《NATURE CHEMICAL BIOLOGY》人类肠道微生物组成员对混合藻类半乳聚糖的代谢

文摘科学 2024-09-04 15:46 江苏

2022年1月，来自University of Victoria的Alisdair B. Boraston等人在NATURE CHEMICAL BIOLOGY上发表了一篇题为Metabolism of a hybrid algal galactan by members of the human gut microbiome的研究性论文。

通讯作者：Alisdair B. Boraston

通讯单位：Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, Victoria, British Columbia, Canada

Abstract

天然紫菜多糖是紫菜多糖和琼脂糖的杂交体。作为食用海藻的常见元素，这种藻类半乳聚糖是人类饮食的常见成分。人类肠道微生物群的细菌成员已经获得多糖利用位点 (PUL)，从而能够代谢紫菜多糖或琼脂糖。然而，天然紫菜多糖解构和利用的分子机制仍未完全明确。在这里，我们研究了两种针对天然紫菜多糖的人类肠道细菌，紫菜多糖分解拟杆菌(Bacteroides plebeius)和单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)。这揭示了一个基于外切的紫菜多糖解聚循环，其中包含一个基石硫酸酯酶。在这两种PUL中，该循环还与PUL编码的琼脂糖解聚机制一起工作，协同将天然紫菜多糖还原为单糖。这为理解杂交藻类半乳聚糖的解构以及深入了解针对稀有营养素的肠道微生物群成员的竞争和/或共养关系提供了一个框架。

简介

我们对环境中细菌和动物肠道微生物群的碳水化合物生物质代谢的理解正在取得前所未有的进展。尽管取得了这些进展，微生物用来分解和代谢硫酸化多糖的过程，特别是那些来自海洋的，仍然是微生物糖生物学的一个未充分探索的领域。硫酸化多糖在海洋藻类中特别丰富，它们代表了丰富的碳汇，通过微生物的作用进行循环利用。事实上，卡拉胶和石莼已经为海洋细菌对硫酸盐藻多糖的微生物周转提供了模型。在这些化学性质不同的多糖群中，有一些是人类正常的饮食成分。因此，人类肠道微生物群的代谢适应性和多样性进一步证明了其细菌成员已经获得了利用来自海洋藻类的不寻常多糖的能力。这是通过多糖利用位点(PUL)实现的，该位点被认为是从海洋细菌中横向获得的。这些罕见的营养物质，如紫菜多糖属海藻中的紫菜多糖，有时被称为“特权”营养物质，可用于选择具有分解代谢能力的特定肠道细菌。

紫菜多糖和琼脂糖是密切相关的红藻半乳糖，它们都包含一个修饰的L-半乳糖残基的主链，连接α-1,3和β-半乳糖，这个重复的双糖单元由β-1,4-糖苷键连接。这两种多糖的区别在于琼脂糖中的L-半乳糖是3,6-无水半乳糖(LA)，而紫菜多糖中的L-半乳糖是6-硫酸半乳糖(L6S)。这反映了两种多糖的共同生物合成途径，即首先合成紫菜多糖，然后通过“硫酸盐消除酶”催化反应将L6S环化成LA，将其转化为琼脂糖。紫菜多糖的完全转化可以得到琼脂糖的均质多糖。然而，天然存在的含有紫菜多糖的多糖通常是由紫菜多糖块和琼脂糖块组成的杂交体，可能是不完全转化的。我们把这种自然产生的杂交多糖称为天然紫菜多糖。天然紫菜多糖中紫菜多糖和琼脂糖的相对含量因多糖的来源而异。虽然天然紫菜多糖是一种生态相关的多糖，也是人类饮食的常见成分(例如紫菜)，但关于微生物完全解构这种硫酸杂交多糖的机制的许多细节尚未解决。

鉴于从海洋细菌获得基因的证据，人类肠道细菌为理解藻多糖降解的总体特征提供了很好的模型。这些模型也为肠道微生物群不同代谢能力的进化提供了独特的见解。在这方面，两种相关的细菌是B. uniformis(菌株NP1)和B. plebeius(菌株DSM 17135)，它们的基因组分别编码琼脂糖PUL (AgaPUL)和紫菜多糖PUL (PorPUL)。这些PULs编码的蛋白质赋予这两种菌株在天然紫菜多糖上生长的能力；B. uniformis也能在琼脂糖上生长，但B. plebeius却不能。然而，对一些PUL编码的基因产物的生化分析表明，两种PUL都具有无法解释的活性，这些活性与重叠的琼脂糖和紫菜多糖代谢一致（即PUL都编码琼脂酶和紫菜多糖酶）（补充表 1)。因此，我们假设在更复杂的天然紫菜多糖的情况下，这两种PULs都能够靶向琼脂糖和紫菜多糖的完全解聚。通过对AgaPUL和PorPUL组分的更详细分析，我们确定了天然紫菜多糖解聚的生化途径。此外，研究结果揭示了存在于两种聚乳酸中的琼脂糖和紫菜多糖活性酶的潜在协同作用，以解聚天然紫菜多糖。因此，PULs具有共同的双重能力，可以最大限度地从天然紫菜多糖中获得单糖。然而，由于缺乏结合、感知和/或吸收这些特定多糖的能力，B. uniformis和B. plebeius无法分别使用紫菜多糖和琼脂糖的同质版本，这对它们在微生物群体中的选择性维持具有影响。

结果

1.L-半乳糖脱氢酶(LGDH)的鉴定

PorPUL具有一个83%的氨基酸序列与普通拟杆菌LGDH同源的基因，该基因将L-半乳糖依赖NADP+氧化为L-半乳糖-1,5-内酯。我们分析了PorPUL同源物，称为BpLGDH，与B. vulgatus酶一样，它对L-半乳糖和NADP+作为辅助因子具有特异性。因此，PorPUL可以处理从紫菜多糖中释放出来的L-半乳糖，同时提供BpLGDH作为定量检测游离L-半乳糖的特定工具。
BpLGDH结晶为具有双重对称的二聚体，具有埋藏界面2,153Å2，预计在溶液中稳定。每个单体都采用醛酮还原酶超家族的(α/β)8桶折叠。活性位点由位于β桶中心的保守催化组氨酸确定。结构上最相似的蛋白是来自嗜盐芽胞杆菌的AKR11C1，它以NADPH依赖的方式降低底物4-羟基-2,3-反式壬烯醛(在241个排列残基上的根均方差2.37Å)。两个蛋白之间的几个活性位点残基是保守的，这表明它们在醛底物识别和氧化机制上有共同的特征。

2.GH29和S1_11活性

PorPUL包含一个编码蛋白的基因(BpS1_11)，该蛋白被归类为SulfAtlas分类的S1硫酸酯酶家族，亚家族11。相邻的基因编码糖活性酶(CAZy)分类的预测家族29糖苷水解酶(BpGH29)。我们检测了重组BpGH29和BpS1_11的S83C突变体(标记为BpS1_11*，生成该突变体是为了在甲酰基甘氨酸生成酶(FGE)的共表达下将半胱氨酸成熟为甲酰基甘氨酸催化残基)结合β-紫菜多糖酶BpGH16B对紫菜多糖的活性(图1a)。与单独使用BpGH16B相比，BpGH16B和BpGH29联合使用对产品外形没有影响。BpGH16B和BpS1_11*的结合改变了与新紫菜多糖糖(NP2, L6S-G，其中G为D-半乳糖)消失一致的产物谱。用这三种酶处理增加了与L-半乳糖具有相同迁移特性的产物的量。通过水解纯化的NP2进一步研究了来自AgaPUL的BpGH29和BpS1_11*的序列作用，以及BuGH29和BuS1_S11* (BuS1_11的S80C催化残基突变)同源物的重组版本(图1b，参见NP2的结构表征方法)。只有与酶对(S1_11*与GH29)的共处理，而不是单独的酶，导致了L-半乳糖和D-半乳糖的定量生产：与预期的30nM的输入材料相比，每种大约28nM。这些结果与S1_11*在GH29水解α-1,3-糖苷键之前先在NP2中对L-半乳糖-6-硫酸盐进行了脱硫的理论一致。

图1. 起始外切型紫菜多糖酶的鉴定。a.荧光辅助糖电泳法分析内切β -紫菜多糖酶BpGH16B与BpS1_11 *和BpGH29结合对紫菜多糖的降解。该凝胶代表进行了三次(n=3)独立实验，结果可重复。b.利用L-和D-半乳糖释放量检测B. plebeius和B. Uniformis的S1_11 *和GH29水解30 nM的新紫菜多糖二糖(NP2)，n=(3)独立反应，每个重复结果以平均值± 标准差(s.d.)表示。

3.外切6-巯基半乳糖硫酸酯酶的结构

BpS1_11*和BuS1_11*都不能水解对硝基苯基硫酸盐，说明底物的碳水化合物部分对底物识别和水解是必要的。BpS1_11*对NP2脱硫的动力学参数Km和kcat分别为598(±50)μM和3.8(±0.1)s−1。然而，我们注意到，kcat值假定存在完全成熟和活跃的硫酸酯酶。

天然BuS1_11的结构（即未突变，因此未催化成熟）揭示了典型的S1硫酸酯酶双结构域组织，该组织包括一个保守的α/β/α碱性磷酸酶折叠和一个α/β混合拓扑的C端辅助结构域。BuS1_11与NP2的络合物显示L6S残基占据了活性位点的底部，O4羟基埋藏并指向蛋白质内部，硫酸盐基团完全隔离在相邻的口袋中(图2a)。催化中心包含保守的钙离子和S1硫酸酯酶催化机制，包括原催化亲核试剂Ser80和催化酸His111的位置(图2b)。底物的L-半乳糖和D-半乳糖部分分别在0和+1亚位点上(使用Hettle等人的亚位点命名法27)，通过直接和水介导的氢键的特定网络进行识别(图2b)。活性位点结构和L6S占据它的模式共同表明，BuS1_11使用硫酸盐酶活性的外显模式，即该酶可以作用于紫菜多糖链的非还原末端的硫酸盐，而不管链的长度如何。

图2. 起始外切紫菜多糖酶的结构分析。a, BpS1_11 *活性位点集中在硫酸盐配位残基(洋红色)，包括S1家族中保守的催化残基。b, BpS1_11*活性位点集中在碳水化合物配位残基(蓝色)，这定义了这种硫酸酯酶的独特特异性。c, BpS1_11* (洋红色、蓝色和黄色)活性位点的结构重叠BT4656 (灰色和绿色，PDB 5G2V)28.d, Bp GH29活性位点的2个视图聚焦于底物配位残基。在橙色中显示假定的酸碱，在青色中显示假定的亲核试剂，这原本是天冬氨酸。e, BpGH29活性位点显示参与C6基团识别的高度保守残基(以颜色表示)。f, BpGH29活性位点显示可能参与L-聚焦和L-半乳糖辨别的可变残基(以颜色表示)。

BuS1_11与BT4656 (Protein Data Bank (PDB) ID 5G2V)具有外切2-N,6-O-二硫-D-氨基葡萄糖-6-O-硫酸盐6-O-硫酸盐水解酶活性的S1_11具有41%的氨基酸序列一致性和1.231Å(超过420个匹配的Ca原子)的根均方差。两种酶的S-亚位高度保守。然而，零亚位容纳了含有硫酸盐基团的糖部分，显示出与识别结构不同的碳水化合物一致的差异(例如，L-与D-)。尽管单糖具有轴向和赤道向的O4基团，但在两种磺化酶之间的一组结构保守的侧链识别0亚位上的O3和O4糖，但对底物其余部分的容纳是不同的。每个酶活性位点通过插入的结构元件重新塑造，这些结构元件为活性位点提供氨基酸侧链，从而影响碳水化合物特异性亚位点的可变性。

4.外切-α-L-半乳糖苷酶活性的分子基础

BpGH29和BuGH29对对硝基苯-α-L-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-α-L-Fuc)有活性，但对对硝基苯-α-L-半乳糖葡萄糖苷(pNP-α-L-Gal)均有活性。pGH29在pNP-α-L-Gal上的动力学分析结果显示，pH值在5 ~ 6之间，pH值为5.6时Km和kcat值分别为0.22(±0.02)mM和0.79(±0.02)s−1(补充图3)。BpGH29的结构揭示了(α/β)8催化结构域和典型的29家族糖苷水解酶的2 -β-片辅助结构域排列。含有催化酸/碱残基Glu312的环从BpGH29的活性位点撤回。产物L-半乳糖的结合伴随着两个环的重排：一个包含催化酸或碱，另一个由两个C端β-夹层结构域中的第一个提供。这种结构变化导致Glu312与糖苷键上的氧结合，使其具有催化作用。

在完整的pNP-α-L-Gal复合物中，测定了BpGH29无活性Asp264 to Asn突变体的结构。活性位点的尺寸和底物在其中的平衡，与从双糖、寡糖或延伸链中水解非还原性端半乳糖的纯外显模式一致。-1亚位的口袋状性质包围了L-半乳糖残基，阻止了6-硫酸化L-半乳糖的识别。Asp327位于与L-半乳糖的O6形成氢键的位置，阻断了可容纳6-硫酸盐修饰的活性位点部分(图2d)，从而使S1_11磺化酶先前对新紫菜多糖寡糖的脱硫需求合理化。pNP-α-L-Gal的对硝基苯基占据了+1亚位，这通常会容纳NP2底物脱硫后的D-半乳糖残基。Trp265侧链在该亚位上的位置为硝基苯基提供了一个芳香平台，很可能是天然底物中的D-半乳糖。

BpGH29的活性位点在这个GH家族的α-聚焦酶成员中是保守的，尽管它对α-L-半乳糖比α-L-聚焦有选择性。底物C6附近的活性位点区域没有表现出α-L-半乳糖选择性潜在作用的可变性(图2e)。然而，GH29聚焦酶与BpGH29之间的显著差异在于His189位点上有丝氨酸或甘氨酸，而Ser187位点上有酪氨酸残基(图2f)。尽管保留了其热稳定性，BpGH29的S187Y/H189S双突变体在pNP-α-L-Fuc或pNP-α-L-Gal上都没有表现出显著的活性，表明这些酶的活性位点结构中存在未知的细微差别，从而赋予了它们的选择性。

5.一种β-紫菜多糖寡糖水解酶的鉴定

为了生成合适的底物来测试BuGH2A可能的紫菜多糖特异性外β-d-半乳糖苷酶活性(即外β-紫菜多糖寡糖水解酶)，我们从酶水解的天然紫菜多糖中纯化了一种四糖，并通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)对其进行了表征(见寡糖结构表征方法)。四糖制剂称为N4，主要由新紫菜多糖四糖(NP4, L6S-G-L6S-G约占总数的40%，如果包括部分硫酸化的变体，则约占50%)组成，其余主要是杂交紫菜多糖或琼脂糖四糖(NAP4, L6S-G-LA-G)。用BuS1_11*和BuGH29处理13nM的输入N4(通过总糖测定)，释放的L-半乳糖量与所有以非还原端L-半乳糖-6-硫酸盐结尾的寡糖一致。

6).该酶组合将产生P3 (G-L6S-G)和A3 (G-LA-G)。BuGH2C先前被证明在A3上具有活性，与BuS1_11*和BuGH29的结合导致d-半乳糖的释放，但没有额外的L-半乳糖，与已知的BuGH2C10的活性一致。我们之前证明BuGH2A在A3上没有活性(参考文献10)，但在与BuS1_11*和BuGH29的反应中，BuGH2A的加入导致大量D-半乳糖和额外的L-半乳糖的释放，这为P3的非还原端β-连接半乳糖的活性提供了证据。这支持了BuGH2A作为具有外显β-D-紫菜多糖寡糖水解酶活性的β-半乳糖苷酶的指定。统一芽孢杆菌酶结合N4的全酶解数据支持BuGH2A的特异性和N4的结构分配。

6.构建外切β-D-紫菜多糖寡糖水解酶

BuGH2A的结构具有典型的五结构域GH2 fold。BuGH2A与半乳糖苷酶抑制剂galactoisofagomine (GIF)的复合物显示出- 1亚位点的占位(图3a)。

图3. 外显-β-D-紫菜多糖寡糖水解酶导致新紫菜多糖寡糖水解的外显基模型。A, 半乳糖异构体胺(Galactoisofagomine, GIF)结合到BuGH2A活性位点，聚焦于抑制剂配位残基。推测的催化残基用洋红色表示，亲核试剂(N)和酸碱(A/B)表示。b, BuGH2A与BuGH2C (5T9G)和BcBgaD (7CWD)重叠，集中在BuGH2A中无序的活性位点环。环序列比对图显示在图的底部，BuGH2A中的无序残基没有突出显示(白色背景)，关键的谷氨酸残基(棒状)用红色框起。BuGH2A的表面以灰色表示，绑定的GIF为绿色棒。BuGH2C和BcBgaD中的回路分别用蓝色和黄色表示。BcBgaD回路表面显示为透明黄色。与BuGH2C结合的GIF为蓝色棒状，与BcBgaD结合的半乳糖和/或葡萄糖单糖为黄色棒状。其中，c、d分别是BuGH2A(橙色，红色标签)、BuGH2C(蓝色，深蓝色标签)和BcBgaD(黄色，黑色标签)的−1(c)和+1(d)子位点。E, 新紫菜多糖寡糖水解的外基模型示意图。酶亚位用红色标记，键裂解点用绿色三角形标记。

BuGH2A的结构具有典型的五结构域GH2 fold 。BuGH2A与半乳糖苷酶抑制剂半乳糖异黄酮(GIF)的复合物占-1亚位点(图3a)。与活性位点相邻的一个由586 ~ 606残基组成的环是无序的，无法建模。BuGH2A与琼脂糖特异的BuGH2C(PDB 5T9G，氨基酸一致性为37 %)和环状芽胞杆菌β-半乳糖苷酶BcBgaD (PDB7CWD，氨基酸一致性43%)的比较表明，该环含有一个保守的谷氨酸残基，其位置与-1亚位点中半乳糖配置糖的O4形成氢键，通常为外切半乳糖苷酶活性的活性位点(图3b )。BuGH2A中的紊乱环可能具有相同的功能，而C3羟基的隔离阻止了紫菜多糖链中内部D-半乳糖残基的内型识别(图3a,b)。BuGH2A、BuGH2C和BcBgaD的−1亚位高度保守(图3c)，与外显β-半乳糖苷酶活性一致。BuGH2A和BcBgaD具有相似的+1亚位点，包括一个保守的色氨酸残基，这表明BuGH2A中+1亚位点的结构可能以与BcBgaD识别半乳糖或葡萄糖类似的方式容纳L6S(图3d)。然而，BuGH2C具有不同的预测+1亚位点，可能反映了需要在该亚位点上容纳3,6-无水半乳糖。BuGH2A的结构和功能分析以及S1_11和GH29酶的活性表明紫菜多糖寡糖解聚的“外切”模式(图3e)。

7.天然紫菜多糖的糖化与酶的协同作用

我们估计，从商业获得的海紫菜中提取的天然紫菜多糖与琼脂糖区域的比例约为50:50(方法和补充图4)。我们用B. uniformis和B.plebeius芽孢杆菌酶与内作用紫菜多糖酶联合处理(使用BuGH2A作为未识别的plebeius芽孢杆菌外-β-D-紫菜多糖寡糖水解酶的替代品)。缺乏S1_11*或GH29的单酶、双酶组合和三元混合物产生的D-半乳糖和L-半乳糖含量低至可忽略不计(补充图5)。

S1_11*、GH29和BuGH2A的三元混合物产生了大量的D-半乳糖和L-半乳糖，通过在混合物中加入内紫菜多糖酶(BuGH16C或BpGH86A)， D-半乳糖和L-半乳糖的产量增加了约60%(图4a,b)。缺乏BuGH2A的三联体混合物在释放天然紫菜多糖单糖方面出乎意料地有效(仅比季系混合物少约10-15%)，我们将其归因于内切-β-紫菜多糖酶BpGH86A(参考文献20)和BuGH16C(补充图6)从天然紫菜多糖中释放大量NP2。在所有情况下，释放的D-半乳糖与L-半乳糖的比例大约为1。如果这些酶的组合只针对天然多糖的紫菜多糖区，这是可以预料的。

通过结合所有紫菜多糖酶或所有琼脂酶，将95nM的天然紫菜多糖(以NP2的等效物确定)完全糖化，分别从紫菜多糖酶混合物和琼脂酶混合物中产生大约18 nm和11nM的D-半乳糖(图4c)。这相当于19%到12%的总转化率。所有7种酶的组合导致大约43nM的D-半乳糖的释放(图4c)，使总转化率增加到大约45%，这比单独添加琼脂酶和紫菜多糖酶的转化率(约31%)要大。虽然单独的琼脂酶不能释放L-半乳糖，但与单独的紫菜多糖酶相比，这些酶与紫菜多糖酶的结合使L通过结合所有紫菜多糖酶或所有琼脂酶，将95nM的天然紫菜多糖(以NP2的等效物确定)完全糖化，分别从紫菜多糖酶混合物和琼脂酶混合物中产生大约18 nm和11nM的D-半乳糖(图4c)。这相当于19%到12%的总转化率。所有7种酶的组合导致大约43nM的D-半乳糖的释放(图4c)，使总转化率增加到大约45%，这比单独添加琼脂酶和紫菜多糖酶的转化率(约31%)要大。虽然单独的琼脂酶不能释放L-半乳糖，但与单独的紫菜多糖酶相比，这些酶与紫菜多糖酶的结合使L-半乳糖的释放量增加了约30%(从大约15 nm增加到20nM)，这表明琼脂酶在高聚合的杂交多糖中有效地揭示了紫菜多糖酶底物;或许反过来也是对的。总的来说，这揭示了紫菜多糖酶和琼脂酶混合物之间的协同作用，可以更有效地将杂交天然紫菜多糖多糖还原为单糖。

图4. 天然紫菜多糖的解聚。a,b，天然紫菜多糖的单糖释放，使用B. uniformis紫菜多糖水解酶(a)和B. plebeius酶(b)的组合。注意，在b中使用BuGH2A代替未识别的B. plebeius外切-β-D-紫菜多糖寡糖水解酶。c，使用双歧杆菌紫菜多糖(BuS1_11*， BuGH16C, BuGH29和BuGH2A)和/或琼脂糖(BuGH117B, BuGH2C和BuGH16B)水解酶组合从天然紫菜多糖中释放单糖。在所有的反应中，使用等量的多糖为95 nM的NP2。进行N=3个独立反应，每个重复显示平均值±s.d。

8.拟杆菌类在原生紫菜多糖上的生长

BuAgaSGBP-B是来自B. uniformis的细胞表面琼脂糖结合蛋白，我们以前注意到它也能结合天然紫菜多糖。BACPLE_01696，或BpPorSGBP-B，是PorPUL中假定的类紫菜多糖结合蛋白。定性亲和电泳证实了BuAgaSGBP-B与琼脂糖和天然紫菜多糖的结合，表明BpPorSGBP-B与天然紫菜多糖结合，但不与琼脂糖(附图7)结合。基于定量亲和电泳的结合亲和力估计表明，BuAgaSGBP-B与琼脂糖的结合比天然紫菜多糖(Kd为0.06 mM，与0.5 mM相比；值得注意的是，先前测定的后者Kd值为0.4 mM)的结合亲和力高8倍。这种亲和力的差异并不能用天然紫菜多糖(附图8)中紫菜多糖与琼脂糖的比例为50：50时的化学计量影响来解释。BpPorSGBP-B对天然紫菜多糖(Kd为0.2 mM)具有中等亲和力。综合以上结果，表明BuAgaSGBP-B偏好琼脂糖区域，BpPorSGBP-B偏好紫菜多糖区域。酶切琼脂糖(PENP，约75 %紫菜多糖)的天然紫菜多糖或酶切紫菜多糖(AENP，约80 %琼脂糖)的天然紫菜多糖解聚太多，不能有效地用于亲和电泳。因此，我们使用荧光标记的多糖( FLA-PS)来检测天然紫菜多糖和PENP与B. plebeius的结合和摄取。两种标记糖制剂均被B. plebeius细胞(图5a和附图9a)摄取，而未被B. thetaiotaoarum细胞(补充图9b、c)摄取。这些结果所揭示的碳水化合物受体的选择性与均一芽孢杆菌在天然紫菜多糖和AENP上生长，而在PENP上生长不良的生长实验结果一致，并得到支持。B. plebeius在土著紫菜多糖和PENP上生长良好，但在AENP (图5b , c)上生长较差。多形芽孢杆菌仅在半乳糖(附图9d)上生长。因此，天然紫菜多糖是这两种细菌的共享底物，而这两种细菌具有不同的使用紫菜多糖或琼脂糖的能力。为了对这种选择性提供额外的见解，我们进行了两种微生物的共培养实验。一般而言，即使在半乳糖(图5b , c)等易于使用的底物上，B. plebeius也表现出较弱的生长表型，因此实验以B. plebeius与B. uniformis细胞10：1的比例开始。在此条件下，以半乳糖或琼脂糖为生长底物时，B. plebeius完全无法与B. uniformis竞争生长(图5d)。在土著紫菜聚糖和PENP上，均一芽胞杆菌在初始时间点表现出对培养物的优势。这对于PENP来说是始料未及的；然而，B. uniformis在单种基质中的确表现出一定的生长，且总体上比B. plebeius表现出更快的生长特性，这可能是其在混合基质中初始增殖的原因。然而，在以后的时间点，B. plebeius确实有潜力与B. uniformis竞争生长，特别是在PENP上，因为它开始在培养物中占越来越大的比例(图5d )。这表明这两种微生物可以共同维持在天然的紫菜聚糖上，但可以单独选择使用紫菜聚糖或琼脂糖。

图5. 原生紫菜多糖作为生长基质。a，箱形图显示了与荧光标记的天然紫菜多糖(FLA-nPOR，用N表示)、富含紫菜多糖的天然紫菜多糖(FLA-POR，用P表示)和对照组(与未标记的天然紫菜多糖孵卵，用CTRL表示)孵卵的平均荧光强度随时间(0,15,30,60分钟)的变化。对照组的样本数量为32 (n=32)，样本数量为48 (n= 48)，每个样本计数10,000个细胞。最小值为143，最大值为546，中心值为200。框的边界是百分位数P1, 175和P3, 286。误差条表示标准差。采用单侧Welch’s检验和配对t检验计算处理内和处理间的统计差异(a,b)。每个FLA-PS的平均荧光差(a, P=2×10-16)。每次孵育期间平均荧光随时间变化的差异(b, P=2×10-16)。Tukey检验显示，在所有FLA-Ps孵育中，平均荧光随时间的变化都很显著(所有P≤2.8×10-4)。b,c, B. plebeius (b)和B. uniformis (c)在藻乳上的生长曲线。生长基质用图例中的颜色表示。数据点和竖线表示平均值±标准差，分别为n=4个独立培养。d，在四种生长基质上共同培养B. plebeius和B. uniformis。以10∶1的比例接种B. plebeius和B. uniformis细胞。采用qPCR法检测菌株的丰度。在所有面板中，生长底物为G，半乳糖；N，原生紫菜多糖；P，紫菜多糖富集原生紫菜多糖，A，琼脂糖富集原生紫菜多糖。n=3个生物重复的平均值±s.d。

结论

B. Uniformis和B. plebeius是人类肠道中藻类半乳聚糖代谢的模式生物，具有相似的初始多糖分解和输入(图6a , b)的机制。尽管两种生物在细胞表面部署的内切酶略有不同，但酶有时被称为“先锋”酶，由新紫菜寡糖、新琼胶寡糖和杂合寡糖组成的类似寡糖池被预测在周质空间(图6a , b)中产生。我们之前的研究表明，AgaPUL具有琼胶降解酶，这与基于核酸外切酶的琼胶寡糖解聚模型是一致的。这依赖于GH117外切α-(1,3)-新琼寡糖水解酶(BuGH117B)和GH2外切β-(1,4)-D-琼寡糖水解酶(BuGH2C)依次水解新琼寡糖的非还原末端LA和半乳糖(图6c)。目前我们还无法获得稳定存在的B. plebeius GH2酶，因此我们还没有从PorPUL中鉴定到BuGH2C的功能同源物。然而，BpGH2A与BuGH2C具有64 %的氨基酸序列一致性，因此，BpGH2A很可能是由PorPUL编码的外切-β-(1,4) -D-琼胶寡糖水解酶。如前面所示，此处来自PorPUL的BpGH117是一个外切α-(1,3)-新琼寡糖水解酶。因此，与AgaPUL一样，PorPUL似乎编码了基于外切的新琼寡糖解聚模型的完整机制(图6c)。

图6. 天然紫菜多糖和寡糖解聚示意图。B. uniformis(a)和B. plebeius(b)的初始天然紫菜多糖的输入和解聚途径。新琼脂寡糖(c)、新紫菜多糖寡糖(d)、杂交新紫菜多糖寡糖(e)和杂交新琼脂寡糖(f)的特异性解聚途径。GH2Aga和GH2Por分别表示琼脂糖和紫菜多糖特异性的外显β-半乳糖苷酶。B. plebeius的GH2Aga与同源B. uniformis酶具有较高的氨基酸序列一致性(>60%)。GH2Por在B. plebeius中尚未确定，但很可能是PorPUL编码的另外两种GH2酶之一。OM表示外膜，IM表示内膜。

AgaPUL和PorPUL的紫菜多糖糖化模式也表现出外模(图3d和6d)的特征。新紫菜寡糖在周质中的解聚是由S1_11硫酸酯酶对非还原性末端L6S残基进行脱硫，然后由GH29对产生的末端L -半乳糖进行水解所启动的。在B. uniformis中，暴露的非还原末端β-连接半乳糖的去除是由BuGH2A催化的。鉴于BpGH2A极有可能是外切-β-(1,4)-D-紫菜寡糖水解酶，BpGH2B或BpGH2C是PorPUL中外切-β-(1,4)-D-紫菜寡糖水解酶的候选者；然而，BpGH2C被预测为胞内蛋白，而BpGH2B被认为是最有可能的选择。具有这些特异性的酶的连续作用将能够将新紫菜寡糖还原为其复合单糖(图3d和6d)。

虽然天然紫菜多糖等半乳聚糖通常含有6-O-甲基-D-半乳糖，但我们的模型并不能解释这种修饰的调节。已知一些海洋微生物利用细胞色素P450单加氧酶完成半乳糖的去甲基化；然而，没有证据表明在这两种细菌的基因组中存在编码类似蛋白的基因。与此一致的是，两种不同的紫菜多糖酶对天然紫菜多糖酶解产生的NP2和N4缺乏明显的甲基化，这表明这些微生物的酶对天然紫菜多糖的内水解可能优先产生缺乏甲基化的寡糖。事实上，BuGH2A也显示出较差的容纳6-O-甲基-D-半乳糖的能力(方法)。这也许可以解释为什么一种完全混合的酶不能实现天然紫菜多糖的完全转化。因此，我们认为由PorPUL和AgaPUL编码的酶系统可能无法处理天然紫菜多糖中D-半乳糖残基的甲基化。然而，有可能在内酶-β-紫菜多糖酶之前有一种内活性去甲基酶仍未确定。

因此，AgaPUL和PorPUL都具有将琼脂糖和紫菜多糖还原为单糖的生化能力。然而，根据二分法生长曲线(图5b-d )，这些PULs的传感和摄取系统的特异性似乎决定了微生物处理琼脂糖或紫菜多糖(即不是杂合的天然紫菜聚糖)纯多糖的能力。为什么这些PULs在其生化能力上重叠的问题可以通过观察原生半乳哺乳动物通常是异质的来回答，正如原生紫菜多糖的杂交性质所证明的那样。当两种解糖能力同时发挥时，这些PULs编码的机制可以协同解聚天然存在的天然紫菜多糖和由此产生的杂交寡糖，从而优化单糖的释放(图6)。这对于D-半乳糖来说尤其重要，D-半乳糖是一种很容易使用的碳源，大约占半乳糖的50%，不管它们的异质性如何。然而，其余的单糖，即L-半乳糖和/或3,6-无水-D-半乳糖，似乎被细菌不同地利用，这是由PULs编码的特定单糖加工酶决定的。

PorPUL编码一种具有LGDH活性的酶，该酶与B. vulgatus L-半乳糖加工途径的起始酶同源。事实上，PorPUL编码的基因(位点标记BACPLE_01674至BACPLE_01679)与L-半乳糖加工途径中剩余的酶具有高度的氨基酸序列同源性(大约50-75%)9。没有证据表明B. plebeius的基因组编码专门用于3,6-无水半乳糖代谢的酶。相比之下，B. uniformis缺乏明显的L-半乳糖加工途径，但AgaPUL编码的蛋白质性质与3,6-无水-D-半乳糖代谢最一致。因此，尽管多糖解聚系统重叠，AgaPUL和PorPUL不仅表现出基于特定多糖识别和进口的选择性，而且它们还可能通过代谢一定比例的以L-半乳糖或3,6-无水-L-半乳糖形式释放的单糖的能力具有一定的选择性。

两个相关的PULs的进化是高度专一的混合藻半乳，但它们对这些半乳的特定和化学不同的成分有反应，这表明了两种可能性。这两种细菌要么利用由摄入的红海藻组成决定的适合度优势相互竞争，要么在提供混合琼脂的情况下共同进化以共生关系共存。这里进行的共培养实验表明，尽管B. uniformis在琼脂糖上有明显的优势，但当提供天然紫菜多糖时，种群达到化学数量平衡(图5d)。这很可能反映了原生紫菜多糖的化学异质性，这为两种菌株的觅食提供了琼脂糖和紫菜多糖块。事实上，我们的半乳聚糖使用模型依赖于最终在质周空间解聚的大量多糖片段的进口，这在很大程度上符合多糖使用的“自私”机制(图6)。然而，最初由细胞外天然紫菜多糖分解产生的“纯”多糖片段可能不会被细菌的进口系统识别(即B. plebeius的琼脂糖片段)。(或统一芽孢杆菌的紫菜多糖片段)将留在细胞外，因此可以被其他微生物清除，例如在这种情况下，共培养的微生物具有互补的PULs。这代表了一个独特的合作自私代谢的例子，其中在两个不同的物种中获得了互补的途径来代谢杂交底物。先前对人类肠道宏基因组中AgaPUL和PorPUL频率的分析表明，PULs在个体宏基因组中的共现符合随机分布：0.06%的个体宏基因组含有AgaPUL，0.14%的个体含有PorPUL，0.01%的个体含有这两种PULs，这是基于个体PUL频率预测的共现概率10。对含有藻类多糖特异性PULs和其他针对复杂多糖基质的PULs的肠道微生物所表现出的竞争或协同摄食行为的进一步研究将继续揭开这些流体生化途径的进化史和觅食机制。

原文：Metabolism of a hybrid algal galactan by members of the human gut microbiome.

DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-022-00983-y

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前期回顾

《IJBM》利用定点诱变和高分辨率蛋白质晶体学研究揭示地衣芽孢杆菌 GH5 甘露聚糖酶的生化和结构特征

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