《IntJBiolMacromol》来自脆弱拟杆菌NCTC9343 的区域特异性α1,3/4-岩藻糖基转移酶高效生产乳糖N岩藻糖
文摘
科学
2024-08-09 23:39
江苏
2024年5月，来自江南大学的Ningning Wang等人在International Journal of Biological Macromolecules上发表了一篇题为Highly-efficient in vivo production of lacto-N-fucopentaose V by a regio-specific α1,3/4-fucosyltransferase from Bacteroides fragilis NCTC 9343的研究性文章。
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通讯单位：Corresponding author at: State Key Laboratory of Food Science and Resources, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, P. R. China.Abstract
乳糖-N-岩藻五糖V(LNFP V)是典型的人乳五糖。报道了从乳糖多酶体外合成LNFP V，然而，微生物细胞工厂方法生产LNFP V尚未报道。在这项研究中，LNFP V的生物合成途径在Escherichia coli中进行了检查。在此基础上构建了使用高效生产乳-N-四糖的大肠杆菌作为起始菌株。通过引入GDP-岩藻糖途径模块和具有α 1，3-岩藻糖基化活性的区域特异性糖基转移酶，实现了LNFP V的高效合成。从9种候选酶中筛选出α 1，3/4-岩藻糖基转移酶作为LNFP V体内生物合成的最佳酶，其效价最高，副产物积累最少。使用计算机辅助定点诱变获得了有益的变体K128 D以进一步增强LNFP V滴度。最终菌株EW 10经流加培养，LNFP V的产量为25.68 g/L，产率为0.56 g/L·h。
人乳低聚糖(HMO)的高效微生物合成正受到广泛关注，因为它正成为商业婴儿配方奶粉的新黄金标准。然而，大多数研究都集中在短链HMO上，如三羟甲基丙烷和四羟甲基丙烷，但对长链HMO的微生物合成研究不多。通常，乳糖用作通过逐步糖基化进行HMO合成的基本受体底物。每个糖基化步骤需要引入区域特异性糖核苷酸依赖性糖基转移酶和增强作为供体的相应糖核苷酸的供应。底物特异性和区域选择性是HMO生产糖基转移酶应用中需要解决的常见问题。另一方面，HMO链越长，微生物合成通常需要的糖基转移酶越多。因此，较长链HMO的微生物合成可能面临副产物复杂、合成效率低等问题，特异性糖基转移酶的选择尤为关键。以乳糖-N-岩藻糖基五糖(LNFP)I(Fucα1-2Galβ1 -3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)为例，从6个候选菌株中筛选出一个区域特异性α 1，2-岩藻糖基转移酶(α 1，2-FucT)，命名为WbsJ，该酶产生的LNFP I效价高，副产物2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)合成水平低。通过结合多种Meta工程策略，最终通过微生物补料分批生物工艺生产30.47 g/L LNFP I，而无需2′-FL合成。
各种LNFP由于其多功能特性和潜在应用而引起越来越多的关注。LNFP V(Galβ 1- 3GlcNAc β1-3Galβ1-4(Fucα1-3)Glc)是除LNFP I之外的另一种典型的LNFP 。到目前为止，已经确定了200多种不同的HMO结构。根据Elyyilmaz等人总结的整个哺乳期的假定HMO浓度，基于g/L和mM，LNFP V分别占总HMO的0.70%和0.62%。已经对各种HMO的健康影响进行了大量的研究，然而，很少关注LNFP V的健康影响。一个重要的可能原因是难以获得大量的纯LNFP V。生物生产为获得LNFP V提供了可能性。
LNFP V可被视为乳糖N-四糖(LNT，Galβ1-3GlcNAcβ1 - 3Galβ1-4Glc)在末端葡萄糖部分上的α 1，3-岩藻糖基化产物[4]。来自脆弱拟杆菌NCTC 9343(Bf 13 FT)和幽门螺杆菌DMS 6709(FucTIII，此处称为FucT 14)的两种微生物α 1，3/4-FucT用于从LNT体外化学酶促合成LNFP V。然而，两种FucT都具有α1，4岩藻糖基化N-乙酰葡糖胺部分的能力，并进一步使用LNFP V作为底物产生乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH II，Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)Glc)。因此，Bf 13 FT和FucT 14通过LNT的岩藻糖基化产生LNFP V和LNDFH II的混合物。此外，虽然LNFP V的体外酶促合成路线是已知的，但利用微生物细胞工厂法生产LNFP V的研究还未见报道。微生物合成已成为大规模生产各种HMO的最常用手段。本研究构建了LNFP V在大肠杆菌(E.并通过对产LNFP V的FucTs的筛选和改造，提高了LNFP V的效价。在此基础上，采用补料分批培养法，提高了LNFP V的生物合成，最终效价达到25.68g/L。
已报道了从乳糖中体外多酶合成LNFP V的途径。乳糖首先通过β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GlcNAcT)转化为乳-N-丙糖II(LNTri II，GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glc)，后者通过β 1，3-半乳糖基转移酶(β 1，3-GalT)进一步转化为LNT。最后，α 1，3/4-FucT催化LNT的岩藻糖基化生成LNFP V。这三种糖基转移酶是糖核苷酸依赖性酶，分别以UDP-GlcNAc、UDP-半乳糖和GDP-岩藻糖作为供体。2015年，Baumgartner等人构建了工程化的E.大肠杆菌菌株体内产生LNTri II和LNT 。最近，Zhu等通过代谢工程化的E.通过加强UDP-GlcNAc的供应和提高GlcNAcT的可溶性表达，使其在大肠杆菌中的表达量提高到46.2g/L。基于LNTri II的有效生物合成，开发了进一步加强UDP-半乳糖供应和引入特异性β 1，3-GalT以获得LNT的有效生产。这些基础为LNFP V的高效合成提供了可能，但目前多途径基因主要通过质粒导入，这可能带来细胞负担。最近，Li等人构建了染色体整合GlcNAcT的大肠杆菌。E.coli菌株命名为ENP4L2，能够高效产生LNTri II 。通过pCDFDuet-1载体将β 1，3-GalT基因导入到大肠杆菌ENP 05中，摇瓶培养结果表明，菌株ENP 05的LNT产量可达6.07g/L。此外，进一步引入GDP-岩藻糖途径模块和特异性α 1，2-FucT，通过流加培养获得了最终效价为30.47g/L的LNFP I(Fucα 12 Gal β1 - 3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)。
理论上，基于产LNT的底盘菌株ENP 05，进一步引入GDP-岩藻糖途径模块和产LNFP V的FucT，可以实现LNFP V的合成(图1)。在这项工作中，将用于GDP-岩藻糖强化的四种途径基因插入pRSFDuet 1中，包括manC、manB、gmd和wcaG，并将FucT编码基因插入pETDuet-1中。将这两种质粒都转化到底盘菌株ENP 05中以产生LNFP V生产菌株。先前报道了两种FucT，Bf13FT和FucT14能够在体外从LNT合成LNFP V。在此，这两种酶在体内合成LNFP V的能力首次进行了评估。
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图1.在E.coli宿主中构建了LNFP V生物合成的代谢途径
2.用于高效合成LNFP V的各种FucTs的比较除了Bf 1, 3 FT和FucT 14，还选择了其他7种具有α 1，3-岩藻糖基化活性的细菌FucT来评估体内合成LNFP V的能力(图3)，包括来自H.pylori 26，695(FutA和FutB)，H.pylori NCTC 11639(HpFucT)，Bacteroides gallinaceum(FutM2)，H.pylori NCTC 11637(FT1-H9D)和H.pylori J 99(FucU和FucT-J 99)。各种FucTs的氨基酸同源性和GenBank登录信息见表S3，多重序列比对见图S1。除Bf 13 FT和FutM 2外，其余7个FucTs具有很高的序列同源性，彼此显示> 80%的氨基酸同一性。Bf 13 FT与FutM 2的同源性为55.21%，但与其他7个FucTs的同源性为30%-40%。
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图3.不同FucT基因对工程菌LNFP V生物合成的影响LNTri II、LNT和LNFP V的浓度显示在水平轴的上方，3-FL和LNDFH II的浓度显示在水平轴的下方。
结果表明，不同的FucTs在体内合成LNFP V的能力存在显著差异(图3)。摇瓶培养Bf 13 FT的LNFP V合成量最高，为1.94g/L。在相同条件下，FutB和HpFucT的LNFP V产量分别为1.64和1.04g/L，而其它FucT的LNFP V产量均<1g/L。此外，它们还显示出显著不同的副产物分布。FucU、FucT-J 99和HpFucT具有较高的LNT积累量，累积产量超过2 g/L，表明这些酶对LNT转化为LNFP V的活性较低。FucT 1, 4、FutA和FutM 2具有相对较高的体内α 1，4-岩藻糖基化活性，可进一步将LNFP V转化为LNDFH II。通过比较，Bf 13 FT显示出最高的体内LNFP V合成能力和最低的副产物积累。因此，Bf 1, 3 FT被认为是针对具有低α 1，4-FucT活性的LNT的有效区域特异性α 1，3-FucT，因此被认为是用于体内合成LNFP V的有前景的酶。
特异性糖基转移酶的筛选是各种HMO生物学生产的基础研究。一些糖基转移酶在体外HMO合成中显示出很有前途的应用，然而，它们在体内的应用尚未得到评估。此外，使用已知的糖基转移酶作为模板，可以从GenBank数据库中筛选新的酶，并选择用于评价特定HMO的体外或体内合成能力的酶。近年来，已经进行了许多有意义的尝试来筛选用于体内合成各种HMO的特异性糖基转移酶。>10种细菌α 1，2-FucTs已用于体内生产2′-FL，但其中大多数来自可能引起安全性问题的致病微生物。最近，Lee等人从GRAS细菌菌株巨大芽孢杆菌中筛选出了α 1，2-FucT，为2′-FL生物合成的工业化提供了更安全的关键酶基因。Zhu等人从14个推定的候选物中筛选出一个有效的β 1，3-GalT。这是第三个报道的实现LNT体内生物合成的β 1，3-GalT，并且在相同条件下表现出比先前报道的β1，3-GalT更高的LNT产率。Luo et al.和Zhu et al.筛选了易在大肠杆菌中以可溶形式表达的产乳糖-N-新四糖(LNnT)的β 1，4-GalTs。而在大肠杆菌中，已报道的β 1，4-半乳糖苷酶LNnT的可溶性表达非常困难。更重要的是，Li等人从6个候选者中筛选出了一个高效的LNFP I产生α 1，2-FucT的菌株，其在体内产生的LNFP I具有高滴度且无2′-FL的副产物积累。在此，选择了9种具有α 1，3-岩藻糖基化活性的细菌FucTs，以使用LNT生产底盘菌株来评估LNFP V生产率，并证实Bf 13 FT是用于LNFP V体内生物合成的最佳酶。
3.
用于增强LNFP V生物合成的Bf13 FT的修饰
α 1，3-FucT是生产LNFP V的关键酶，因此有必要对其进行修饰以提高生产效率。计算方法是酶修饰的重要工具，已广泛应用于食品酶中。本研究采用Hotspot Wizard对目的酶进行了突变指导。构建同源性模型作为用于寻找热点的输入文件。为了达到提高LNFP V生产效率的目的，选择热点中的功能热点部分进行进一步的分析和过滤。对于每个位置，执行多个信息，包括位置的特征、二级结构的组成、基于能量计算的突变性景观和基于序列比对的氨基酸频率。然后结合突变性和序列保守性对结果进行筛选，只选择突变性高、保守性低的位点。最后，构建了含有14种潜在有益的单点变体的文库，用于Bf 13 FT的分子修饰，包括Y55 F、C57 M、T60 C、T60 D、T60 M、V78 R、G89 C、G89 F、G89 R、K128 D、S131 D、S131 N、Y242 K和Y242 Q（图4）。六种变体略微增强了LNFP V的体内合成，包括K128 D、Y55 F、T60 C、T60 M、V78 R和C57 M，其中K128 D是在标准条件下产生2.44g/L LNFP V的最佳有益变体。基于S131 N、G89 R和G89 F的菌株失去了它们的大部分或全部LNFP V合成能力，因此产生大量的LNT作为主要产物。以G89 C为基础的菌株几乎丧失了合成所有寡糖的能力。其他变体对LNFP V的微生物合成几乎没有影响。
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图4.通过各种基于Bf 13 FT变体的菌株进行的LNFP V的生物合成（一）.选择热点的策略。首先利用Swiss-Model建立同源性模型作为输入文件;然后利用Hotspot Wizard生成的部分功能热点进行进一步设计;最后根据突变性和序列保守性进行筛选，构建了14个潜在有益突变体的文库，用于Bf 13 FT的分子改造。（B）.用于LNFP V生物合成的各种基于Bf 13 FT变体的菌株的摇瓶培养
近年来，人们已经通过计算机辅助合理设计来修饰关键的糖基转移酶，以提高其催化活性或可溶性表达，从而提高特定HMO的生产率。Lee等人从GRAS细菌菌株中鉴定出一种特异性α 1，2-fucT，用于产生2′-FL 。然后利用Hotspot Wizard软件对该酶的催化口袋进行预测，指导酶的修饰。然后筛选了两种变体，显示2′-FL的体内合成增加了15%至30%。pylori α 1，2-fucT以提高底物识别。进行了基于半理性设计的HotSpot Wizard，与野生型相比，突变体对GDP岩藻糖和乳糖的催化效率增加了100倍。基于Hotspot Wizard分析，Park等人成功地从H.pylori 26，695通过在异源表达过程中提高其溶解度，从而增强2′-FL的体内生物合成。此外，Li等人使用区域特异性α 1，2-fucT开发了一种不产生副产物2′-FL的高效LNFP I生产菌株，并使用计算方法通过结合自由能分析来说明可能的原因。在这项工作中，Hotspot Wizard成功地用于修饰LNFP V生产α1，3FucT，最佳有益变体K128 D可以使LNFP V的体内生物合成增加26%（图4）。将基于Bf 13 FT变体K128 D的工程化菌株EW 10用于通过分批补料培养的LNFP V生物合成（图5）。发酵20 h后，以LNFP V为主要产物的各种寡糖逐渐产生。培养46 h后，LNFP V滴度达到25.68 g/L，产率为0.56 g/L·h。为了确保乳糖的有效供应，将22.5mL的200 g/L乳糖分六次进料到生物反应器中。培养46小时后，测得剩余乳糖浓度为2.65 g/L，计算出生产的LNFP V与消耗的乳糖的转化率约为51%。整个培养过程中3-FL和LDNFH II的水平均低于2 g/L，表明其α 1，3-FucT活性对LNT的特异性远高于乳糖，而其α1，4-FucT活性对LNT相对较低，从而减少了副产物LNDFH II的合成。另一方面，残留LNT和LNTri II的最终量分别为10.43和3.86 g/L。它们在所有寡糖产物中的比例相对高于摇瓶培养产生的比例，表明在补料分批培养期间LNTri II和LNT转化为LNFP V的驱动力不足。在未来，将开发多种代谢工程策略以进一步改善体内LNFP V的生物合成。
细胞工厂策略被广泛开发用于生产>10 HMO，然而，只有几种三寡糖和四寡糖可以以相当大的量（>30 g/L）生产，并且大多数五寡糖和六寡糖可以以相对低的水平生产，一般滴度<10 g/L。不仅代谢工程调控策略，而且有效的区域特异性糖基转移酶，对于提高HMOs，特别是长链HMOs的细胞工厂生产至关重要。以LNFP I为例，Baumgüartner等和Hu等在大肠杆菌中通过补救和从头GDP-岩藻糖途径构建了LNFP I途径。摇瓶发酵效价分别为0.547和0.32g/L。最近，Li等人从大肠杆菌中筛选到了一个区域特异性的α 1，2-FucT。coli O 128：B12，采用分步发酵法，摇瓶和补料分批培养的LNFP I效价分别提高到2.53和30.47 g/L 。本研究选择不同的α 1，3-FucTs对LNFP V的体内产率进行了评价，通过计算机辅助蛋白质设计提高了LNFP V的产率，并对最佳工程菌进行了分批补料培养，使LNFP V的产量提高到25.68 g/L。我们提供了另一个成功的案例研究，在体内的有效生物合成的长链HMO在这里，并期望更多的长链HMO将被有效地生物合成。
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图5.用于LNFP V生产的菌株EW10的补料分批培养。箭头表示IPTG和乳糖的补充。
本研究首次采用微生物细胞工厂法合成LNFP V。在LNT产生菌的基础上，引入GDP-岩藻糖途径模块和LNFP V产生菌FucT，实现了LNFP V的微生物合成。Bf 13 FT表现出最佳的LNFP V体内合成能力。使用计算机辅助定点诱变获得了增强LNFP V合成的有益变体K128 D。工程菌EW 10经补料分批培养，产量最高，为25.68 g/L。
原文：Highly-efficient in vivo production of lacto-N-fucopentaose V by a regio-specific α1,3/4-fucosyltransferase from Bacteroides fragilis NCTC 9343DOI:https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.130955
