《ANGEW CHEM INT EDIT》红藻细胞壁降解的关键酶——3,6-脱水-D-半乳糖苷酶的限制性催化路线
文摘
科学
2024-07-26 18:18
江苏
2024年7月，来自Western Australia School of Molecular Sciences的Michael D. Wallace等人在ANGEW CHEM INT EDIT上发表了一篇题为Constrained Catalytic Itinerary of a Retaining 3,6-Anhydro-D-Galactosidase, a Key Enzyme in Red Algal Cell Wall Degradation的研究性文章。
![]()
通讯作者：Elizabeth Ficko-Blean通讯单位：Station Biologique de Roscoff, Laboratory of Integrative Biology of Marine Models, Place Georges Teissier, 29688 ROSCOFF, FRANCE
Abstract
海洋拟杆菌(Bacteroidota Zobellia galactanivorans)具有一个多糖利用位点，该位点致力于红藻细胞壁半乳聚糖卡拉胶及其独特且工业上重要的α-3,6-脱水-D-半乳糖(ADG)单糖的催化。在这里，我们提出了外切-(α-1，3)-3,6-脱水-D-半乳糖苷酶ZgGH 129用于科普其双环ADG底物(相对于D-半乳糖是环翻转的)施加的严格空间限制的特定分子相互作用的第一次分析。与天然基板和新的化学工具，旨在模仿物种沿着的反应坐标，连同量子力学/分子力学(QM/MM)的metadopathics方法和动力学研究，获得的关键催化状态的晶体快照，展示了保留机制，其中第二步是速率限制。受约束的3,6-脱水-D-吡喃半乳糖环的构象景观通过酶糖基化B1，4 → [E4] → E4/1C 4和去糖基化E4/1C 4 → [E4] → B1，4行程进行，仅限于CremerPople球的南半球。这些结果表明，在整个催化过程中的非标准的，空间受限的，双环单糖的构象变化，并提供了一个分子框架的mechanismbased抑制剂设计的脱水型碳水化合物加工酶和未来的应用，涉及卡拉胶降解。此外，它还提供了同一碳水化合物活性酶家族内不同的利基构象路线的罕见例子。
红藻是一种古老的、具有光合作用、主要存在于海洋中的真核生物。它们的生物质主要由细胞壁成分组成，包括复杂的卡拉胶半乳聚糖(图1A)。卡拉胶具有有价值的胶凝和稳定特性(例如主要的胶凝卡拉胶、α-卡拉胶和β-卡拉胶)，尽管天然卡拉胶是异质结构。此外，卡拉胶寡糖是潜在的高价值产品，与人抗Gal抗体和半乳糖凝集素-3相互作用，显示出抗肿瘤、抗高血压和抗病毒活性，并作为农业生物刺激剂。卡拉胶中的半乳糖单元通过交替的β-1,4和α-1,3糖苷键连接，通过向游离羟基添加硫酸根和其他化学基团引入进一步的变化。独特的双环单糖α-3,6-脱水-D-半乳糖(ADG)通过藻类硫酰化酶的作用在聚合物中形成。3,6-anhydro-bridge对α-半乳糖基单元引入了严格的结构限制，导致环反转(至1C4构象)，因此β-连接和4-OH基团在半乳聚糖内保持赤道而不是轴向。重要的是，ADG驱动聚合物凝胶形成，这是一种被工业广泛利用的流变特性。![]()
图1.A.主要胶凝卡拉胶β-、κ-和ι-卡拉胶、新-β/κ-寡聚卡拉胶四糖(DP 4)的结构以及用于探测ZgGH 129的催化机理和反应几何的化学工具：pNP-ADG 1，3-F-pNP-ADG 2，3-MepNP-ADG 3，mNP-ADG 4，4-ClP-ADG 5，MeUMB-ADG 6，AD-DGJ 7，ADG-IF 8，1,2-diF-ADG 9。B.ZgGH 129的催化机制(其中反应坐标的构象路线穿过Cremer-Pople球的南半球)显示为米氏复合物MC、过渡态1 TS 1、糖基酶中间体GEI、过渡态2 TS 2和产物。代表该构象路线各阶段的-1亚位点捕获晶体结构复合物的快照显示在反应机制的化学图结构下方(从左至右：新-β/κ-寡聚卡拉胶DP 4、AD-DGJ 7、1,2-diF-ADG 9和AD-DGJ 7)。
红藻多糖，包括卡拉胶，是海洋异养细菌在沿海碳循环中使用的碳源。海洋细菌已经开发出了卡拉胶多糖分解代谢的高度专门化机制，例如将卡拉胶多糖利用基因组织成卡拉胶多糖利用基因座(CarPULs)。在Zobellia galactanivorans(一种从红藻中分离的海洋模式类杆菌门)中，许多卡拉胶分解代谢基因，如最近发现的3,6-脱水-D-半乳糖苷酶，位于CarPUL中，而其他必需基因在基因组的其他位置编码，并通过卡拉胶调节子与CarPUL共调节。卡拉胶多糖解聚的初始步骤通过高度特异性内切卡拉胶多糖酶进行，内切卡拉胶多糖酶水解β-1，4-键以产生新系列的寡聚卡拉胶多糖，ADG在非还原末端。Z. galactanivorans 可产生四种外-(α 1，3)-3,6-脱水-D-半乳糖苷酶，即已建立的GH 127和GH 129 碳水化合物活性酶(CAZy)家族中的糖苷水解酶(GH)，可水解卡拉胶新寡糖中的非还原末端ADG。预测3,6-脱水-D半乳糖苷酶保留两个家族的GH，这通过催化过程中糖基化酶中间体(GEI)的形成来举例说明(图1B)。由于3,6-脱水-D-半乳糖苷酶是最近才发现的，因此可获得的结构和酶促数据有限，没有真实的酶复合物的文献实例，并且催化残基和催化机制在实验上仍未确定。为了补救这一点，结合了化学、生物化学、结构和计算方法，以深入了解ZgGH 129(Genbank ID CAZ97291.1)的特异性和ADG在保留催化机制期间发生的构象变化。
为了研究3,6-脱水-D-半乳糖苷酶的酶-底物相互作用和反应性，设计并合成了可以作为推定底物和抑制剂的化合物，增加了可用的有限的基于卡拉胶的化学工具。为了补充已知的人工底物，4硝基苯基3,6-脱水-α-D-半乳糖苷1，制备了具有不同离去基团(LGs)的合适的推定的基于芳基3,6-脱水糖苷的底物2-6(图1A)。接下来，制备了两种推定的小分子抑制剂，3,6-脱水-D-1脱氧半乳糖纳吉霉素(AD-DGJ)7和3,6-脱水-D半乳糖-异法戈明(ADG-IF)8，因为它们可以分别模拟推定过渡态(TS)的O5或C1上部分正电荷的积聚。最后，制备了一种拟定的基于保留2-脱氧-2氟机制的抑制剂-1,2-diF-ADG 9。根据稳态条件下反应速率的分析，在最佳pH值下测定推定底物2-6的Michaelis-Menten参数。生成log(kcat)和log(kcat/Km)与芳基LG的pKa的Brønsted图(图2A)。βlg(kcat)的Brønsted系数> 0表明速率对LG能力没有依赖性，这表明速率决定步骤不是糖基化，而是去糖基化步骤或GEI形成后的非化学步骤。对于图log(kcat/Km)，存在良好的相关性(R2 = 0.88)，然而，6的值不适合线性回归，可能是由于相关二阶速率常数的近似值较差。MeUMB基团的空间体积可以影响观察到的动力学，并且应该使用唯一扰动是电子的衬底进行线性自由能关系，因此这可能会混淆结果。如果去除6，则获得布朗斯特系数βlg(kcat/Km)= -0.16 ± 0.03，拟合得到改善(R2 = 0.95)。小的负βlg(kcat/Km)表明在TS期间在环外氧上存在负电荷的积累，提示晚期TS，其中糖苷键的裂解和质子供给被提前，这与GH超家族中TS的一般结构一致，获得了Brønsted系数βlg(kcat/Km)= -0.16 ± 0.03，拟合得到改善(R2 = 0.95)(图S2)。小的负βlg(kcat/Km)表明在TS期间在环外氧上存在负电荷的积累，提示晚期TS，其中糖苷键的裂解和质子供给被提前，这与GH超家族中TS的一般结构一致。
![]()
图2.A.log（kcat）和log（kcat/Km）对底物1-6的离去基团苯酚的pKa的图; B.Ki测定表明，8。在Ki = 0（●）、0.5（■）、2（▲）、5（▼）和10（◇）μM的pH 5缓冲液中使用;ZgGH 129的时间依赖性失活由9.所用浓度：0（●）、2.5（□）、12.5（■）、25（）、60（▲）和100（◇）μM。曲线是数据对单个指数衰减方程的非线性拟合。D.灭活速率常数（kobs）与ZgGH 129浓度9的函数图。所有数据点一式三份进行技术分析，误差线代表平均值的标准误差。
当使用1作为底物进行评价时，推定的抑制剂表现出非常不同的效力。AD-DGJ 7显示即使在8 mM的和酶的最佳pH下，ZgGH 129的抑制作用也很差。这与Sato等人发现2-乙酰氨基-1,2-二脱氧-d-半乳糖-纳吉霉素是BbGH 129(Ki = 51 nM)的有效抑制剂，BbGH 129是一种来自两歧双歧杆菌的肠道细菌外-α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，可水解非还原末端4C1 α-N-乙酰基-D-半乳糖胺(D-GalNAc)部分。这些观察结果可能与显著不同的天然底物有关，这将影响它们的构象行程和推定的基于TS的抑制剂的功效。有趣的是，这些酶属于GH 129家族中的两个基于生态位的系统发育进化枝，即人类宿主细菌酶(包括BbGH 129)和海洋细菌酶(包括ZgGH 129)。ADG-IF 8是ZgGH 129的强效抑制剂，Ki值为1.50 ± 0.06 μM(图2B)。该结果与一般观察结果一致，即在异头位置具有氮的氮杂糖是糖苷酶的有效抑制剂，所述糖苷酶催化具有赤道糖苷配基(通常为β-糖苷，但在此为赤道α-键)的底物的裂解。ZgGH 129与1,2-diF-ADG 9的孵育导致酶的时间依赖性失活。(图2CD)。通过绘制kobs的曲线，计算控制灭活的动力学参数(ki和Ki)。9的Ki值为68.0 ± 5.6 μM，ki值为0.20 ± 0.01 min-1，这与酶失活抑制一致。这支持ZgGH 129和家族GH 129酶一般确实通过GEI进行。
ZgGH 129的活性位点首先基于诱变及其与BbGH 129的CAZy家族关系从天然结构(PDB ID 5 OPQ)中鉴定为了更深入地了解抑制剂与ZgGH 129的相互作用以及催化机制，我们成功地确定了与AD-DGJ 7、ADG-IF 8、1,2-diF-ADG 9、天然新-β/κ-低聚卡拉胶四糖(neo-β/κ-DP 4)复合以及单独ADG的结构(图3A-E，表S2)。ZgGH 129在不对称单元中结晶为两个生物同源二聚体的四聚体。这两种单体都有助于位于深裂缝底部的两个活性位点(图3F)。活性位点残基包括预测的催化亲核试剂D486(Michaelis络合物中的D486 N，MC)、预测的催化酸/碱残基E517和衬在活性位点上的其他残基：来自同二聚体的第一单体的N218、T220、P346、H347、W382、Y 422、W 455、I487、E531、L536、K564和Q566，以及来自第二单体的C198、D202和K208(图3G)。
![]()
图3.电子密度省略图（最大似然性/σ A-加权[31] Fobs-Fcalc在3 σ处轮廓）是通过省略以下分子从X射线晶体学精细化（表S2）中生成的：A.新-β/κ-寡聚卡拉胶四糖（DP 4）;第7条; C.ADG-IF 8; D.1,2-二-FADG 9; E.ADG; F.ZgGH 129的表面和二级结构图显示了深裂缝底部的两个同源二聚体活性位点，与新-β/κ-寡聚卡拉胶四糖（新-β/κ-DP 4）一起拍照;放大与新β/κ寡聚卡拉胶四糖（DP 4）相互作用的ZgGH129_D486N活性位点残基。单体A的氨基酸以浅粉红色显示，单体B的氨基酸以浅橙子显示。D486的另外两种构象来自叠加的ADG复合物。-1、+1、+2和+3亚位点糖被标记。
在20种cAAs中，赖氨酸是一个有吸引力的修饰选择，因为它的天然丰度高，并且与它的亲核伯胺有许多生物相容性的化学反应。赖氨酸可以用亲电试剂修饰，如方酸、异硫氰酸酯、磺酰氯、活化酯(包括N-羟基琥珀酰亚胺[NHS])和2-氨基-2-甲氧基乙基(图1a-e)。由于其天然丰度较高，在位点选择性不重要或需要多个修饰位点的情况下，Lys修饰往往是有用的。例如，以NHS为基础的邻硝基苄基酯和醛类被用来修饰光敏水凝胶中的一种细胞外基质糖蛋白——玻璃体连接蛋白。该系统为研究细胞对生理线索的反应提供了简化的环境。通过在水凝胶上可逆地构建玻璃体连接蛋白的呈递模式，可以实现对成骨干细胞分化的时空控制。用无催化活性的亲核突变体ZgGH129_D486N和neo-β/κ-DP 4获得MC(图3AFG)。末端非还原性ADG部分结合在-1亚位点，D-半乳糖基、第二ADG和4-磺基-D-半乳糖基部分分别存在于+1、+2和+3亚位点。残基W 455整合到-1亚位点，在ADG的环状O-C5-C6边缘旁边形成疏水支持物。-1亚位点ADG处于B1，4构象，C1和C4位于吡喃糖环平面下方。这种构象将糖苷键和LG置于轴向方向，这减少了来自相邻基团的空间位阻，可能使D486残基(在野生型环境中)对齐，用于亲核攻击C1的σ* 反键轨道。MC D486 N残基相对于其他复合物中的D486残基发生位移;然而，即使是未修饰的D486也能够移动，如ADG复合物中所示，该复合物具有两种清晰的D486构象(图3EG)。MC还从结构上证实，ZgGH 129在-1和+1亚位点的非还原端偏好新-β-卡拉胶二糖[20 b]。含有1C 4 ADG的+2亚位点似乎能够容纳ADG残基上的2-磺基修饰，+3亚位点Lys 208与D-半乳糖基单元的4-磺基部分形成盐桥，这些结果支持先前的MS/MS分析。有趣的是，在40 μ m深的二聚体裂缝底部的每个活性位点的深处都捕获了两种寡糖。当渐缩端到达裂缝开口时，渐缩端向上并朝向彼此倾斜(图3F)。人们很容易推测，深层亚位点结合相互作用的作用是分离和稳定长螺旋形成(和胶凝)卡拉胶链，以实现酶的可及性。
失活抑制剂1,2-dif-ADG-9被成功地用于捕获GEI。在异构碳和催化亲核试剂D486之间观察到共价键(图3D)。吡喃糖的构象在E4和1C4构象之间发生扭曲。这种扭曲可能会减少C1-D486轴键和3,6-无水桥之间的1，3-双轴相互作用。糖基-酶的糖苷键是轴向的，以减少酶反应的脱糖步骤中水的亲核攻击之前的空间位阻。在这个复合体中，以及在竞争性抑制剂复合体中，有一个保守的水位于C1的正下方，为亲核攻击做好了准备。它与可能的酸/碱催化残基E517配位。AD-DGJ 7-和ADG-IF 8也在-1亚位获得了这两个复合物，尽管7是ZgGH129的抑制剂(图3BC)。AD-DGJ 7采用E4构象，与推测的平面TS一致。ADG-IF 8采用E4/1C4构象，其中C1指向环面上方。观察到的ADG-IF 8构象与捕获的GEI相似，表明它不是TS模拟物。
令人惊讶的是，用ADG浸泡产生部分GEI复合物(图3E)。催化亲核试剂D486在共价GEI和不存在与ADG的共价键之间显示出显著的移动。所示的电子密度是GEI、产物和ADG关闭状态形式之间平衡的平均表示。因此，将单糖细化为电子密度代表了平衡的三种状态，并导致针对1C4 ADG GEI复合物建模的“扁平”糖苷键外观。在卡拉胶聚合物中，由于3,6-脱水桥施加的空间限制，ADG基序以1C4构象存在。这些结构结果表明D半乳糖苷酶在南半球的构象催化路线(图1B)，通常与一些甘露糖苷酶和神经氨酸酶家族或与加工L-糖的酶如GH 29 L-岩藻糖苷酶相关。
BbGH 129 与ZgGH 129(RMSD 2.8 μ m)的结构重叠显示BbD 435(催化亲核试剂)和BbE 478(催化酸/碱)与ZgGH 129中的相应残基几乎完全重叠(图4ABC，参见支持信息和图S4)。BbGH 129的活性中心含有与2-乙酰氨基配位的二价阳离子，ZgGH 129中没有活性中心金属离子。BbW 398相对于ZgW 455垂直，并提供保持4C1DGalNAc的轴向C4-OH的疏水平台。BbD 330提供与轴向C4-OH的H-键。ZgW 455被BbD 371替代，BbD 371在D-GalNAc C6-OH的氢键距离内。显然，这种相互作用在ZgGH 129中是不必要的，因为C6形成3,6脱水桥的一部分。发现来自第二ZgGH 129单体的ZgD 202位于与BbW 398相似的位置。沿着ZgH 347，ZgD 202提供与C4-OH的H-键。该氢键似乎是必需的，因为保守突变体(ZgD 202 N)消除了酶活性。值得注意的是，在BbGH 129中未发现来自ZgGH 129的第二单体的活性位点参与螺旋(其支持ZgD 202残基)(图4DEF)。相关地，ZgGH 129在晶体结构中形成同二聚体，BbGH 129作为单体存在。这种比较显示了GH 129如何使用对活性位点进行小修饰和对二级结构进行较大修饰的酶支架来改变底物偏好并提供不同糖构象的基于小生境的识别。![]()
图4.ZgGH 129与AD-DGJ 7的复合物和BbGH 129 PDB ID 5 WZN与D-GalNAc的复合物的结构重叠显示，虽然存在相似性，例如在催化活性残基的位置上，但存在主要的结构差异。A.ZgGH 129的活性位点，单体A的氨基酸以浅粉红色显示，单体B的氨基酸以浅橙子显示。B.ZgGH 129和BbGH 129的活性位点重叠。C.BbGH 129的活性位点以浅蓝色显示。D.一个ZgGH 129单体的二级结构图，其中参与活性位点的螺旋用红色圈出。E.ZgGH 129和BbGH 129（ZgGH 129的同二聚体中的另一单体）的重叠以表面图示示出。F.BbGH 129的二级结构表示。
接下来，转向量子力学/分子力学 (QM/MM) 元动力学模拟，进一步揭示催化的分子机制（参见支持信息）。使用ZgGH 129 neo-β/κ-DP 4的晶体结构，我们重建了MC，恢复了D486 N突变，并平衡了200 ns MD模拟的结构，以显示两个亚基在四个明确定义的亚位点中容纳neo-β/κ-DP 4。
为了深入了解MC中ADG可接近的构象，使用QM/MM元吸附模拟计算了天然neo-β/κ-DP 4的ADG单元的构象自由能景观(FEL)，沿着Cremer-Pople环褶皱坐标作为集体变量。结果(图5A)表明，酶允许ADG优先采用B1,4构象，与MC中实验观察到的构象一致(1C4构象也是可能的)。![]()
图5.A.左侧：Cremer-Pople球面，根据投影在笛卡尔坐标qx和qy上的极坐标（Q、θ和φ），描绘了吡喃糖环的可能构象。ZgGH 129在南半球运行。右图：投影到斯托达德图中的ZgGH 129-1亚位点处ADG的构象自由能图。1 kcal/mol时的等高线。B.沿糖基化和去糖基化反应的最小自由能途径（反应坐标）的代表性结构。C.反应自由能图（糖基化和去糖基化）和沿着反应坐标的主要催化距离的演变。1 kcal/mol时的等高线。
为了模拟ZgGH 129的糖基化机制，我们选择了对应于最稳定的B1，4自由能最小值的结构，其中LG是轴向的。在此，D486亲核残基接近ADG单元的异头碳(C1-OD 486 = 3.20 ± 0.17 μ g)，并且E517与易断裂糖苷键的糖苷氧形成H键(O 1-HE 517 = 1.51 ± 0.09 μ g)，表明底物准备用于催化。为了模拟糖基化步骤，使用两个集合变量来驱动反应。第一个CV(CV1)定义为C1-OD 486和C1-O 1的差异，描述亲核攻击，而第二个CV(CV 2)被认为是HE 517-O 1距离，以解释催化酸残基E517对LG的质子化。从模拟得到的自由电子激光显示两个主要的极小值和一个单一的TS，表明一个协调的一步机制。计算的自由能垒(14.2 kcal/mol)与可从实验速率常数估计的自由能垒一致(对于底物1，计算为15.6 kcal/mol)。还有一个额外的最小值对应于预催化复合物MC '，它与MC通过一个小的能垒分开。其对应于HE 517从与ADG的2-OH形成H-键转换为糖苷氧。
反应坐标的分析提供了糖基化步骤的原子视图(图5 B)。一旦酸/碱残基开始与糖苷氧形成H-键，糖苷键开始断裂，ADG朝向包膜构象(E4)演变。之后，D486亲核残基接近C1原子，并且质子从E517通用酸催化剂转移到糖苷氧O 1。在TS(TS 1，图5 B)处，ADG基序处于平面E4构象，与稳定氧碳正离子样TS的立体电子性质一致。C1-O 5键从MC处的1.39 ± 0.03 Ω降至TS 1处的1.29 ± 0.01 Ω(表S3)，反映了异头碳和内环氧之间的部分双键特征。C1-O 1在TS 1处几乎断裂(C1 O 1 = 2.19 ± 0.04 μ g)，但糖基-酶键尚未形成(C1-OD 486 = 2.62 ± 0.05 μ g)，表明存在解离机制。氢键相互作用有助于在糖基化步骤期间保持紧密的活性位点，即D202和ADG的4-OH之间的那些以及Y 422侧链与D486的相互作用。ADG和E531的2-OH之间也存在水介导的相互作用(表S3)。ADG保持这些相互作用，同时沿着B1，4 → [E4] → E4/1C 4构象路线向GEI演变。
为了模拟催化的去糖基化步骤，我们从与1,2-diF-ADG 9共价结合的酶的晶体结构重建了天然GEI，并将9的C2处的氟替换为羟基。通过300 ns经典MD模拟平衡的相应复合物(图5 B中的GEI')与在糖基化步骤的QM/MM代谢动力学模拟中获得的GEI复合物一致。模拟结果表明，水分子进入活性位点，并被容纳在异头碳下方，并由一般碱残基E517协调，E517在该机制的这个阶段处于其未质子化状态，并且处于适合水解的方向。在去糖基化过程中，还观察到ADG的2-OH与活性位点E531的其他谷氨酸之间的水介导的相互作用。因此，E531是结合底物的关键，但不参与反应。
在去糖基化反应期间，GEI(图5 B中的GEI')显示了水分子，如上所述，与催化碱(Hwat-OE 517 = 1.71 ± 0.13 π ι)形成H键，接近反应性异头碳(C1-Owat =3.86 ± 0.25 π ι)并且处于亲核攻击的有利构型。定义了两个CV以驱动反应朝向产物状态(图S11)。与糖基化反应相似，去糖基化反应显示单一TS(TS 2，图5 B)，其中ADG采用E4构象。该反应是解离的，因为C1-OD 486共价键已经断裂，而与Owat的新键尚未形成(C1-Owat = 2.17±0.05 π ι，C1-OD 486 =2.61 ± 0.06 π ι)。C1-O 5键从GEI'处的1.39 ± 0.03 Ω收缩到TS 2处的1.31 ± 0.01 Ω，再次表明形成了氧碳正离子样物质。反应朝着产物复合物方向发展，遵循E4/1C 4 → [E4] → B1，4构象路线，反映了糖基化步骤的构象路线(支持视频文件2)。去糖基化步骤(17.2 kcal/mol)的计算反应自由能垒(图5C)高于糖基化步骤(14.2 kcal/mol)。因此，动力学数据和我们的模拟都预测糖基化反应不是催化过程中的限速步骤。
化学和结构分析结合QM/MM代谢动力学模拟支持ZgGH 129水解(α-1，3)-3,6-脱水-D半乳糖的两步保留催化机制，其中残基D486和E517分别具有亲核试剂和一般酸/碱的催化作用(图1B)。据我们所知，D-半乳糖苷酶的所有表征的催化路线都位于整个北方半球，尽管分离的D-半乳糖自由能图谱显示倒1C 4椅是其可接近的构象之一。ZgGH 129和刚性ADG吡喃糖环限制了构象景观，只有扭曲的B1，4构象用于催化，其通过B1，4 → [E4] E4 → E4/1C 4和E4/1C 4 → [E4] E4 → B1,4路线(分别为糖基化和去糖基化)穿过Cremer-Pople球的南半球进行，其中去糖基化步骤是限速的。
总体而言，展示了新的见解糖苷酶催化建立精细的分子细节的聚糖构象变化的非标准的，空间限制，双环单糖。这提供了不同构象行程如何容纳在同一CAZy家族内的示例，并从分子上解释了GH 129家族严格划分为两个基于生态位的进化枝。它还建立了一个框架，以协助合理的工程机制为基础的抑制剂设计的脱水型碳水化合物加工酶和未来的应用，涉及这些和其他卡拉胶相互作用的酶。
原文：Constrained Catalytic Itinerary of a Retaining 3,6-Anhydro-D-Galactosidase, a Key Enzyme in Red Algal Cell Wall DegradationDOI: https://doi.org/10.1002/anie.202411171
