酸的双加氧作用，并表明该残基对于 ADO 介导的对细胞中共转染的白介素 - 32 的抑制是必需的（图 5D）。
图5. 白介素-32（IL-32）是ADO催化的N-末端半胱氨酸双加氧作用的靶标。
这些研究发现 ADO 的靶蛋白超越了 RGS 蛋白范畴，确定人 IL - 32 为其中一种蛋白。所测试的肽段仅为细胞中可能生成的 N - 半胱氨酸多肽的极小部分，可能存在其他受 ADO 调控的人类目标。转录调节因子和多梳抑制复合物的一个组成部分在植物中被认定为 N - 末端规则途径 Cys 分支新的氧调控目标。由于 N - 末端规则调节的复杂性，其他进程可能与 ADO 催化的双加氧作用竞争，不能假定分离肽上的高水平 ADO 催化能预测 ADO 的生理调节或所有蛋白质都通过相同下游途径调节。将人 ADO 鉴定为酶促的人类氧传感器，为理解缺氧反应开辟新路径。
讨论
ADO 与 PCO 作为人类和植物氧传感器的保守性，与它们已知底物缺乏保守性以及动植物所面临的不同氧稳态挑战形成鲜明对比。于植物而言，ERF-VII 途径主导对缺氧的转录反应，此过程需一定时间使转录输出参与适应性反应。在动物细胞中，调节对缺氧转录反应的主要进程为 HIF 的脯氨酰羟化。相较之下，ADO 直接作用于信号分子的蛋白质稳定性，相较于 HIF 的转录输出所介导的反应，其更有可能快速传导对缺氧的反应。RGS4 与 RGS5 因对心血管系统及血管生成的影响而涉及哺乳动物的氧稳态。IL-32 作为一种非典型细胞因子，可调节促炎细胞因子网络及血管生成生长因子。尽管本研究发现ADO是这些蛋白对缺氧反应的重要调节剂，然而 RGS4、RGS5 以及 IL-32 均被报道为 HIF 的转录目标。与所报道的 HIF 对 RGS4 的细胞类型特异性调节相一致，本研究观察到在 SH-SY5Y 细胞中，缺氧可诱导 RGS4mRNA，但在其他细胞中则无此现象。这些发现预示着在特定的细胞环境中，当两个系统均发挥作用时，ADO 与 HIF 脯氨酰羟化酶系统将相互作用，以产生对缺氧的生理反应。综上所述，本研究界定了一种酶促人类氧传感器，其在生理上很可能比 HIF 脯氨酰羟化酶传导的转录更为重要。
