《Nature microbiology》疣微菌使用数百种酶来消化海藻多糖岩藻多糖

文摘科学 2024-08-02 19:19 江苏

2020年5月，来自University of Bremen的Andreas Sichert等人在Nature microbiology上发表了一篇题为Verrucomicrobia use hundreds of enzymes to digest the algal polysaccharide fucoidan的研究性文章。

通讯作者：Jan-Hendrik Hehemann

通讯单位：Center for Marine Environmental Sciences, MARUM, University of Bremen, Bremen, Germany

Abstract

褐藻是全球碳循环的重要参与者，每年将二氧化碳固定为 1 Gt 生物质，但其主要细胞壁多糖——岩藻多糖的命运仍不太清楚。岩藻多糖的微生物降解速度比其他多糖慢，这表明岩藻多糖更顽固，可能在海洋中封存碳。这可能是由于岩藻多糖结构复杂、分支多且硫酸化程度高，这种结构在不同的褐藻物种中也存在差异。在这里，我们表明‘Lentimonas' sp.CC4 属于 Verrucomicrobia，它获得了一种非常复杂的机制，可以降解六种不同的岩藻多糖。该菌株积累了 284 种假定的岩藻多糖酶，包括糖苷水解酶、硫酸酯酶和碳水化合物酯酶，它们主要位于 0.89 兆碱基对的质粒上。蛋白质组学表明，这些酶组装成底物特异性途径，需要来自不同种类褐藻的每个岩藻多糖大约 100 种酶。这些酶将岩藻多糖解聚为岩藻糖，岩藻糖在蛋白质组昂贵的细菌微区室中代谢，该微区室在空间上限制了有毒中间体乳醛的代谢。海洋宏基因组和微生物基因组表明，包括 ' Lentimonas'在内的Verrucomicrobia是丰富且高度专业化的岩藻多糖和其他复杂多糖的降解剂。总体而言，这些途径的复杂性强调了为什么岩藻多糖可能难以降解且降解速度较慢，因为只有高度专业化的生物才能在海洋中有效地降解它们。

简介

褐色大型海藻Macrocystis和Sargassum可以形成沿着海岸的多产海带林，并且藻类水华分别从西向东覆盖大西洋。随着这些水华以更大的规模和频率发生，大型藻类在碳循环中发挥着越来越重要的作用，每年封存约173 Tg二氧化碳。褐藻细胞壁的独特化学结构由蛋白质和多糖的紧密网络组成，被认为是藻类生物质抵抗微生物降解的主要因素。特别是岩藻多糖，赋予高稳定性的细胞壁，并弥补其干重的23%，比其他藻类多糖能够更缓慢地降解微生物群落，因此是负责封存褐藻生物质。这种不稳定或较慢的降解可能是由于单糖组成，分支和硫酸化，这一切都可以随着藻类物种，甚至季节而变化。岩藻多糖的两种基本形式是同型岩藻多糖和异型岩藻多糖，它们的糖骨架不同。高岩藻多糖由α-1，3-或交替的α-1，3-/α-1，4-连接的l-岩藻糖组成，在O-2、O-3或O-4上具有硫酸酯，而杂岩藻多糖由甘露糖、半乳糖或具有硫酸化岩藻糖分支的葡萄糖醛酸组成。这些主链可以另外修饰，例如在来自海带的高岩藻中，其中羟基被硫酸盐或单糖修饰到仅每三个岩藻糖具有游离羟基的程度8。考虑到这些复杂而多样的结构，微生物如何有效地降解和消耗岩藻多糖仍然是一个悬而未决的问题。

与岩藻多糖具有顽固性的观点一致的是，缺乏任何可以完全酶促降解岩藻多糖的微生物分离物。虽然属于拟杆菌门、γ-变形菌门或浮游菌门-疣微菌门-衣原体门的少数分离物可以部分水解岩藻多糖，但它们实现至多60%的降解。目前，岩藻多糖降解途径仅部分已知，并且涉及不同岩藻多糖酶的组合，例如糖苷水解酶、碳水化合物酯酶和硫酸酯酶，其被分组为具有相似酶活性的碳水化合物活性酶（CAZymes）的同源家族。岩藻多糖的高度装饰结构在空间上保护糖苷键免受酶水解，因为分解酶如硫酸酯酶和碳水化合物酯酶需要首先起作用。此外，来自糖苷水解酶家族107（GH107））的特征内切酶具有高度底物特异性，并且只能在特定的岩藻多糖骨架内切割以产生硫酸化岩藻糖寡糖。这些通过硫酸酯酶如S1_17和S1_25去除O-2和O-3硫酸酯和通过GH 29外切岩藻糖苷酶进行加工，其切割末端岩藻糖。作用于半乳糖、葡萄糖醛酸或O-4硫酸酯等结构部分的酶仍未确定。很可能岩藻多糖的支链和主链在由许多酶组成的复杂的逐步催化级联中降解，如对其他支链多糖如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II和石莼多糖所述。因此，岩藻多糖降解的途径可能涉及大量分布在微生物群落中或容纳在个体高度特化的细菌中的酶。描述了其他支链多糖，如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II和石莼多糖。因此，岩藻多糖降解的途径可能涉及大量分布在微生物群落中或容纳在个体高度特化的细菌中的酶。

高度硫酸化多糖降解的候选者是浮游菌-疣微菌-衣原体超门的成员，其被认为是硫酸化多糖的专家，因为它们的基因组富含硫酸酯酶。Rhodopirellula baltica SWK7具有181个硫酸酯酶，Lentisphaera araneosa HTCC2155T具有267个硫酸酯酶，并且Kiritimatiellales F1具有521个硫酸酯酶。然而，它们作为多糖降解剂的推定功能主要是基于基因组预测，并且只有少数表征的硫酸酯酶特异性针对藻类多糖，令人困惑的是为什么这些细菌经常在其基因组中编码数百种硫酸酯酶。

在这项研究中，我们的特点是海洋Verrucomicrobium 'Lentimonas' sp.CC4作为一个高度专业化的岩藻多糖降解。利用基因组学、蛋白质组学、碳水化合物分析和酶测定，我们发现了岩藻多糖降解的非常复杂的途径，该途径使用约100种酶来释放岩藻糖。然后岩藻糖通过细菌微区室（BMC）代谢，BMC是一种保护细胞免受有毒中间体乳醛影响的蛋白质外壳。对这种复杂的分解代谢途径的需要支撑了岩藻多糖对大多数海洋细菌的不依赖性及其在环境中的较慢周转。

结果

1.岩藻多糖降解‘Lentimonas’菌株的分离

由于细菌群落中存在快速生长的交叉摄食菌，岩藻多糖降解菌的分离证明是具有挑战性的。我们从Nahant海滩（马萨诸塞州，United States）采集环境微生物样品，并在岩藻多糖基本培养基中富集降解菌，然后重复铺板并筛选菌落，以在液体培养基中生长。在检测的> 1，000个菌落中，大多数菌落没有生长，或者当随后重新铺板时，阳性生长结果是形态型的混合物。只有在几轮再生长和再铺板后，我们才分离出7株岩藻多糖降解菌株，它们在孵育数周后以微小无色菌落的形式出现。由于它们生长缓慢，这些菌株可能在液体培养物中被交叉饲养细胞过度生长，交叉饲养细胞不降解岩藻多糖，而是清除后来鉴定为岩藻糖、乳酸盐和丙二醇的代谢物。7个分离株的16 S rRNA基因序列同源性均>99.8%，与“Lentimonas marisflavi”（EF 157839）的同源性为97.4%。“Lentimonas”属在分类学上没有被有效描述，并且包含菌株Fucophilus fucoidanolyticus 17，其被描述为褐藻Cladosiphon okamuranus的岩藻多糖的部分降解剂，但是从培养物收集中没有得到。因此，我们将该菌株称为‘Lentimonas’spp.。CC 4、CC 6、CC 8、CC 10、CC 11、CC 19和CC 21，并且我们将菌株CC4保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心，保藏号为DSM 110005。

所有的‘Lentimonas’spp分离株共享由染色体和大质粒组成的独特的基因组结构。Illumina对所有7个菌株进行测序，得到了4.85至4.89兆碱基对（Mbp）的组装基因组，平均94个重叠群。为了获得封闭的参考基因组，CC 4另外用PacBio测序，并组装成3.99和0.89Mbp的两个封闭的重叠群，反映了具有3，506个基因的染色体和具有552个基因的推定的大质粒。使用全基因组比对并计算平均核苷酸同一性（包括最接近的模式Coraliomargarita akajimensis DSM 45221的基因组），我们显示CC 4的总体基因组结构在分离株CC 6至CC 21中得以保留（扩展数据图1）。Illumina基因组的连接体覆盖质粒的>80%，与CC 4的同一性高于95%，而在C. akajimensis属平均核苷酸同源性表明，这两个菌株形成了两个高度相似的分支：（1）CC 4、CC 6、CC 8和CC 21;（2）CC 10、CC 11和CC 19，具有98%的组内同源性和96-98%的组间同源性。

2.广泛的CAZyme和硫酸酯酶库

预测的岩藻多糖降解途径主要位于质粒上，染色体上有额外的酶。对CC4的CAZymes和硫酸酯酶进行注释，发现质粒上有100个糖苷水解酶，113个硫酸酯酶和17个碳水化合物酯酶（图1a和补充表1）。这些包括来自家族GH 29、GH 95和GH 141的外切作用岩藻多糖酶的50个同源物，内切作用岩藻多糖酶GH 107的4个同源物，以及岩藻多糖硫酸酯酶S1_17和S1_25的25个同源物和岩藻多糖脱乙酰酶CE 7的7个同源物。超过80%的这些酶具有通过SecYEG translocon分泌到周质中的信号肽32。我们确定了20个组氨酸激酶反应调节剂对和一个三方ATP-独立的周质转运系统，这是潜在的参与基因调控和降解产物的摄取。在染色体上，63个糖苷水解酶和75个硫酸酯酶主要聚集成5个区域，每个区域包含传感器组氨酸激酶和反应调节剂。这种遗传结构使人想起拟杆菌的多糖利用基因座（普尔斯），其编码蛋白质以感测、降解和输入靶多糖33。因此，我们将这些区域称为PUL A至PUL E（图1a和图2）。PUL E编码1-卡拉胶酶34，如S1_7、S1_19、GH 16、GH 82和GH 127，以及可能用于寡糖摄取的不含SusC/SusD同源物的TonB依赖性受体。PUL A和B与α-甘露聚糖酶具有同源物，但底物仍未鉴定。仅PUL C和D含有用于岩藻多糖降解的硫酸酯酶和岩藻糖苷酶（GH29、GH95和GH141）。

中心代谢功能仅位于染色体上（图1b）。这些包括半乳糖、岩藻糖和糖醛酸的单糖途径，完整的TCA循环，具有末端cbb3型氧化酶的呼吸链，以及用于固氮的操纵子。这种功能分区和大量推定的岩藻多糖酶表明岩藻多糖解聚是质粒的主要功能。CC4的质粒和染色体共编码284个推定的岩藻多糖酶，占所有基因的7%。与其他岩藻多糖降解细菌的比较表明，酶家族GH29、GH95、GH141、S1_15、S1_16、S1_17、S1_25和CE7在‘Lentimonas’和厌氧岩藻多糖降解菌Kiritimatiellales sp. F21中高度富集（图1c），表明这些酶家族在岩藻多糖降解中发挥重要作用。

图1.“Lentimonas”sp.CC4具有降解硫酸多糖的大质粒和独特的基因座。a，‘Lentimonas’sp.CC 4的基因组概述。从里到外：以Mbp为单位基因组规模;说明硫酸酯酶基因（橙子）和糖苷水解酶（GH）基因（蓝色）密度的圆形热图;以及标记基因组座位的括号。表中列出了它们各自的酶含量。B.基于标准化为基因内容物的直向同源群（COG）注释簇的每个重叠群的功能分布图。B，染色质结构和动力学; C，能量产生和转化; D，细胞周期调控、细胞分裂和染色体分配; E，氨基酸转运和代谢; F，核苷酸转运和代谢; G，碳水化合物转运和代谢; H，辅酶转运和代谢; I，脂质转运和代谢; J，翻译、核糖体结构和生物发生; K，转录; L，复制、重组和修复; M，细胞壁/膜/包膜生物发生; N，细胞运动性; O，翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白; P，无机离子转运和代谢; Q，次级代谢物生物合成、转运和分解代谢; R，仅一般功能预测; S，功能未知; T，信号转导机制; U，细胞内运输、分泌和囊泡转运; V，防御机制。c，热图，显示了具有可获得的基因组信息的岩藻多糖降解细菌中推定的岩藻多糖酶的同源物的数目。

多聚体酶亚基的化学交联通常用于防止解离（图6）。嗜热酶的化学交联已用于构造四级结构，例如来自Thermotoga maritima天冬氨酸氨基甲酸转移酶、来自风产液菌的L（+）-乳酸脱氢酶和来自超嗜热产甲烷菌Methanopyrus kandleri的DNA结合蛋白，并用于稳定蛋白质复合物（例如，BPL：BCCP复合体。Aquifex aeolicus）。使用与酒石酸二琥珀酰亚胺酯的络合物内和络合物间交联，3，3- 二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）和乙二醇双（磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯），Tanaka和同事表明，来自thermophilic Bacillus PS3的喹啉氧化酶超复合物由喹啉-细胞色素c还原酶（3个亚基）和细胞色素c氧化酶（4个亚基）形成。

3. 硫酸化海藻多糖的专用降解剂

与基因组预测一致，生长测定显示‘Lentimonas’菌株专门用于来自红藻和褐藻的硫酸化细胞壁多糖。我们测试了来自植物、海藻和动物的106种不同的多糖和单糖（补充表2）。所有菌株均生长在来自Fucus serratus, Macrocystis pyrifera, C. okamuranus, Fucus vesiculosus, Durvillaea potatorum 和 Ecklonia maxima（图2a-c）。由于市售多糖中的污染物可能导致误导性的生长结果，我们用阴离子交换色谱法纯化了岩藻多糖，并获得了富含岩藻糖、硫酸盐、半乳糖和葡萄糖醛酸的岩藻多糖，与之前的成分分析一致。菌株不能在羊栖菜和裙带菜的岩藻多糖上生长，可能是因为它们具有杂岩藻多糖结构。重要的是，不像许多其他海洋多糖降解剂，‘Lentimonas’ spp.缺乏水解更不稳定的藻酸盐和葡聚糖的能力。这些结果表明，这七个‘Lentimonas’分离株的代谢生态位狭窄，仅限于褐藻和红藻的岩藻多糖和卡拉胶。

为了研究岩藻多糖降解的分子细节，我们描绘了在五种岩藻多糖和ι-卡拉胶聚糖上生长期间的聚合物消耗。由于所有分离物之间的基因组高度相似性，因此我们重点研究了CC 4和来自F. serratus,C. okamuranus, F. vesiculosus, D. potatorum 和E. maxima细菌倍增时间从2.7小时到2.7小时不等。serratus和ι-卡拉胶聚糖上3 h至来自D.potatorum（图2d）。使用碳水化合物聚丙烯酰胺凝胶电泳（C-PAGE）分析，我们观察到高分子量ι-卡拉胶完全降解，而一部分高分子量岩藻多糖抵抗降解（扩展数据图3a）。因此，我们通过用盐酸将培养滤液水解为单糖，评估了生长期间多糖组成的变化，单糖通过高效阴离子交换色谱和脉冲安培检测器（HPAEC-PAD）定量（图2 e）。多糖的岩藻糖含量降低了5-10 mM，降至起始浓度的26 ± 10%，与其他岩藻多糖降解菌一致13 -17。然而，岩藻多糖的其他单糖很少被降解。例如，存在于来自F. serratus,E. maxima和 C. okamuranus的岩藻多糖含量仅在C. okamuranus属。因此，岩藻糖减少但其他单体含量稳定表明CC 4选择性地以岩藻糖为食，而其他单糖不易接近。

高分子量岩藻多糖的表观稳定性的一个可能原因是主链上的不同单糖装饰构成了降解的结构屏障，因为已知这些残基会阻断内切酶的底物识别。内作用酶会产生中间寡糖，我们只观察到在来自C.Okamuranus而不是其他岩藻多糖。在指数中期，游离岩藻糖的峰浓度高达110 μM，游离葡萄糖醛酸的浓度高达71 μM，而不是寡糖，如通过将培养物上清液直接注射到HPAEC系统上所测量的（图2 e）。HPAEC-PAD分析表明，CC 4不是使用内切酶，而是使用细胞外外作用岩藻多糖酶来主要将岩藻多糖脱乙酰成岩藻糖，然后将岩藻糖吸收到细胞中。

图2.特种‘Lentimonas’spp对复合岩藻多糖的降解a，本研究中使用的岩藻多糖概述。从左至右：褐藻物种之间的系统发育关系的分支图107;分析重复（n = 2）的构件的平均相对丰度;以及从文献中获得的已知结构特征10，11，36，108-110。在种名旁边的褐藻示意图代表了从这些藻类中提取的岩藻多糖。B、C.岩藻多糖主要重复单元的模型结构。冈村岩藻多糖、冈村岩藻多糖。泡状藻和ι-卡拉胶聚糖，其表示为红藻的示意图。c.“Lentimonas”属的生长CC 4至CC 21对不同多糖的影响。棕色和红色框分别表示多糖的来源，其为褐藻或红藻的主要细胞壁多糖。d，在三个生物学独立的实验中，“Lentimonas”sp.CC4在五种不同的岩藻多糖和ι-卡拉胶聚糖上的生长（n = 3）。黑点表示测得的OD 600值，正文表示由拟合的生长函数（灰线）得到的倍增时间（td）。e.“Lentimonas”sp.CC4培养上清中残余多糖和游离单糖的组成。每列代表作为生长底物的一种多糖，每行代表通过HPAEC-PAD测量的单糖，通过直接进样评估游离单糖（蓝线）或在酸水解后评估残留的寡糖或多糖（灰色阴影区域和实心黑线）。数据点表示平均值，误差线表示源自生物学独立实验的标准偏差（n = 3）。因为每个岩藻多糖的游离单糖浓度是高度可变的，所以将游离单糖以0到最大值的比例标绘用于比较，最大值以文本标记表示。

4.超过100 GH和硫酸酯酶用于消化岩藻多糖

蛋白质组学分析表明，特定的岩藻多糖诱导超过100种CAZyme和硫酸酯酶的表达。在岩藻糖、半乳糖、卡拉胶和岩藻多糖的生长过程中，C.okamuranus和F.Vesiculosus中，定量了2，044种蛋白质，其中566种是差异调节的。根据不同条件下的标准化z评分的k-means聚类，将差异调控蛋白分为8个共调控蛋白簇（图3a-c和补充表3）。在半乳糖和岩藻糖的生长过程中，大多数CAZyme下调。l-卡拉胶胶诱导的PUL E，包括GH 82、GH 127、GH 16、S1_7和S1_19（簇8），它们是表征的1-卡拉胶胶酶的同源物，并且可能类似于最近描述的途径降解1-卡拉胶胶。两种岩藻多糖均诱导来自簇1至簇6中的44个酶家族的78种CA酶和76种硫酸酯酶（284种推定岩藻多糖酶中的154种）。值得注意的是，来自F.vesiculosus（第2簇）和C.Okamuranus（簇1）分别特异性诱导PUL C和D。然而，大多数诱导基因位于质粒上。未表达或差异调节的其他推定岩藻多糖酶（倍数变化< 10）可能靶向未测试的其他岩藻多糖。

为了证实大量诱导的岩藻多糖酶，我们使用菌株CC 4和CC 6在来自F. vesiculosus或ι-卡拉胶（补充表4）。由于CC 4和CC 6的基因转录强烈相关（扩展数据图4a），我们使用两种菌株作为生物学重复来测试差异调节的基因。岩藻多糖酶稳定地转录，而1-卡拉胶酶在稳定期下调（补充表4）。比较岩藻多糖酶的差异调节的基因转录和蛋白质表达，我们发现两个数据集是相关的（Pearson's r = 0.69）（扩展数据图4 b）。因此，转录组分析支持蛋白质组学鉴定的大量推定岩藻多糖酶。

来自家族GH 29、GH 95、GH 141、S1_15、S1_16和S1_17（n = 100）的令人惊讶的大量推定外切作用酶构成了专用于去除硫酸盐和岩藻糖的核心途径（图3c）。这些酶中的大多数特异性地响应于两种岩藻多糖中的任一种（簇1和2），而32种由两种岩藻多糖共调节，在单糖条件下具有不同的表达（簇3-6）。大多数先前表征的GH 29、GH 95、GH 141、S1_17和S1_25的同源物是外切岩藻糖苷酶或外切硫酸酯酶。虽然我们不能排除CC 4的GH 95或GH 141具有半乳糖苷酶42或木糖苷酶活性的可能性，但我们在来自F.vesiculosus或C.Okamuranus（图2 e）。相比之下，只有一个CC 4同源物的特征GH 107内切酶的岩藻多糖共调节，和两个同源物的GH 107组成型表达。此外，CC 4的GH 29、GH 95、GH 141、S1_15、S1_16和S1_17具有高度多样性;例如，GH 29同源物具有20 - 90%的同一性，并基于50%同一性截止值形成22个簇，该50%同一性截止值经常用于定义具有相似底物特异性的亚家族（扩展数据图5）。这种家族内的多样性可能是处理复杂的岩藻多糖结构所必需的，因为这些酶的同源物可能具有不同的底物特异性。推定的外切酶超过内切酶的这种积累对于支链多糖降解的途径是典型的，因为它们在内切活性之前使底物脱支。

沿着核心酶家族，我们观察到从岩藻多糖中去除不同结构部分的酶的表达。例如，簇1含有两种GH28（半乳糖醛酸酶）酶、一种GH115（葡糖醛酸酶）酶和两种CE7酶（LCC4_2_312和LCC4_2_314），与岩藻多糖脱乙酰酶（BBC28705.1）具有57%和39%的同一性。这些酶可以去除存在于来自C. okamuranus岩藻属（F. vesiculosus观察到的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的消耗也证实了这一点（图2e）。此外，诱导的GH36、GH116和GH117可能是功能未知的岩藻多糖酶。

诱导的岩藻多糖酶在具有不同酶含量的多个操纵子中被调节，所述操纵子可靶向岩藻多糖的不同亚结构。因为协同作用的酶通常是共转录的，所以操纵子中的基因排列反映了靶多糖的结构。我们预测了51个操纵子，并鉴定了90个操纵子，其中至少含有一个糖苷水解酶或硫酸酯酶，大小最多为16个基因。大多数操纵子（LCC4_operon_822和LCC4_operon_825除外）是不同酶的独特组合，表明靶向结构的高度多样性。此外，具有高度同源性的酶位于对岩藻多糖有不同反应的操纵子中，表明同源物组装成底物特异性操纵子的复杂性（图3d）。例如，LCC4_operon_688 对来自 C. okamuranus 的岩藻多糖有反应，包含两个 S1_15、一个 S1_25 和一个 GH141，与 LCC4_operon_607、LCC4_operon_790 和 LCC4_operon_829 的同源物相似度超过 50%，它们对来自 F. vesiculosus 的岩藻多糖有反应。不同的操纵子排列和特异性调控表明，单个操纵子可能针对不同的结构动机，并支持岩藻多糖的复杂结构需要大量酶的观点。

图3.差异蛋白质组学揭示了岩藻多糖降解的途径。A，基于它们跨条件的归一化表达载体(z分数)，将566个差异表达的蛋白质分组到8个共同调节的酶簇中。每个簇中的蛋白质数量由n表示，数据点和误差条分别表示生长条件z分数上蛋白质表达的平均值和标准差。在三个生物独立的重复(n=3)中定量酶的表达。B，显示所有差异调节的CAZyme和硫酸酯酶(列)跨生长条件(行)的z分数的热图。C，热图显示每个簇和每个酶家族诱导的CAZyme(蓝色)和硫酸酶(橙色)同系物的数量，至少有一个差异调节蛋白，与非调节和非表达的酶一起显示以供比较。每个簇的所有诱导酶同系物的总和显示在热图下方。来自‘Lentimonas’sp.的部分代表性操纵子的基因调控和同源性。CC4。使用RockHopper51基于共定位和共转录来预测操纵子，操纵子的基因以条形图显示，根据它们的成员身份对一组共同调节的酶进行着色。如果基因注释可用，则显示基因注释，对于假设的蛋白质则留空。灰色链接将不同操纵子中的酶的同源物联系在一起，具有50%的同源性。

5.结构不同岩藻多糖的特定途径

为了实验测试诱导的岩藻多糖酶在功能上是特异性的还是冗余的，我们在途径水平上评估了它们的底物特异性。我们从F. vesiculosus,F. serratus, D. potatorum, E. maxima and C. okamuranus,和岩藻糖作为对照，并通过测定所有酶提取物对所有生长底物的交叉反应性来量化（图4a）。在反应过程中，我们定量了还原糖的释放并计算了水解速率。非特异性途径将导致大量交叉反应性，反之亦然。水解速率的系统聚类显示，岩藻多糖之间的高度相似性，从C. okamuranus，F.serratus和E.maxima，而D.potatorum和F.vesiculosus对D.potatorum和F.vesiculosus，分别（图4b）观察到的水解速率差异与释放单糖的定量产率一致。E.maxima，C.okamuranus和F.Serratus的岩藻多糖是乙酰化的，葡萄糖醛酸含量高，这可能解释了它们的高交叉反应性，而D.potorum的半乳糖含量高，F.vesiculosus具有O-2硫酸化。在岩藻多糖的结构类型之间，活性平均下降76%，表明不同类型岩藻多糖的特定途径。观察到的活性模式表明，诱导的酶是岩藻多糖类型特异性的。

图4.不同岩藻多糖降解途径的酶特异性。a.测定途径和岩藻多糖底物之间的交叉反应性的实验装置。从在6种不同底物上生长的“Lentimonas”sp.CC4中提取酶，并使用还原糖测定法测定其在每种底物上的活性。B，热图显示了释放的还原末端的水解速率的生物学独立实验（n ≥ 3）的平均值，其归一化为每种反应底物的最大速率。根据基于欧几里德距离的分层聚类来布置衬底。

6.用于岩藻多糖降解的高蛋白质组投资

岩藻多糖代谢可能受到高代谢成本的限制，因为与ι-卡拉胶相比，其携带三倍高的蛋白质需求。由于蛋白质的合成需要氮-海洋中微生物过程的主要限制性营养素-我们定量了响应岩藻多糖而变化的蛋白质组部分（图5a）。在1-卡拉胶上生长期间，仅7%的蛋白质组差异表达，其中糖苷水解酶和硫酸酯酶贡献1.5%。相比之下，来自F.vesiculosus和C.Okamuranus蛋白质组的差异表达，糖苷水解酶和硫酸酯酶的贡献高达4%。细菌孔蛋白（LCC_1_1313）与组成型表达的氨基琥珀酸合酶（EC 6.3.4.5）共定位，占岩藻多糖蛋白质组的8%。在β-葡聚糖海带多糖上生长期间，海洋拟杆菌中的同源孔蛋白也高度表达，并且与有机氮的获得有关。此外，在岩藻糖和岩藻多糖上生长期间，4%的蛋白质组是岩藻糖代谢酶和BMC的蛋白质，我们后来证明它们共同代谢岩藻糖。因为已知代谢酶的高表达水平会降低微生物适合度，简单多糖的降解剂将胜过岩藻多糖降解剂。此外，高蛋白质需求需要‘Lentimonas’属。强烈专注于岩藻多糖，以避免与简单多糖的快速生长降解物竞争。

图5.表达岩藻多糖（包括岩藻糖特异性BMC）专用途径的高代谢负荷。a，“Lentimonas”种CC 4在不同碳水化合物上生长期间差异调节的蛋白质和蛋白质家族的蛋白质组部分。条形图显示了在不同条件下每簇共调节酶的蛋白表达水平的总和。在不同条件下，由所选蛋白质或蛋白质家族覆盖的蛋白质组级分由覆盖条形的黑线显示。由所有差异调节蛋白质覆盖的总蛋白质组级分显示在条形图上方。B，编码“Lentimonas”sp.CC4的岩藻糖代谢途径的基因结构。c，岩藻糖单糖途径的反应方案：（1）细胞外α-l-岩藻糖;（2）细胞内α-l-岩藻糖;（3）β-l-岩藻糖;（4）l-岩藻糖;（5）l-岩藻糖-1-P;（6）磷酸二羟丙酮（DHAP）;（7）l-乳醛;（8）1，2-丙二醇;（9）乳酰辅酶A;（10）乳酰磷酸;和（11）l-乳酸。d，在“Lentimonas”sp.CC4在L-岩藻糖上生长期间（n = 3）L-乳酸盐和1，2-丙二醇的产生。彩色线表示生长和代谢物数据与对数函数的拟合。

7.岩藻糖在BMC中代谢

在岩藻多糖及其主要单体岩藻糖上生长期间，BMC的蛋白质高度表达（图5a），但它们的功能仍不清楚。尽管我们在CC4中鉴定了编码BMC蛋白的基因簇（图5b），但BMC的特异性是不明确的，因为关键代谢酶如激酶和醛缩酶基因与岩藻糖或鼠李糖特异性的表征酶具有30 - 40%的同一性。两者都是脱氧-1-糖，并且具有产生高反应性且因此有毒的中间体乳醛的相似途径，其通过由BMC 的壳蛋白形成的蛋白笼内的发酵反应而解毒（图5c）。因此，我们通过定量培养上清液中的代谢物来测定BMC岩藻糖途径是否有活性（图5d）。我们检测到1，2-丙二醇-BMC岩藻糖途径的标志性终产物58，59-以及岩藻糖生长培养物上清液中的乳酸盐。由于在含有鼠李糖、葡萄糖、甘露糖或半乳糖的培养物中未检测到1，2-丙二醇，因此BMC似乎对岩藻糖具有特异性。理论上，每1摩尔消耗的岩藻糖，该途径产生0.5摩尔磷酸二羟丙酮和0.25摩尔乳酸和1，2-丙二醇。我们测量了每小时0.352 mM岩藻糖的降解，每小时产生0.101 mM乳酸盐和每小时产生0.075 mM 1，2-丙二醇，其对应于1：0.28：0.21（岩藻糖：乳酸盐：丙二醇）的化学计量比。CC4的BMC代谢岩藻糖并将约25%的碳转化为乳酸盐和1，2-丙二醇;因此，该途径将产生约21个ATP，这表明l-岩藻糖例如与葡萄糖相比是能量贫乏且蛋白质昂贵的碳源。

8.‘Lentimonas’spp.是岩藻多糖的全球相关降解剂

Lentimonas属在颗粒相关群落中的丰度最高，我们已经证明，它们在沿海地区尤其丰富。使用来自Tara Oceans和Ocean Sampling Day（OSD）的16 S rRNA miTAG（图6a、B），我们发现了1-2%的‘Lentimonas’ spp。在英国海峡、黑海或墨西哥湾的沿海样品中，甚至在OSD 113样品（葡萄牙）中高达7%。由于在大西洋或太平洋的公海样本中，“Lentimonas”的含量不超过1%，因此大型藻类同藻藻的存在可能会推动“Lentimonas”的相对丰度，但对它们的生态功能仍知之甚少。因此，我们组装了OSD 113样品的173，215个蛋白质，并发现了所有CC 4蛋白质中一半的同源物（图6c）。约1，000种蛋白与CC 4蛋白具有80 - 100%的同一性，包括BMC岩藻糖途径的所有蛋白、26种硫酸酯酶、3种GH 29和1种GH 95，表明这种岩藻多糖代谢尤其在沿海海洋中是相关的。

CC 4的专业化降解一类复杂的多糖与扩大的酶库也是明显的其他疣微菌的基因组。通过分析注释的微生物基因组的糖苷水解酶含量，我们观察到疣微菌通常具有明显冗余的酶库，编码特定酶家族的最高报告同源数（图6d）。例如，Akkermansia muciniphila BAA-835积累11个GH 20以专门化粘蛋白降解，并且密切相关的Akkermansia glycaniphila DSM100705积累15个GH 20，这是迄今为止在细菌中鉴定的最高数量的GH 20。此外，Op. tutaceae sp.TAV5有47个GH 39，Ereboglobus luteus Ho 45 T有11个GH 106，C.akajimensis有16个GH 86，分别表明半纤维素、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I或卟啉的特化。少数家族的糖苷水解酶的浓度通常与拟杆菌中的CA酶模式形成鲜明对比，拟杆菌通常是多面手，具有针对不同多糖的多个普尔斯69，而疣微菌似乎专门针对各自狭窄范围的复杂多糖。

图6.疣状微生物是一种丰富的、专门的多糖降解菌。a，2014年海洋环境司和塔拉洋miTAG中“扁豆属”的相对丰度。B.放大的欧洲沿海样品（如a中方框所示），其中含有高丰度的“Lentimonas”，包括含有8%“Lentimonas”的OSD113样品。c，具有最高相对丰度的OSD113样品和“Lentimonas”种CC4的蛋白质比较。该直方图显示了与“Lentimonas”sp.CC4相比，OSD113样品的组装蛋白的成对同一性。d，热图，显示疣状微菌与其他细菌门相比的糖苷水解酶同源物的数量。

讨论

我们的蛋白质组学分析表明，岩藻多糖被来自GH 29、GH 95、GH 141、S1_15、S1_16和S1_17家族的100种外作用酶的扩展库降解，这引发了这些酶是功能所需还是多余的问题。酶数量的这种扩大是带电藻类分泌物的微生物聚集的标志，其通常富含岩藻糖和鼠李糖。由于其复杂的来源，颗粒可能含有来自不同藻类的各种多糖，其中“Lentimonas”专门选择性地利用硫酸化岩藻糖多糖。即使有超过100种水解酶，“Lentimonas”也会产生残留的岩藻多糖，这些岩藻多糖可以被其他颗粒相关的多糖降解菌（如拟杆菌）进一步降解，这强调了岩藻多糖的完全降解可能是社区的努力。此外，没有任何水解酶的微生物可以直接从释放的岩藻糖、乳酸盐或丙二醇中获益，并且降解群落75内的这种相互作用可能控制“Lentimonas”的生长动力学和环境中岩藻多糖的周转。

我们的研究结果表明，在高度支化和硫酸化岩藻多糖的降解中，“Lentimonas”具有高度的专业化。这种特化可能是由高达21%的蛋白质组的高蛋白质需求驱动的，以表达转运蛋白、单糖代谢酶、BMC和100个硫酸酯酶和CAZymes/岩藻多糖。岩藻多糖只能被高度特化的微生物所利用，这支持了岩藻多糖在海洋中的快速繁殖和缓慢周转。

原文：Verrucomicrobia use hundreds of enzymes to digest the algal polysaccharide fucoidan

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-020-0720-2

END

前期回顾

《TCR》固定化酶生物催化剂设计中的化学修饰：缺点与机遇

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI0MzY5NDYwMQ==&mid=2247501035&idx=1&sn=4bf2b1f71929ff80042205c3aafff3d2

酶工程与糖工程

定期推送酶工程与糖工程科研进展及科普知识，欢迎大家关注！！咨询、交流、合作等事宜请加运营QQ 242812212