2024年8月，来自江南大学的Ying Chen等人在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表了一篇题为Acceptor Subsite Mutants of Limosilactobacillus fermentum NCC 2970 GtfB 4,3-α-Glucanotransferase Regulate the Ratio of (α1 → 3)/ (α1 → 6) Linkages in Biosynthesized α-Glucans的研究性文章。
![]()
通讯单位：State Key Laboratory of Food Science and Resources, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, ChinaLimosilactobacillus fermentum NCC 2970 GtfB ( Lf 2970 GtfB) 是糖苷水解酶 (GH) 70 家族中唯一已鉴定的 4,3-α-葡聚糖转移酶 (4,3-α-GT酶)，属于 GtfB 亚家族。然而，其 (α1 → 3) 键形成的机制仍不清楚，其键特异性的结构决定因素仍有待探索。在这里，进行了序列比对和结构比较，以确定可能对键特异性至关重要的关键氨基酸。Lf的五个残基选择位于供体和受体亚位点的2970 GtfB (D991、G1028、A1398、T1400 和 E1405) 进行突变。产品结构分析表明，位于受体结合亚位点附近的 D991 和 G1028 在连接形成中起着至关重要的作用。除了天然的 (α1 → 4) 和 (α1 → 3) 连接外，突变体 G1028R 和 D991N 在产品中还显示出 8% 和 10% 的 (α1 → 6) 连接增加，而野生型仅为 1%。此外，分子对接研究表明，G1028R 和 D991N 突变体中受体结合的方向有利于 (α1 → 6) 连接合成。然而，在位置A1398，T1400，和E1405的突变表明，供体亚位点的连锁特异性贡献较小。这些结果揭示了4，3-α-GT酶Lf 2970 GtfB的连锁特异性的结构决定因素，并为GH 70家族的结构-功能关系提供了见解。
糖苷水解酶70家族(GH70)酶可以从淀粉或蔗糖合成特定结构的α-葡聚糖，并且最初仅含有来自乳酸菌的葡聚糖蔗糖酶(GS)，其具有“一般认为安全”(GRAS)的地位。由于GS的反应特异性不同，产生了多种分子结构的α-葡聚糖。变聚蔗糖酶和葡聚糖蔗糖酶是首先被表征的GS，它们分别主要在主链上合成(α1→3)键和(α1→6)键。后来，对Reuteransucrase的表征证明了引入(α1→4)和(α1→6)键组合的能力。最近，人们发现了 GH70 的一个亚家族，名为 GtfB 型 α-葡聚糖转移酶，它可以利用淀粉和麦芽糊精作为底物，而不是蔗糖。已鉴定出几种 GtfB 型 α-葡聚糖转移酶根据连接特异性可分为三类，第一类以Limosilactobacillus reuteri 121 GtfB(Lr 121 GtfB)为代表，包括Lr GtfW、Lr ML1 GtfML4、Limosilactobacillus aviarius subsp. aviarius DSM20655(La GtfY)、Lr E81 GtfB 和Lactobacillus fermentum NCC 3057 GtfB(Lf NCC 3057 GtfB)，可在葡聚糖链非还原端形成连续(α1 → 6)连接，从而合成线性异麦芽麦芽多糖(IMMP)。第二类由Lr 2613 GfB、Limosilactobacillus aviarius subsp. aviarius DSM20655(La GtfX)、Streptococcus thermophilus GtfB(St GtfB)、LrN1 GtfB和Weissella confusa MBF8–1 GtfB(Wc MBF8–1 GtfB)组成，它们可以在线性和分支链中引入(α1→6)键，从而产生不同大小的罗伊氏菌样聚合物。第三类仅含有Lf2970 GtfB 具有独特的 4,3-α-转糖基酶活性，可在直链和支链中引入 (α1 → 3) 键。α-葡聚糖的特定键组成赋予其不同的物理和化学性质。例如，添加葡聚糖可以改善烘焙食品的质地。St GtfB 改性面包的质地和烘焙性能有所改善，这是由于短支链数量和 (α1 → 6) 键比例增加。具有连续(α1→6)键的IMMP和具有线性(α1→6)键和(α1→2)分支的葡聚糖作为益生元膳食纤维具有巨大潜力。此外，从真菌中分离的(α1→3)连接的α-葡聚糖表现出吸收重金属离子的能力，被认为是低成本的原始生物吸附剂。
连接特异性机制通常通过合理突变进行研究。同源基序I–IV被视为GH13和GH70家族的序列指纹，其中包括催化三联体和底物结合残基。因此，先前的突变研究主要集中在 GH70 酶的基序 I–IV 上，并已鉴定出多个可能影响连接特异性的残基。特别是，位于基序 IV 中过渡稳定剂 (Asp) 下游的残基已被证明在 GS 和 GtfB 型酶产物的连接组成中起重要作用。与 GS 类似，GtfB 型 α-葡聚糖转移酶遵循 α-保留双置换机制。因此，受体亚位点+1/+2被认为在转糖基酶半反应中至关重要。例如，葡聚糖蔗糖酶 Gtf180 中亚位点 +1 附近的 Leu 938 和 Asp 1028 的突变改变了野生型的连接特异性，从而增加了 (α1 → 6) 连接的比率。此外，还发现 + 1 和 +2 亚位点在Lr 121 GtfB 的 (α1 → 6) 连接形成中起重要作用，突变体 H1056G(+2 亚位点)和 N1019H(+1 亚位点)降低了麦芽糊精/麦芽七糖衍生产物中 (α1 → 6) 键的比率。除了受体亚位点外，Lr 121 GtfB 中的三个环(环A1：残基 1139–1151，环B：残基 905–924 和环A 2：残基 1430–1440)覆盖供体亚位点−2和−3，也可能与酶的转糖基化和聚合活性有关。例如，在突变体 T920W 中，观察到葡萄糖的大量积累，而不是聚合物的合成，这是由于较高的相对水解活性。然而，供体亚位点在连锁特异性中的作用仍然未知。
在本研究中，选择唯一表征的4，3-α-GT酶Lf 2970 GtfB来研究GH 70 GtfB酶的不清楚的连锁特异性机制。值得注意的是，虽然尚未获得Lf 2970 GtfB的晶体结构，但最近确定了显示高序列同一性的LrN 1 GtfB 4，6-α-GT酶的晶体结构和产物特异性，该酶与Lf 2970 GtfB具有较高的序列同一性(91.81%)。因此，将Lf 2970 GtfB 4,3-α-GT酶的同源性模型和序列与Lr N1 GtfB 4,6-α-GT酶 进行比较，以确定活性中心供体/受体亚位附近的关键残基。选择Lf 2970 GtfB的供体亚位点的残基A1398、T1400和E1405以及受体亚位点的残基D991和G1028进行突变分析，并确定其连锁特异性。结果表明，Lf受体亚位的突变2970 GtfB 4,3-α-GT酶可显著增加产物中(α1 → 6)键的比率，从而产生一种新型 4,3/6-α-GT酶。因此，本研究提供了对GtfB型4，3/4，6-α葡聚糖转移酶的连接特异性的结构决定因素的见解，并显示了工程酶用于合成具有定制分子结构的α-葡聚糖的潜力。
受体底物在酶活性中心的位置对GH 70家族产物的糖苷键特异性有重要影响。因此，受体亚位关键残基的修饰对调控产物的糖苷键组成具有重要意义。对比了Lf 2970 GtfB和Lr N1 GtfB两种具有完全不同连接特异性的受体位点残基的差异。Lf 2970 GtfB 4,3-α-GT酶活性中心与阿卡波糖结合的同源模型及对应的Lr N1 GtfB 4,6-α-GT酶晶体结构(PDB: 8HW3 )(图1 A,B)显示，受体亚位点的残基在Lf 2970 GtfB 和Lr N1 GtfB 之间几乎是保守的。然而，与Lr N1 GtfB具有相同空间位置的D991( Lr N1 GtfB 中的 H265)和 G1028(Lr N1 GtfB 中的 R302)不保守，并突变为Lr N1 GtfB 4,6-α-GT酶(D991H，G1028R)中的相应残基。此外，由三个环(环 A1、环 A2 和环 B)组成的供体结合槽被认为对供体侧的寡糖结合和影响聚合活性很重要。因此，供体亚位点的微环境也可能影响转糖基化作用。基于麦芽五糖与Lr 121 GtfB结合复合物的晶体结构(PDB：5JBF)(图1 C)，获得了Lf 2970 GtfB和Lr N1 GtfB中供体底物结合的同源模型(图1 D，E)，表明在这三个酶中，麦芽六糖与Loop A2结合较近，这表明通过Loop A2的突变可以改变产物和连接特异性。几个已表征的GtfB型α-葡聚糖转移酶的多序列比对(图2) 表明 Loop A2 残基是半保守的，但在某些位置有所不同。基于保守性频率图(图2)，我们选择了Lf 2970 GtfB 中的3个非保守位置(A1398、T1400 和 E1405)，并将它们突变为Lr N1 GtfB 中具有不同连接特异性的相应残基(A1398Y、T1400E 和 E1405D)。所有突变酶均经过纯化，经 SDS-PAGE 检测在110 kDa 处显示单一条带。![]()
图 1. Lf 2970 GtfB 4,3-α-GT酶活性中心与阿卡波糖结合的同源性模型(A) 和Lr N1 GtfB 4,6-α-GT酶 (PDB: 8HW3 ) 的相应晶体结构 (B)。黄色虚线表示氢键。由 Loop A1、Loop A2 和 Loop B 组成的供体位点分别以紫色、红色和棕色显示。以Lr 121 GtfB 与麦芽五糖 (C) (PDB: 5JBF ) 为模板，对Lf 2970 GtfB (D) 和Lr N1 GtfB (E) 中的供体麦芽五糖结合进行建模。
![]()
图 2. 已鉴定的 GtfB 型 α-GT酶中的供体/受体亚位点的序列比对。绿色突出显示的残基是诱变目标。
Lf2970 GtfB 模拟 LrN1 GtfB 的突变对总活性、水解酶活性和转葡糖基化酶效率(T/H)37有不同程度的影响(表2)。结果表明，突变体 D991H 和 T1400E 的总活性相对较高，但水解能力比野生型更强。突变体 A1398Y 和 G1028R 总活性降低，水解活性略有增加，导致转葡糖基化酶效率最低。最后，E1405D 总活性和水解活性较低，转葡糖基化酶效率略有下降。表 2. 野生型和突变型Lf 2970 GtfB 与直链淀粉a的酶活性
![]()
表 3列出了野生型Lf 2970 GtfB 和突变体对直链淀粉的动力学参数。与野生型Lf 2970 GtfB 相比，突变体 A1398Y 和 E1405D 的催化效率( kcat / Km) 较低，这是因为kcat降低。突变体G1028R 的催化效率也降低，但这是由于K m较高，这表示酶和底物之间的亲和力较低。相反，D991H 和 T1400E 的催化效率均有所提高，这是因为k cat值较高且亲和力较高(K m较低)。表3. 野生型Lf 2970 GtfB和突变体以直链淀粉为底物的动力学参数a![]()
Lf 2970 GtfB的最适温度和pH值表明，与野生型相比，G1028R和D991H 突变体的最适温度提高了45℃，并在50℃时保留了80%以上的活性(图3 A)。所有突变体的最适 pH 值都与野生型相似(pH 5.0)，但 G1028R 的最适pH值更高，为 5.5(图3B)。![]()
图 3. 温度 (A) 和 pH (B) 对Lf 2970 GtfB 和突变体活性的影响。每种条件下Lf 2970 GtfB WT 和突变体的最大活性定义为 100%。
表4列出了Lf 2970GtfB及其突变体从线性糊精中得到的产物的糖苷键比例和分子量分布。
表4. 野生型Lf 2970 GtfB 和线性糊精突变体产物的表征
![]()
如前所述，Lf 2970 GtfB产物混合物的1H NMR光谱（图4）显示了（α1 → 4）键（H-1，ppm ~5.41）、（α1 → 3）键（H-1，ppm ~5.37）以及痕量（α1 → 6）键（H-1，ppm ~4.97）的峰。值得注意的是，所有突变体均引入了较多的(α1→6)键，其中突变体G1028R的(α1→6)键含量最多(8.7%)，突变体A1398Y产物中(α1→6)键类型占5.1%。但突变体产物中键类型比例的变化呈现出不同的规律，一方面，受体亚位突变体D991H和A1398Y产物中(α1→4)键比例与野生型相比没有出现明显变化，而(α1→6)键含量的增加主要是由于(α1→3)键比例的降低。随着D991H和G1028R突变体引入更多的(α1 → 6)连接 (分别为4% 和 8.7%)，(α1 → 3) 连接的数量从野生型的 21.8% 急剧下降到 17.3% (D991H) 和 12.6% (G1028R)。这些结果表明，1028 和 991 位点的受体亚位点可能影响受体底物的方向并调节转糖苷的类型。G1028 和 D991 的影响(Lf 2970 GtfB 编号)对连接特异性的影响也已在Lr 121 GtfB 4,6-α-葡聚糖转移酶中报道，(31,32)通过靶向 H1056(Lf 2970 GtfB 中的 G1028)形成亚位点 +2 和 N1019(Lf 2970 GtfB 中的 D991)靠近亚位点 +1。值得注意的是，与野生型酶(53%)相比， Lr 121 GtfB 的突变体 H1056G 减少了 (α1 → 6) 键的数量 (26%)，这可能归因于可用的结合空间更大和底物结合力减弱。(31)N1019H Lr 121 GtfB 突变体与野生型酶 (82%) 相比，(α1 → 6) 键的合成也少得多 (47%)。另一方面，供体亚位点突变体的连接特异性与受体亚位点不同，因为产物中 (α1 → 3) 连接的比例没有显著变化。例如，突变体 A1398Y 和 E1405D 在产物中引入了更多的 (α1 → 6) 连接(分别为 5.1% 和 4.3%)，而 (α1 → 4) 连接较少，表明 4,6-α-转糖基酶活性较高。突变体 T1400E 产生的 (α1 → 6) 连接较少(2.3%)，并且保持与野生型酶相似的 (α1 → 3) 连接比例(21.4%)，表明该位置对于连接特异性并不重要。转糖基活性的可能结构决定因素是位于环 A2 的氨基酸，它们增强了供体亚位点的寡糖结合。因此，突变体A1398Y引入的芳香侧链可以为供体底物提供堆积平台，而将谷氨酸1405突变为天冬氨酸则导致-2亚位氢键力消失(图S4)，这可能会影响供体底物在活性中心的空间取向。![]()
图 4. Lf 2970 GtfB WT 和突变体 D991H、D991N、G1028R、D991H:A1398Y 和 D991H:G1028R 的产物混合物的 600 MHz 1D 1 H NMR 光谱。
利用HPGFC表征了Lf 2970 GtfB及其突变体产物的分子量分布。突变体A1398Y和T1400E产物的分子量与野生型Lf 2970 GtfB相近，HPGFC图谱呈双峰分布。突变体G1028R和D991H合成的产物较小，呈单峰，其中G1028R突变体产生的寡糖平均分子量为0.46 kDa(表4)，与较低的转糖基化效率相一致(表3 )。突变体E1405D合成的产物是所有突变体中最大的(3101.49 kDa)，比Lf高出约4.8倍2970 GtfB野生型。对于影响产物分子量的因素，我们认为不仅酶活性，活性中心底物的结合方式也会影响产物的大小，突变体E1405D的转糖苷活性降低，但产物较野生型较大，可能是由于内切和外切水解有利于底物的结合方式，对产物分子量影响较小。4.D991 和 G1028 突变有助于调节线性糊精衍生产品中的 (α1 → 3)/ (α1 → 6) 比例根据以上结果，对 D991、G1028 和 A1398 进行进一步突变分析，以探索Lf 2970 GtfB 连接特异性所涉及的因素。使用引物，根据多序列比对 (图2 )将目标氨基酸突变为不同类型的氨基酸。对所有脱支马铃薯淀粉衍生产品进行 HPGFC 和1 H NMR 分析 (表4)A1398位突变体产物的键合组成和分子量分布与野生型相似，表明该位置对产物特异性的影响并不大。与野生型相比，G1028突变体产物中(α1→4)键合比例增加，表明转糖基活性降低。结构模型如图1所示A中，G1028位于受体底物进入活性中心的通道上，该残基的突变可能会影响受体底物的空间取向，甚至阻碍其进入活性中心。G1028R/Y突变体产物的平均分子量分别显著降低至0.46kDa和0.48kDa，表明产生了更多的寡糖，这与其相对较高的水解活性有关。值得注意的是，D991突变体合成了结构有趣的产物，其中，突变体D991H和D991N引入了更高比例的(α1→6)键(分别为4%和10.6%)，而野生型中仅为1.2%。D991Y 产物具有更多的 (α1 → 4) 键 (90.1%)，而 (α1 → 3) 键显著减少 (从21.8%降至7.3%)。因此，酪氨酸的引入导致α-1,3-转糖苷酶活性下降，可能是由于大侧链引起的空间位阻所致；从产物质量来看，D991L/Y突变体合成的产物较大，分别是野生型的5倍和7.3倍；而D991H/N突变体产物体积较小。
所有双突变体均表现出产物尺寸减小，这表明这些突变体比野生型酶更具水解性，这与其更高的水解活性一致。令人惊讶的是，双突变体产物的糖苷键组成发生了有趣的变化。突变体A1398Y:G1028R产生的α-葡聚糖具有更少的(α1→4)键(57.8%)并引入了更多的(α1→3)和(α1→6)键，(α1→6)键的比例达到13.9%，是所有突变体中最高的。与突变体D991H/N类似，突变体D991H:A1398Y引入了更多的(α1→6)键(7.8%)，弥补了(α1→3)键的减少(14.7%)，而(α1→4)键含量几乎没有变化。但突变体D991H:G1028R产物中几乎只产生(α1→4)键，表明转糖基化活性几乎丧失。因此，活性中心受体亚位点的组合突变可能具有拮抗作用，这可能是由于多个关键位点发生突变，导致活性中心构象不利于转糖基化。
通过1H NMR谱图可以进一步获得α-葡聚糖产品的精细结构信息。如图4所示，1 H NMR 光谱中 H-4 信号的强度(介于 ppm ~3.40 和 3.45 之间)表明发生了分支并表明野生型Lf 2970 GtfB 产物中存在 (α1 → 3,4) 分支点。突变体 D991H、D991N、D991H:A1398Y 和 D991H:G1028R 中 H-4 信号的强度较高可能与天然 (α1 → 3,4) 或新引入的 (α1 → 4,6) 分支点有关。因此，D991 的位置可能在合成支链 α-葡聚糖中发挥重要作用。![]()
图 5. 受体底物结合模型：麦芽糖(黄色碳原子)与突变体 D991H (A)、D991N (B)、G1028R (C) 和 A1398Y:D991H (D) 的共价葡萄糖基酶中间体模型(青色碳原子)的亚位点 +1 至 +2 结合。突变体残基标有下划线。受体的攻击方向用箭头表示，黄色虚线表示极性接触。
总体而言，结果证实了通过合理的定点突变，Lf 2970 GtfB 4,3-α-葡聚糖转移酶可以转化为具有 4,3/6-α-葡聚糖转移酶活性的α-GT酶，这是 GH70 家族淀粉转换 α-葡聚糖转移酶的首次报道。构建突变体的同源性模型对实验结果进行分析。上述结果表明，位于+1和+2亚位的991和1028位置对产物的连接组成起着关键作用。特别是突变体D991H/N、G1028R以及双突变体A1398Y:G1028R和D991H:A1398Y增强了(α1→6)连接的形成。如图6 A所示，D991的侧链与+1亚位阿卡波糖的C2-OH形成氢键相互作用，从而有助于受体正确定向并稳定糖苷键的形成。然而，在这个位置的突变失去了与底物的极性接触(图6C,D)，从而增加了催化裂隙处底物结合的构象多样性。这些突变体能够产生多种类型的糖苷键，包括线性(α1 → 6)键和(α1 → 4,6)分支键，证实了这一点。此外，991 位组氨酸的存在可能为+1 亚位的糖部分提供芳香堆积平台，从而影响该突变体的转糖基化活性，导致与野生型酶相比形成的(α1→3)键更少。对于受体+1 亚位的 G1028，甘氨酸不直接与底物结合，而是参与形成受体底物进入活性中心的通道(图6A). 将 G1028 突变为较大的精氨酸会增加受体底物结合位点的空间位阻，从而降低底物的可及性，这通过与野生型相比增加的K m值(表3)和降低的总酶活性(表2)得到了实验证实。突变体A1398Y也因酪氨酸较大而表现出空间位阻增加，但供体底物和酪氨酸中的酚羟基之间形成了新的氢键相互作用(图6 F)。此外，芳香族酪氨酸可以为亚位 4 上的供体葡萄糖基部分提供堆积平台(图6F)并促进供体底物的捕获，这通过降低的K m和更高的总酶活性得到支持(表2和3)。![]()
图 6. Lf 2970 GtfB 和突变体的三维模型。野生型酶 (A)、G1028R (B)、D991N (C)、D991H (D) 和 A1398Y:D991H (E) 在亚位点 −2 至 +2 处与阿卡波糖的结合。突变体 A1398Y 在亚位点 −5 至 −1 处与供体底物的结合如图 (F) 所示。突变体残基以红色字母表示，极性接触以黄色虚线表示。
通过分子对接进一步研究了Lf 2970 GtfB突变体连接特异性变化的机制。构建野生型和突变体的共价葡萄糖基酶中间体来模拟转糖基反应。如图5 A所示，麦芽糖中非还原端环上的C6-OH朝向突变体D991H共价中间体的C1，这解释了(α1→6)键的形成。组氨酸还与亚位+2的葡萄糖基部分的C3-OH和C6-OH形成氢键相互作用(图5 A)，从而激发α-1,6-转糖基活性。突变体D991N、G1028R和A1398Y:D991H的对接结果(图5B–D)表现出与D991H类似的情况，而在野生型中没有观察到此结果。但在D991N突变体的对接结果中，麦芽糖的空间取向与D991H相比有所差异，其C6-OH与共价中间体的C1之间的距离更近(黑色箭头所示)，这可能造成D991N突变体引入的(α1→6)键比例更高。G1028和A1398位点并不直接与受体底物相互作用(图5C、D)，但它们位于受体和供体底物进入活性中心的途径附近，因此它们会影响底物的空间取向，最终决定产物中糖苷键的组成。
综上所述，研究的重点是Lf 2970 GtfB 4,3-α-葡聚糖转移酶的供体/受体亚位点，并通过结构比较和多序列比对，针对几个关键氨基酸(D991、G1028、A1398、T1400 和 E1405)进行了研究。进行了定点诱变、半饱和和组合突变，以研究Lf 2970 GtfB 连接特异性的结构决定因素。从产物结构的表征推断，突变体表现出不同的产物特异性，将淀粉转化为具有不同分子量、连接类型和分支度的 α-葡聚糖。特别是，我们发现受体亚位点+1和+2附近的D991和G1028位置对于Lf中的连接特异性至关重要2970 GtfB，使其成为一个全新的 4,3/6-α-葡聚糖转移酶。此外，计算机辅助结构分析表明，突变可能以不同的方式影响连接特异性，例如通过减弱突变体 D991H 与底物的相互作用以及增加突变体 G1028R 的空间位阻。共价葡糖基酶中间体与受体底物的对接结果也证实了 (α1 → 6) 键的形成。此外，突变体 A1398Y 的产物中引入了更多的 (α1 → 6) 键，这表明不仅受体亚位点而且供体亚位点都会通过改变供体亚位点的空间位阻和非共价酶-底物相互作用(氢键和堆积相互作用)来影响连接特异性。总体而言，我们的研究结果为 GtfB 型 α-葡聚糖转移酶的结构-功能关系提供了见解，并展示了工程酶用于合成定制 α-葡聚糖的潜力。精确调节 α-葡聚糖产物中的连接比需要进一步研究组合突变或进一步解析Lf 2970 GtfB。
原文：Acceptor Subsite Mutants of Limosilactobacillus fermentum NCC 2970 GtfB 4,3-α-Glucanotransferase Regulate the Ratio of (α1 → 3)/ (α1 → 6) Linkages in Biosynthesized αGlucansDOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c06121
