2024年3月，来自安徽大学的Tianhang Lv等人在Biotechnology for Biofuels and Bioproducts上发表了一篇题为Structural insights into curdlan degradation via a glycoside hydrolase containing a disruptive carbohydrate-binding module的研究性文章。

Curdlan 是一种不溶于水的胞外多糖。它由以线性 β-1,3 构型连接的葡萄糖残基组成，由特定细菌和真菌物种自然合成。Curdlan 形成单螺旋和三螺旋结构。通过在80℃ 以上加热，凝胶多糖生成热不可逆凝胶（高凝凝胶），其主要呈现三螺旋结构。可得然胶广泛应用于食品和制药行业。然而，凝胶多糖的不溶性限制了其直接应用。其水解产物被称为 β-1,3-低聚葡萄糖 (GOS)，具有增强的水溶性，并具有改善的生物活性，例如免疫刺激、抗菌 和益生元特性。此外，GOS的聚合度（DP）影响其生物活性。因此，凝胶多糖是生产 GOS 的经济来源。

凝胶多糖的酶促降解因其环境友好的特性和高产潜力而受到广泛关注。先前记录的凝胶多糖水解酶分布在各种糖苷水解酶家族中，包括 GH16、GH50、GH64、GH81 、GH128 、 GH157和GH158。增强对三螺旋 β-1,3-葡聚糖的酶识别和裂解机制的理解将显着推动能够降解凝胶多糖的酶的分子工程。然而，糖苷水解酶如何识别并水解具有三螺旋四级结构的β-1,3-葡聚糖的机制至今仍存在争议。两个例子涉及巴氏类芽孢杆菌GH64 β-1,3-葡聚糖酶 (PbBgl64A) 和嗜盐芽孢杆菌GH81 β-1,3-葡聚糖酶 (BhGH81)，其中晶体结构显示其活性位点存在两个或三个重叠的 GOS 链三螺旋 β-1,3-葡聚糖分子中有两条独立的链。因此，这两个例子表明GHs可以识别催化槽中的整个三螺旋。最近，另一个例子提出了水解过程中的凝胶多糖解旋模型，利用分子对接研究并检查不同处理的凝胶多糖的构象以及各种 β-1,3-葡聚糖酶（包括 PbBgl64A）的水解速率。根据该提议，三螺旋凝乳胶的识别是通过与 β-1,3-葡聚糖酶的某些辅助区域的相互作用发生的，然后将凝乳胶解旋成单螺旋和双螺旋形式。然后，这些形式更适合催化腔，多糖链最终在催化腔中水解成 GOS。因此，需要更多β-1,3-葡聚糖酶催化的凝胶多糖水解的结构解释来阐明其机制。之前的工作揭示了一种来自海洋细菌Saccharophagus degradans 2-40 T的凝胶多糖特异性内切-β-1,3-葡聚糖酶 CBM6E ，其包含 N 端 GH128 模块和 C 端 CBM6 模块。CBM6E 在中间温度下表现出催化活性，可从凝胶多糖中高效生产 DP 为 3-6 的 GOS。CBM6E的CBM6模块（CBM6E-CBM6）对凝胶多糖表现出很强的特异性结合亲和力，有效增强酶对凝胶多糖的活性。这些特性使得 CBM6E 对于 GOS 的生产极具吸引力。然而，其凝胶多糖识别机制尚未阐明。此外，许多 GH128 模块与 CBM4 或 CBM6 系列的 CBM 融合。然而，串联 GH128 和 CBM 模块的结构仍然未知。

在这项研究中，解析了 CBM6E 的 apo 形式 (2.4 Å) 和与 GOS 复合 (1.28 Å) 的晶体结构。这是串联 GH128 和 CBM6 模块的第一个结构。基于复杂的结构，设计了具有增强的水解活性和不同的凝胶多糖产物谱的CBM6E突变体。此外，进行了分子对接、定点诱变、酶动力学和凝胶多糖结合测定，以确定三螺旋 β-1,3-葡聚糖的辅助结合位点，特别是在 CBM6 模块内。此外，还揭示了 CBM6 模块在破坏凝胶多糖微观结构方面的新功能，这一点通过刚果红染色和扫描电子显微镜 (SEM) 得到了证明。我们进一步进行了测定，以探讨还原端是否产生，由特定的 β-1,3-葡聚糖酶水解凝胶多糖产生的，在将破坏性 CBM6 模块预先添加到凝胶多糖底物中后被放大。

1.GH128与CBM6整体折叠  

CBM6E 的晶体结构以 2.4 Å 的分辨率测定。CBM6E 的结构包含两个不同的结构域：属于 GH128 家族的 (α/β)-桶催化结构域（残基 84-348）和属于 CBM6 的 C 端 β-夹心结构域（残基 349-473）家族（图1a）。CBM6结构域主要通过GH128结构域的α8和α9与CBM6结构域的β10和β13之间的氢键与GH128形成结构域间界面（图 1b）。值得注意的是，域间界面涉及以下残基：D86、K351、R88、Y350、N289、H369、R296、A361、S338、E359、F348 和 H362，每对形成氢键。此外，R88、F348、Y350、M288、V339 和 A379 作为三元组参与疏水相互作用（图1 c).使用ConSurf网络服务器，发现域间界面处的大部分残基在进化上是保守的。这种保守性表明 GH128 和 CBM6 作为内聚单元的折叠具有一定程度的进化稳定性。

图1.CBM6E总体结构。CBM6E的域架构。CBM6E 蛋白包含两个串联结构域：GH128 和 CBM6。SP，信号肽。b CBM6E的串联GH128和CBM6结构域的整体结构。催化 GH128 模块采用 (α/β) 桶状支架，其中 α 螺旋用洋红色表示，β 片层用青色表示。另一方面，CBM6模块采用常见的β-三明治折叠，颜色为黄色。c GH128（青色）和 CBM6（黄色）之间的域间界面。参与在两个域之间形成接触的残基使用棒表示来表示。氢键（用虚线表示）是在距离小于 3.5 Å 的特定残基之间形成的。

克隆了该结构域(180-643 aa)，并进行了侧链表达loop。纯化后的蛋白在SDS-PAGE上显示为单条带。SDS-PAGE上57 kDa的表观Mw(图2)与52.57 kDa的理论Mw一致，表明酶表达成功。这种酶后来被命名为Aly44A。

使用 DALI 服务器对 CBM6E 与蛋白质数据库 (PDB) 中的条目进行了全面的结构比较。分析表明，最接近的结构邻居属于 GH128 家族的 II 亚组：ScGH128_II（PDB:6uax）和 PvGH128_II（PDB:6uav）。ScGH128_II和PvGH128_II与CBM6E的GH128结构域分别表现出42%和39%的序列同一性。关于结构相似性，ScGH128_II 在 241 个匹配的 Ca 原子上显示出 1.5 Å 的 RMSD 值，而 PvGH128_II 在 247 个匹配的 Ca 原子上显示出 1.7 Å 的 RMSD 值。此外，该分析表明 CBM6E 的 CBM6 结构域与 ZgLamC CBM6（PDB : 5fui）有相似之处，ZgLamC CBM6 是一种海洋 CBM6 模块，以其结合昆布多糖的能力而闻名。结构比对显示 117 个匹配的钙原子的 RMSD 值为 1.5 Å，序列同一性为 22%。值得注意的是，在 CBM6E-CBM6 内观察到 Mg 2+离子，占据与 ZgLamC CBM6中相似的位置。该离子表现出六配位八面体几何形状，并与 Glu357 OE1、Glu359 OE1、Ala379 O、Asn467 OD、Asn467 O 和水分子配位。Mg 2+配合物具有六配位八面体构型和与相邻原子一致的B因子。此外，在将类似地采用六配位八面体几何结构的Ca 2+离子建模到相同位点后，其导致晶体结构细化后离子的负（红色）Fo-Fc图

 该DALI 搜索还产生了一些串联 GH 和 CBM 模块，例如Geobacillus stearothermophilus β- D -xylosidase XynB1（PDB:2bfg）和Pseudomonas aeruginosa PslG（PDB:4zn2）。然而，这些蛋白质中 GH 和 CBM 结构域之间的相对方向与 CBM6E 中观察到的完全不同。GH 和 CBM 结构域的不同方向排列可能不仅影响包含这些结构域的蛋白质的稳定性，而且在这些结构域对特定多糖底物的协调识别中发挥着至关重要的作用，这种现象对于某些多模块糖苷水解酶来说是存在的。此外，在某些情况下，CBM 与碳水化合物配体的结合以及催化模块活性位点中底物的容纳并不表现出协调运动，通常以灵活的域间方向为特征。

3.负子位点区域

通过将CBM 6 E的E168 Q失活突变体与昆布六糖（L 6）共结晶获得了与GOS复合的CBM 6 E的晶体结构，并在1.28 nm的高分辨率下测定。这种复杂的结构使得能够在GH 128结构域的催化沟内定位两条β-1，3-GOS链：一条从-4到-1亚位点延伸，另一条从+1到+5亚位点延伸（图2a）。-1和+1亚位点之间糖苷键的断裂可能归因于E168 Q突变体酶在高结晶浓度下的残余酶活性。CBM 6 E的细长催化凹槽适当地适应两个GOS链的弯曲构象，其共同形成单螺旋结构（2b和7 c）。这种结构特征与CBM 6 E对线性凝胶多糖而不是支链海带多糖的偏好以及其产生产物L3至L 6的独特切割模式相关。

图2.CBM6E GH128 催化结构域内的底物识别。a活性位点残基和 β-1,3-低聚葡萄糖 (GOS) 之间相互作用的图示。聚合度 (DP) 为 4 和 5 的 GOS 分子分别用洋红色和橙色表示，代表它们在负位点和正位点区域内的位置。插图分别显示负子位点区域和正子位点区域以及邻近+5子位点的区域的扩展。与 GOS 相互作用的残基被描绘为青色棒，而选择用于酪氨酸取代的+5亚位点附近的残基被描绘为蓝色棒。给出了 DP 为 4 和 5 的 GOS 的 2σ 轮廓图，分别在负亚位点和正亚位点区域内观察到，源自与海带六糖共结晶的 CBM6E-GH128/CBM6 的 E168Q 无活性突变体的晶体结构。此外，CBM6E 使用静电势表面描述来表示。

表 1.使用 15 mg/mL 浓度的凝胶多糖高凝凝胶作为底物的 CBM6E WT 和合理设计变体的比活性

薄层色谱（TLC）显示，E251Y 变体产生了更加多样化的 GOS DP，范围为 3 至 9（图 3a）。相反，D293Y 变体从凝胶多糖中产生相对纯的 L5，如结果所示（图 3 b）。

图3. 由CBM6E的E251Y (a)和D293Y (b)变体催化的葡聚糖高凝胶水解产物的TLC图谱

6.使用三螺旋 β-1,3-葡聚糖进行分子对接研究

与凝胶多糖粉末相比，CBM6E对凝胶多糖高凝固凝胶的特异性增强，表明 CBM6E 对凝胶多糖的三螺旋构象具有偏好。为了确定凝胶多糖三螺旋的辅助结合位点，我们使用三螺旋 β-1,3-葡聚糖十一聚体和 CBM6E 的 apo 结构进行了分子对接实验。生成了两个结合模型（模型1和模型2）并在图 4中描述，两者都表现出11.7的ZDock分数。

图4.三螺旋凝胶多糖与 CBM6E 的两个排名最高的对接姿势。两种模拟结构都显示了三螺旋 β-1,3-葡聚糖和 CBM6E 之间的表面互补性 ( a , c ) 和氢键相互作用 ( b , d )

7.三螺旋凝胶多糖潜在辅助结合位点的突变分析

为了评估这些潜在辅助结合位点在容纳三螺旋凝乳多糖中的功能作用，我们对所有表面暴露残基（GH128 结构域中的 Y98、Q108、E173、S315、E316 和 CBM6 结构域中的 T376）引入丙氨酸取代其中并随后进行酶动力学测定。结果总结于表 2中。

表 2 使用凝胶多糖高凝固凝胶作为底物，通过分子对接鉴定的针对三螺旋凝胶多糖潜在辅助结合位点的 CBM6E WT 和变体的动力学参数

WT、Y98A、Q108A 和 E173A 变体的数据使用 Hill 模型（而不是 Michaelis-Menten 模型）拟合得很好。值得注意的是，WT 和这些突变体 CBM6E 酶的所有 Hill 系数均超过 1，表明存在两个或多个结合位点以及底物结合中的正协同性。Y98A、Q108A 和 E173A 变体的K 0.5值分别为 7.7、8.5 和 7.9，与 WT 的K 0.5值 7.6 mg/mL 相当，表明这些突变对底物结合的影响最小。

表3. CBM6E-CBM6 WT及其变体针对潜在糖结合位点的凝胶多糖高凝固凝胶的定量结合测定

10.添加 CBM6 对凝胶多糖酶水解活性的影响

图6.在凝胶多糖凝胶水解过程中增加 CBM6 浓度会导致酶活性增加。在将酶添加到混合物中之前，将 CBM6E-CBM6 以各种比例与凝胶多糖凝胶（范围从 1:200 到 1:1，w/w）一起引入。结果表示为在不存在和存在 CBM6E-CBM6 的情况下 CBM6E ( a ) 和 KfGH64 ( b ) 对凝胶多糖高凝固凝胶的相对活性。CBM6E 和凝胶的酶与凝胶多糖的质量比保持一致为 1:50，KfGH64 和凝胶的质量比保持为 1:100

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结论

DOI: https://doi.org/10.1186/s13068-024-02494-5