营养物质在调节TFE3和MITF蛋白稳定性过程中发挥核心作用

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TFE3和MITF是调节溶酶体、黑素细胞和自噬基因来维持代谢稳态的主要转录因子。氨基酸通过Rag GTPase促进TFE3和MITF募集到溶酶体表面，激活进化过程中保守的磷酸化降解，导致CUL1^β-TrCP泛素化和降解，严重神经发育综合征和肾癌两种不同的病理集中在营养物质对蛋白质稳定性调节的丧失上。

选择性蛋白质降解是实现基因表达调控的关键机制。许多重要的发育、肿瘤抑制、细胞周期调节和信号转导介质都是选择性降解的靶标，因此破坏这一过程可导致广泛的人类疾病，执行广泛转录程序的一个关键策略是选择性地调整转录因子的含量。当多泛素链通过泛素激活酶(E1)、Ub结合酶(E2)和Ub连接酶(E3)的顺序作用结合到蛋白质底物上时，最后通过26S蛋白酶体降解。超过600个E3连接酶通过识别作为降解信号的氨基酸短的序列(degrons)赋予底物特异性。关键的转录因子，如HIF2α、NRF2和MYC是选择性降解的靶点，这种调节对生理和病理都很重要。然而，许多其他转录因子是否以及如何选择性地靶向蛋白质降解还没有在蛋白质组水平上系统地探索。在这里，作者利用一种无偏倚的、高通量测序的方法来定量人类细胞中的蛋白质稳定性，鉴定出Cullin-RING连接酶(CRLs)靶向蛋白质降解的转录因子，该家族包含所有E3连接酶的三分之一。

作者发现TFE3和MITF是非常不稳定的蛋白质。它们与TFEB和TFEC一起组成了MiT/TFE家族，他们的基本结构为螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链，它们以同二聚体或异二聚体的形式与DNA结合，在维持细胞能量稳态中起着至关重要的作用。MITF通过结合存在于色素沉着基因启动子区域的M-box序列，作为黑素细胞存活和分化以及黑素小体生物发生的主要调节因子。相反，TFE3和TFEB通过结合一种被称为协调溶酶体表达和调节的CLEAR元件的修饰E-box，作为溶酶体生物发生和自噬的主要调节剂。TFE3的错义突变和基因组重排分别导致严重的神经发育综合征和肾癌，这一事实强调了其生理重要性。尽管TFE3和MITF在健康和疾病中具有明确的作用，但它们的上游调控以及这些病理的分子基础仍然难以捉摸。

先前的研究确定了必需营养感应Rag GTPase-mTORC1通路在调控MiT/TFE家族中的作用。这些因子通过与活跃的Rag GTPase相互作用，在氨基酸存在的情况下被招募到溶酶体表面，导致mTORC1磷酸化，这是一种激酶复合物，起着细胞生长的主要调节作用。这一磷酸化事件为14-3-3伴侣蛋白创造了一个结合位点，将转录因子隔离在细胞质中。目前的文献假设14-3-3介导的保留是抑制转录活性的关键事件,MiT/TFE家族在细胞和组织水平上的重要性促使我们研究TFE3和MITF如何以及为什么受到蛋白质降解途径的有效调节。

这项工作描述了一种称为高通量定量全体蛋白质稳定性的方法，这是一种慢病毒荧光报告系统，将DsRed编码为内参，然后将GFP与目的蛋白融合。通过流式细胞术定量GFP/DsRed的比例来确定融合蛋白的相对稳定性(图1A)。我们之前在GPS载体(GPS ORFeome)中建立了一个包含约15,000个人类ORF的文库，可用于在蛋白质组水平上评估蛋白质稳定性的变化，我们对GPS ORFeome文库在Cullin-RING连接酶激活的有效特异性抑制剂MLN4924存在和不存在的情况下进行筛选，以确定CRLs如何在蛋白质组水平上调节转录因子的稳定性(图1A)。在MLN4924治疗后，多种已知由CRL规范调节的转录因子(包括HIF2α和MYC)表现出显著的稳定性。由于生理和病理的重要性，我们重点研究了TFE3和MITF。

为了验证GPS ORFeome筛选的结果，使用慢病毒GPS系统在N端用GFP标记TFE3、TFEB和MITF的三个变体，并在HEK-293T细胞中表达。用MLN4924处理可显著增加TFE3和最长的、普遍表达的MITF异构体(MITF- A，变体1)的稳定性，而TFEB和MITF的两个较短的、组织特异性的变体(MITF- M和MITF-5)没有变化，图1C)。然后使用经过验证的抗体进行免疫印迹，以检查相应的内源性蛋白是否受到类似的影响。添加MLN4924后，TFE3和MITF的稳定性均显著增加，但不会影响它们的mRNA表达或mTORC1信号，而TFEB没有明显变化(图1D)。

图1 GPS ORFome筛选将TFE3和MITF-A识别为特定的Cullin底物

Cullin- RING连接酶是由几种Cullin组合成的模块化蛋白质复合物，每种异构体都利用一组独特的底物受体蛋白直接将底物传递给Cullin进行泛素化。为了确定哪一种Cullin负责降解，在携带GPS TFE3报告基因的HEK-293T细胞中表达了个体显性阴性Cullin蛋白，只有显性阴性CUL1增加了TFE3(图1E)和MITF-A(图1F)的稳定性;因此，推测TFE3和MITF-A是 CUL1的底物。

CUL1利用SKP1募集一组69个独特的F-box底物受体蛋白，为泛素化提供底物。作者使用一个靶向泛素-蛋白酶体系统相关基因的引导RNA文库进行了CRISPR-Cas9筛选，以发现假定的F-box底物受体(图2A)。正如预期的那样，该筛选中得分最高的基因是CUL1和SKP1, NEDDylation机制和许多蛋白酶体亚基(图2B)，得分最高的基因是β-TrCP2，它与其平行的β-TrCP1识别相同的磷酸化degron。

为了验证筛选结果，使用了三种不同的siRNA来敲低两种β-TrCP相似物。β-TrCP1的缺失不能稳定TFE3或MITF-A；然而，β-TrCP2的缺失确实稳定了两个转录因子，β-TrCP1/2的双重缺失导致了进一步的稳定 (图2C)。此外，对flag标记的TFE3和MITF-A进行免疫共沉淀，发现它们与内源性β-TrCP1有很强的相互作用(图2D)。flag标记的β-TrCP1/2的免疫共沉淀显示与内源性TFE3和MITF-A，而不是TFEB有很强的相互作用，这与后者缺乏CUL1^β-TrCP1/2的调节一致(图2E)。此外，β-TrCP1底物识别WD40结构域中的关键残基突变会消除与TFE3和MITF-A的相互作用(图2F)。总之，这些结果表明TFE3和MITF-A是CUL1β-TrCP1/2降解的靶点。

图2 TFE3和MITF-A被CUL1β-TrCP1/2靶向蛋白酶体降解

作者比对了MiT/TFE家族成员的氨基酸序列，以确定TFE3和MITF-A是否含有类似于共同的β-TrCP1/2 degron。事实上，TFE3和MITF-A，而不是TFEB或黑色素细胞MITF-M，在它们的N端附近含有ESGIVxD序列(图3A)。虽然对附近残基的诱变作用很小，但在这个假定的degron内替换残基强烈地稳定了两个转录因子，并且在添加MLN4924后没有观察到进一步的稳定(图3B)。

β- trcp1 /2介导的含有丝氨酸或苏氨酸残基的degron的识别需要它们的磷酸化，因此，假设ESGIVxD序列被磷酸化，并且这种修饰是CUL1^β-TrCP1/2使TFE3和MITF-A泛素化所必需的。为了确定丝氨酸残基是否被磷酸化，用MLN4924处理HEK-293T细胞，免疫沉淀flag标记的TFE3和MITF-A，通过flag ip富集更多的TFE3和MITF-A，最后通过质谱鉴定。对MITF-A和TFE3磷酸化的分析表明，肽AGTMQSESGIVPDFEVGEEFHEEPK中的丝氨酸(下划线)被磷酸化(图3C)。因此，TFE3 (S47)和MITF-A (S5)在细胞中被磷酸化。

为了确定磷酸化是否介导β-TrCP1/2和转录因子之间的相互作用，我们合成了生物素化的合成肽，这些合成肽有丝氨酸磷酸化和没有丝氨酸磷酸化。我们使用表达flag标记β-TrCP1/2的细胞裂解物进行pull down实验。值得注意的是，只有磷酸化形式的TFE3和MITF-A肽与β-TrCP1/2相互作用(图3D)。此外，在体外使用重组的NEDDyated CUL1^β-TrCP2复合物，只有降解肽的磷酸化形式被泛素化，使用生物素阻断C端赖氨酸残基可以消除磷酸化肽的泛素化(图3E)。

在TFE3和MITF-A中分别突变S47和S5，完全消除了与内源性β-TrCP1的相互作用(图3F)。为了直接测试磷酸化对于泛素化是否必要，使用基因组编码的大肠杆菌有机体分离全长天然和脱格子磷酸化(pS5)-MITF-A，其中包含磷酸丝氨酸代替UAG停止密码子，在体外，仅当丝氨酸残基选择性磷酸化时，重组的NEDDylated CUL1^β-TrCP2复合物才能迅速使MITF-A泛素化(图3G)。在从黑腹果蝇和水螅到人类的进化过程中，TFE3和MITF-A中的β-TrCP1/2蛋白高度保守，这表明这一新发现的降解途径可能对后生动物生理学很重要(图3H)。因此，TFE3和MITF-A需要在保守的degron内磷酸化单个丝氨酸残基，才能与CUL1β-TrCP1/2相互作用并被CUL1^β-TrCP1/2泛素化。

图3 TFE3和MITF-a中保守的degron磷酸化是CUL1β-TrCP1/2泛素化所必需的

在确定TFE3和MITF-A以磷酸化依赖的方式被CUL1^βTrCP1/2蛋白酶体降解后，接下来开始确定负责的激酶。为了做到这一点，作者重复了CRISPR- cas9筛选，以鉴定稳定TFE3和MITF-A的突变体，除了这次使用了CRISPR sgRNA的全基因组文库。令人欣慰的是，许多阳性对照被强烈富集，包括CUL1、SKP1、NEDDylation机制和许多蛋白酶体亚基。有趣的是，氨基酸传感Rag GTPases-mTORC1通路的许多组分被标记为突出的靶点(图4A)，包括mTORC1信号的调节因子，如v-ATPase亚基、FLCN-FNIP1/2、LAMTOR1-5、RagA、GATOR2复合物的组分(WDR59、WDR23和SEH1L)和mTORC1 (MTOR和RPTOR)本身。

作者使用RagA/B、RagC/D和LAMTOR1敲除(KO) HEK-293T细胞的免疫印迹结果显示，相对于野生型，RagA/B、RagC/D和LAMTOR1 KO细胞中内源性TFE3和MITF-A的稳态丰度更高(图4B)。在这些KO背景下建立了TFE3和MITF-A的GPS报告细胞，并且与野生型相比，转录因子在KO细胞中确实更加稳定(图4C)。至关重要的是，MLN4924的加入并没有进一步稳定转录因子，这表明Rag GTPases-mTORC1通路位于CUL1β-TrCP1/2降解的上游。MiT/TFE家族中的一个区域先前被证明对介导与Rag GTPases (Rag Binding Domain)的相互作用很重要，TFE3和MITF-A中该区域的缺失使其与Rag GTPases和β-TrCP1的相互作用失效，表明磷酸化缺失(图4D)。此外，Rag结合结构域的去除或其中关键残基的突变，都急剧增加了这两种转录因子的稳定性，而MLN4924的添加并没有进一步稳定转录因子突变体(图4E)。因此，这些结果支持了Rag GTPase调节cul1 β- trcp1 /2依赖性降解的假设，可能是通过在溶酶体表面募集来调节去磷酸化。

图4 活性Rag GTP酶促进CUL1β-TrCP1/2依赖性降解

接下来，作者通过mTORC1途径测试了营养物质在调节去磷酸化中的作用。氨基酸和血清饥饿或Torin1抑制mTORC1增加了内源性TFE3和MITF-A的蛋白含量(图5A)，这与蛋白质降解的减少一致，并消除了转录因子与β-TrCP1之间的相互作用(图5B)，这与降解磷酸化的减少一致。β-TrCP1/2的免疫共沉淀也表明，Torin1处理完全消除了与这两种转录因子的相互作用，进一步支持去磷酸化可能直接或间接依赖于mTORC1活性(图5C)。

鉴于MiT/TFE家族被14-3-3伴侣隔离，作者想确定它们的蛋白质降解是否依赖于它们与14-3-3的结合。先前的研究发现，分别在TFE3和MITF-A内诱变S321和S280，增加了它们的核定位，并完全消除了14-3-3伴侣蛋白对它们的保留。然而，在这些关键丝氨酸残基突变后，TFE3和MITF-A仍然不稳定，实际上这些突变体的含量低于野生型蛋白，这表明核环境比细胞质更不稳定(图5D)。因此，TFE3的降解与它在细胞核内的转运能力无关。此外，用Torin1处理TFE3 S321A细胞仍然促进了稳定性。因此，由S47 (TFE3)和S5 (MITF-A)磷酸化调控的降解途径与由S321 (TFE3)和S280 (MITF-A)磷酸化调控的14-3-3细胞质保留同时进行。

接下来，评估了TFE3和MITF-A的转录活性，以梳理新发现的降解途径如何通过14-3-3与细胞质保留相结合。将4xCLEAR或3x3 -box基序控制的双荧光素酶报告基因通过慢病毒转导稳定导入TFE3/MITF-A双KO HEK-293T细胞中，与野生型或突变型转录因子互补后测定荧光素酶的表达。用组成稳定的TFE3 S47A重组相对于野生型蛋白增加了荧光素酶的表达(图5E)。相比之下，TFE3 S321A的表达并没有上调基因表达，这与由于其不稳定性增加，其在细胞核中的水平过低而无法促进转录的可能性相一致。然而，与既难降解又14-3-3保留的双TFE3 S47A/S321A突变体互补表明，这两个突变体具有协同效应。此外，无法结合Rag GTPases导致转录活性进一步增加，这与额外的磷位点可能调节核易位的可能性一致。在MITF-A中也观察到类似的趋势(图5F)。由于荧光素酶实验利用了多个转录因子结合位点，这些位点可能无法完全代表内源性靶点，因此通过检测内源性TFE3和MITF靶基因的表达进行了类似的实验。总的来说，这些结果支持了TFE3和MITF-A的稳定对于上调下游基因转录既是必要的，也是部分充分的。

图5 控制营养物质对TFE3和MITF-A的降解抑制转录活性

Xp11.2易位性肾细胞癌(tRCC)是由通常位于Xp11.2.17染色体上的TFE3基因组重排引起的一种独特类型的肾癌。易位事件涉及TFE3内部的断点，导致致癌融合蛋白的表达，其中TFE3的C端部分与多种伙伴的N端部分融合。临床研究已经报道了许多TFE3融合伙伴，最近报道的一个病例也发现了PRC-MITF融合。在几乎所有临床报道的病例中，TFE3和MITF-A内的β-TrCP1/2 degron在易位事件中丢失(图6A)。事实上，在临床中观察到的MiT/TFE致癌融合物明显比相应的野生型转录因子更稳定(图6B)。为了测试融合蛋白的降解是否在重新引入degron后恢复，我们设计了NONO-TFE3融合，将截断的NONO融合到全长野生型或突变型TFE3中。与临床观察到的截断的NONO-TFE3相比，全长NONO-TFE3 (WT)的表达显著降低(图6C)。然而，在磷酸化degron (S47A)或Rag结合结构域(S112A/R113A)突变后，全长TFE3融合的表达水平恢复到截断的致癌NONO-TFE3的水平。因此，degron丢失是建立稳定、高表达的致癌融合蛋白的关键。

螺旋1和螺旋2是MiT/TFE家族成员与Rag GTPases相互作用所必需的。我们很好奇这两个区域是否足以与Rag GTPases结合。与GFP融合的螺旋1的免疫沉淀显示它单独不足以介导相互作用，而螺旋2单独与内源性Rag GTPases的相互作用较弱(图6G)。通过结构分析表明，在MiT/TFE家族成员中具有高度保守的α螺旋(此后称为螺旋2)(图6D)，螺旋1和螺旋2这两个螺旋在与Rag GTPase相互作用中起着必要和充分条件，表明了MiT/TFE家族成员是如何被招募到溶酶体表面的。

图6 TFE3在易位肾细胞癌中异常神经发育综合征中稳定

最后，通过结构分析作者得出结论，MiT/TFE家族成员至少部分通过与RagA的直接相互作用被招募到溶酶体表面，并且在氨基酸存在的情况下，在进化上保守的降解蛋白的丝氨酸残基上被磷酸化。

图7 MiT/TFE家族直接与RagA连接

TFE3和MITF这两个转录因子通过调节溶酶体、黑素细胞和自噬基因来维持代谢稳态。先前的研究认为，由Rag GTPases-mTORC1介导的14-3-3细胞质保留是在营养存在下抑制转录活性的关键。本文作者证明了调节蛋白质稳定性在其控制中起着基本作用。氨基酸通过Rag GTPase促进TFE3和MITF募集到溶酶体表面，激活进化上保守的磷酸化降解，导致CUL1β-TrCP泛素化和降解。阐明揭示了与RagA相互作用所需的保守α -螺旋，阐明了由RagA-TFE3界面内TFE3错义突变引起的严重神经发育综合征的分子基础。此外，在导致肾癌的TFE3基因组易位中，磷酸化degron反复丢失。因此，两种不同的病理集中在营养物质对蛋白质稳定性调节的丧失上。以上这些见解可能在开发新的疾病治疗方法中得以应用。

TFE3和MITF这两个转录因子通过调节溶酶体、黑素细胞和自噬基因来维持代谢稳态。先前的研究认为，由Rag GTPases-mTORC1介导的14-3-3细胞质保留是在营养存在下抑制转录活性的关键。本文作者证明了调节蛋白质稳定性在其控制中起着基本作用。氨基酸通过Rag GTPase促进TFE3和MITF募集到溶酶体表面，激活进化上保守的磷酸化降解，导致CUL1β-TrCP泛素化和降解。阐明揭示了与RagA相互作用所需的保守α -螺旋，阐明了由RagA-TFE3界面内TFE3错义突变引起的严重神经发育综合征的分子基础。此外，在导致肾癌的TFE3基因组易位中，磷酸化degron反复丢失。因此，两种不同的病理集中在营养物质对蛋白质稳定性调节的丧失上。以上这些见解可能在开发新的疾病治疗方法中得以应用。