2011年9月，来自University of the Western Cape的Don A. Cowan等人在Enzyme and Microbial Technology上发表了一篇题为Enhancing the functional properties of thermophilic enzymes by chemical modification and immobilization的综述文章。
![]()
通讯作者：Don A. Cowan,Roberto Fernandez-Lafuente通讯单位：Institute for Microbial Biotechnology and Metagenomics, University of the Western Cape, Bellville 7535, Cape Town, South Africa；Departamento de Biocatálisis, Instituto de Catálisis-CSIC, C/Marie Curie 2, Campus UAM-CSIC, Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain
将蛋白质（通常为酶）固定到固体载体上是成熟的技术，并且已成功地用于在广泛的工业应用中增强生物催化过程。然而，固定化技术的持续发展已经导致该方法的更复杂和专业化的应用。对于支持物和蛋白质两者，靶向化学的组合，有时与另外的化学和/或基因工程组合，已经导致用于修饰蛋白质功能性质、用于增强蛋白质稳定性和用于从复杂混合物中回收特定蛋白质的方法的开发。特别是，开发有效的方法来固定大的多亚基蛋白质与多个共价键（多点固定）已有效地稳定蛋白质，其中亚基解离是酶失活的初始步骤。在某些情况下，在一个过程中可以实现多种益处。在这里，我们全面回顾文献有关的固定化和化学修饰的不同的酶类嗜热菌，重点是所涉及的化学和它们的影响修改的酶的功能特性。我们还强调了在固定化和其他化学修饰的组合使用中的协同作用的潜力。
1.1.作为工业生物催化剂的酶：改善其性能的方法
酶催化复杂的化学过程，大多在温和的条件下。酶在工业、商业和实验室过程中的开发是其在水性介质中的高活性以及高底物特异性和产物选择性的结果。然而，一些酶已经通过自然进化被选择为在所谓的极端条件下执行其生理功能，并且在温度、盐度、pH和溶剂环境下最佳地操作，这些环境远远超出“正常”生理范围。
为了在工业上取得成功，生物催化剂需要在可能远离其生理环境的条件下保持稳定和功能。最典型的是，天然酶不能满足工业生物催化剂的所有要求，并且在实施之前需要改进一个或多个功能特性。这些改进可以通过使用不同的工具来实现。例如，宏基因组基因发现的发展使得来自嗜热环境的酶易于获得，即使当亲本微生物不可培养时。在合适的宿主中快速克隆和过表达靶酶基因现在是一个常规和快速的过程。定点诱变和定向进化方法使得操纵几乎任何酶的性质成为可能。在设计新的固定化载体、开发更有效的固定化方案和更好的生物反应器方面也取得了进展。
传统上，不同的（即，化学与遗传）工具来改善酶的性能，已经被用作几乎独立的策略。然而，不同策略的联合使用已经显示出协同效应，例如，遗传修饰的酶的性质可以通过固定化或化学修饰进一步改善，而化学修饰的酶可以通过固定化进一步稳定。还有许多其他结合使用不同工具来提高酶性能的例子。
使用来自嗜热微生物的酶（即，在60-100 ℃范围内最佳生长的微生物）经常被提出作为酶稳定性问题的解决方案。而来自其他极端微生物（嗜酸菌、嗜碱菌等）的胞内酶则是由细胞内的酶引起的。可能不会暴露于外部环境的极端元素，嗜热菌与其微环境处于完全的热平衡，因此它们的酶在环境温度下足够稳定以支持生物体的生理过程是进化的必要条件。
然而，即使使用这些稳定的酶，它们的性质也有一些改进的空间。在这篇综述中，我们分析了自然稳定的酶与物理化学工具的协调使用，以改善酶的性质。表1综述了酶和应用的方案。
表1.本综述中描述的嗜热酶，以及进行的物理化学修饰![]()
![]()
术语“嗜热菌”是指能够在高温下最佳生长的生物体的一般意义（即，高于37 ° C）。根据主要生长温度，该群体被任意细分为“中度”嗜热菌（(Topt ~ 60 ° C）、极端嗜热菌（Topt ~ 75 ° C）和超嗜热菌（Topt ~ 85 ° C）。适合嗜热生物生存和生长的栖息地广泛存在。中度嗜热菌通常存在于所有温暖的栖息地，包括炎热的沙漠土壤、天然热沃茨、工业废水沃茨和生活水源。极端嗜热菌和超嗜热菌的分布较为有限，主要是因为它们的有利栖息地，陆地和深海热液系统，非常局部化。
现在广泛接受的是，来自这些生物体的酶通常适于在生物体的最佳生长温度或接近最佳生长温度下最佳地操作，对于中度嗜热菌为60 ℃，对于超嗜热菌为95 ℃。通常，细胞内酶更精确地遵循这一“规则”，而细胞外酶可能在远高于最佳生长温度的温度下稳定。
所有酶作为有序聚合物的稳定性可以表征为它们的Tm（熔化温度）的函数-蛋白质经历可逆（或不可逆）解折叠的温度。可以使用光谱方法（如圆二色性或固有荧光监测）观察此类总体构象变化。然而，在实践中，蛋白质稳定性最常通过功能丧失来确定，在酶中最容易通过催化活性的丧失来评估，并产生半衰期和温度失活（Tinact）数据[Tinact是在一组定义的条件下酶失活的速率常数]。Tm和Tinact之间的相关性不是特别精确，因为导致催化功能失活的构象变化可能比参与完整蛋白质解折叠的构象变化小得多。
嗜热菌领域最活跃的研究领域之一是对蛋白质稳定性的分子机制的理解。这一领域已经得到了非常全面的审查。从许多研究中得出的共识观点，包括来自不同热基团的结构类似物的比较分析，定点和随机诱变以及许多其他方法，是使用多种微妙的分子机制来建立蛋白质的必要稳定性。大多数这些机制是分子内的，不一定是明显的或可预测的。然而，大多数这些微妙的分子机制通过增加非共价细胞内交联的补体，从而降低构象迁移率来起作用。一般认为，对于酶，构象迁移率的降低与活性的降低相关，尽管蛋白质进化研究已经证明这两个过程可能是解耦的。
除了一些引人注目的例外（特别是DNA聚合酶），嗜热酶并没有彻底改变生物技术的世界。原因包括以下：并非所有酶技术过程都需要热稳定性生物催化剂;热稳定性同系物可能不容易获得;现有的热稳定性同系物可能缺乏其他合适的性质（如选择性和周转率），或者现有的或新的嗜热/热稳定酶可能无法满足商业要求（生产量/成本）。
虽然遗传修饰已经普遍取代了酶的化学修饰，但后者仍然是稳定蛋白质的有效方法（图1）。化学修饰通常不是定点的，除非使用针对蛋白质结构中独特基团的特定化学物质（例如，Diels-Alder环加成、硫醇交换、与末端氨基反应等）。例如，已经使用硫醇反应性化合物和仅含有单个表面Cys（天然的或通过定点诱变引入的）的蛋白质实现了定点化学修饰（图2）。尽管遗传操作的力量巨大，化学修饰有一些明显的优势。例如，化学修饰允许将更广泛的化学基团引入酶结构（图2），不需要预先知道蛋白质结构，快速（与遗传修饰相比）并且在正确折叠的酶上进行。
![]()
图 1.化学修饰与基因修饰
![]()
图2.蛋白质的定点修饰。
如果在固相中进行修饰（使用固定化酶），则有额外的优势。对化学修饰有更好的控制，最大限度地减少不必要的蛋白质-蛋白质相互作用（图3）。固定化酶的使用有利于使用不相容的介质（例如，无水有机介质），并且可以简化酶的逐步化学修饰。使用通过多点或多亚基固定化稳定的酶也限制了化学修饰过程可能导致的酶失活程度。
![]()
图3.蛋白质在固相上化学修饰的优点。
酶的化学修饰可用于改变酶表面的整体性质或修饰关键残基。例如，对B的17个赖氨酸残基进行修饰。具有柠康酸酐的解淀粉菌β-淀粉酶在非常高的温度下显著地稳定了酶（在较低温度下没有发现这种效果）。已知用聚乙二醇或去污剂修饰酶可改善其在有机介质中的溶解度和稳定性。或者，化学改性可用于调节催化性能。然而，化学修饰对酶性质的影响通常难以预测。酶的化学修饰可用于改变酶表面的整体性质或修饰关键残基。例如，对B的17个赖氨酸残基进行修饰。具有柠康酸酐的解淀粉菌β-淀粉酶在非常高的温度下显著地稳定了酶（在较低温度下没有发现这种效果）。已知用聚乙二醇或去污剂修饰酶可改善其在有机介质中的溶解度和稳定性。或者，化学改性可用于调节催化性能。然而，化学修饰对酶性质的影响通常难以预测。化学修饰也用于在酶表面上的不同基团之间产生共价交联键。当这种交联发生在蛋白质的不同结构元件之间时，它通常会增强结构刚性，因此增加蛋白质相对于诱导构象变化的试剂（例如离液剂或热）的稳定性。分子内交联不一定是直接的;交联剂必须具有适当的长度，并且当使用同源双功能试剂时，分子内交联、单点修饰和分子间交联之间可能存在强烈的竞争（图4）。多官能聚合物的使用简化了多交联键的生成，并且较少受到距离限制或单点改性竞争的限制（图5）。然而，聚合物的柔性结构和长度限制了可以获得的蛋白质硬化程度。相反，这些聚合物多功能试剂有效地防止了多聚体蛋白或多蛋白复合物的解离（图6）。
![]()
图4.使用双功能试剂的化学交联
![]()
图5.使用多功能试剂的化学交联
![]()
图6.亚基交联与多功能试剂
酶的固定化用于促进生物反应器的控制，并且在酶足够稳定的情况下，促进生物催化剂的回收/再利用。有趣的是，固定化还被用于同时增强酶的性质。当酶固定在多孔固体（如蛋白质聚集体或晶体、惰性多孔载体）内时，一些酶失活的来源，如聚集、吸附到疏水表面和自身蛋白水解（图7）被最小化。然而，这类载体也可能导致扩散问题（底物、pH梯度等）。为了充分利用酶的固定化，需要进行多点或多亚基固定化（图8）。
![]()
图7.通过固定在多孔载体上的稳定化
![]()
图8.通过多亚基或多点共价连接进行稳定
可逆（非共价）固定化方案适用于不需要酶稳定的情况，并且支持物可以在酶失活后重复使用。然而，如果所有酶亚基都参与固定，即使是非共价吸附也可以导致多聚体酶的稳定化。通常，在结构刚性化（和构象稳定化）是必需的情况下，多点共价连接是优选的固定策略。当基质是刚性的并且间隔臂是短的时，酶固定化过程中涉及的所有基团应在否则会导致构象变化的条件下保持其相对位置。高密度多点共价键的产生不一定是直接的。为了得到最佳结果，固定化载体应提供与酶良好的几何“一致性”。例如，内部圆柱孔比延伸的宽间隔的薄聚合物链更合适。反应性基团应在反应条件下表现出良好的稳定性，具有低的空间位阻，并应优选与经常位于酶表面的氨基酸侧链部分反应（例如，赖氨酸的β-氨基）。乙醛酰、环氧树脂和在某些情况下戊二醛活化的载体都已成功地用于此目的。多点共价连接通常需要较长的反应时间、中等高温和碱性pH值。替代固定化策略，如交联酶聚集体（CLEA）或晶体（CLEC），也已用于增强酶的特性。CLEC通过结晶的（即，均匀的）蛋白质，产生适用于柱反应器的机械刚性生物催化剂颗粒。CLEA是通过酶的沉淀然后交联而获得的，并且不需要纯酶。几种酶或酶和聚合物的共聚集是可能的。然而，所得的生物催化剂不具有高的机械阻力。虽然这两种固定化策略具有不需要独立支持元件的共同特征，但两者都可以通过降低酶迁移率或防止亚基解离来增强酶稳定性。然而，只有CLEA允许微环境的工程化（例如，以减少溶剂相互作用或减少氧溶解）通过酶和聚合物的共聚集。固定化的好处不仅限于提高酶的稳定性。固定化诱导的蛋白质结构的变形和降低的构象移动性可以极大地改变（并且在某些情况下改善）酶特异性和对映体选择性，并且已经显示出降低底物抑制。
多聚体酶亚基的化学交联通常用于防止解离（图6）。嗜热酶的化学交联已用于构造四级结构，例如来自Thermotoga maritima天冬氨酸氨基甲酸转移酶、来自风产液菌的L（+）-乳酸脱氢酶和来自超嗜热产甲烷菌Methanopyrus kandleri的DNA结合蛋白，并用于稳定蛋白质复合物（例如，BPL：BCCP复合体。Aquifex aeolicus）。使用与酒石酸二琥珀酰亚胺酯的络合物内和络合物间交联，3，3- 二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）和乙二醇双（磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯），Tanaka和同事表明，来自thermophilic Bacillus PS3的喹啉氧化酶超复合物由喹啉-细胞色素c还原酶（3个亚基）和细胞色素c氧化酶（4个亚基）形成。
使用化学交联来进一步增加嗜热酶的稳定性是最常见的目的。例如，来自中度嗜热细菌SM 4的异源寡聚葡萄糖脱氢酶与戊二醛交联。交联酶在65 ℃左右表现出单一的最适温度，而天然酶在45 ℃和75 ℃表现出双重最适温度。使用戊二醛交联来自Thermococcus菌株AN 1的β-葡萄糖苷酶，均质制备和牛血清白蛋白。虽然均匀交联在标准条件下没有提供显著的稳定性，但共交联策略在110 ℃下将活性半衰期从5 min增加到8 min。该酶在50%海藻糖存在下基本稳定，共交联酶的作用进一步增强（t1/2在110 ℃下为90 min，而未修饰酶为30 min）。
用聚离子聚合物（例如，聚乙烯亚胺）阻止了来自Thermus thermophilus的寡聚谷氨酸脱氢酶的亚基解离。然而，保护作用易受聚合物吸附的可逆性质的影响。这个问题通过与戊二醛交联得到解决，产生了在有利于酶解离的条件下完全稳定的酶-聚合物复合材料。
通过使用1乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺实现Bacillus stearothermophilus SD 1四聚体d-乙内酰脲酶的亚基间交联。交联的d-乙内酰脲酶在操作条件下显示出四倍的稳定性（参见，野生型酶），并且在未修饰的酶几乎完全失活的温度下稳定。在20%甲醇存在下和有利于亚基解离的pH值下，交联酶比野生型更稳定。嗜热酶的体内翻译后修饰与热稳定性有关。例如，在体内由赖氨酸甲基转移酶催化的嗜热酶的赖氨酸甲基化已经被提出在酶的稳定性中起重要作用。发现crenarcheon Sulfolobus solfataricus的RNA聚合酶的19个Lys基团被甲基化，来自同一生物体的谷氨酸脱氢酶中的6个Lys基团被修饰。用二酰基甘油对细胞色素c-551的N-末端半胱氨酸残基进行翻译后修饰也被证明与酶稳定有关。蛋白质的化学修饰也被用于测定许多嗜热酶的催化残基。来自嗜热Thermomyces lanuginosus的脂肪酶也已经被修饰为具有不同的目标。嗜热酶的体外化学修饰也被用来增强酶的稳定性。化学改性使用柠康酸酐。来自B. licheniformis嗜热β-淀粉酶中的10个赖氨酸残基。这种修饰用酸性基团取代了高pKa的氨基，大大改变了酶表面的净电荷。虽然稳定性在80 ℃下略有降低（蛋白质解折叠的∆G#降低了3.6 kJ mole−1），Lys修饰导致在25 ℃下催化活性提高了15倍。通过添加Ca 2+离子，可能通过在近端带负电荷的基团之间建立Ca 2+依赖性离子桥来改善稳定性。用聚（环氧乙烷）（PEO）修饰来自嗜热嗜酸泉古菌Sulfolobus tokodaii菌株7的细胞色素P450 。作者指出，与野生型酶相比，PEO修饰的细胞色素在PEO溶剂中的电化学响应是明确和稳定的：在300次使用后，野生型P450 st的峰电流降低到约5%，而PEO 2000-P450 st的峰高于初始响应的70%。在来自Thermus scotoductus的NAD+依赖性DNA连接酶的化学腺苷酸化中，辅因子的共价“锚定”诱导酶活性位点内的构象重排，伴随蛋白质结构的部分压缩。这种化学修饰增加了酶对热和胍诱导的变性的抗性，建立了辅因子结合和构象稳定性增强之间的热力学联系。据报道，来自热厌氧微生物的环糊精糖基转移酶（CDG）被乙酸酐酰胺化会影响酶的反应选择性。该酰胺化除去氨基的正电荷，并且在蛋白质的24个游离氨基中的大多数被修饰的条件下进行。这些酶催化四种不同的反应：环化、偶联（打开环糊精环并转移到受体）、纯化（将线性麦芽低聚糖转移到受体）和淀粉水解。乙酰化的CDG显示出其环化、偶联和缩合活性的显著降低，同时显示出改善的糖化活性。用聚乙二醇和氨基葡萄糖修饰来自Thermococcus菌株AN 1的β-葡萄糖苷酶。虽然前一种修饰对酶的稳定性几乎没有影响，但氨基葡萄糖修饰使酶在110 ℃下的活性半衰期提高了4倍。在稳定添加剂（山梨醇，硫酸铵）的存在下，化学改性显示出协同效应。在90%山梨醇的存在下，氨基葡萄糖修饰的酶表现出5分钟的活性半衰期，相比之下，小于2分钟的天然酶。用S-甲基异硫脲（未定量修饰程度）修饰来自Thermus aquaticus菌株T351的细胞外蛋白酶Caldolysin，以产生稳定的酶。有人提出，改性的侧链胍基团可能会增加分子内氢键。来自Thermus caldophilusGK 24的L-乳酸脱氢酶不仅具有极高的热稳定性，而且还表现出果糖1，6二磷酸（FBP）依赖性变构。在硼酸盐存在下，通过使用2，3-丁二酮修饰每个酶亚基的2,3种精氨酸中的6种或7种，产生了对果糖1，6-二磷酸脱敏的酶加合物。作者认为，该酶可能具有两类果糖-1，6-二磷酸结合位点，一类是对果糖-1，6-二磷酸具有高结合常数的激活位点，并含有高活性精氨酸残基，而另一类是对果糖-1，6-二磷酸具有低结合常数的抑制位点，可能位于活性中心（并负责竞争性抑制）。他们认为，当果糖-1，6-二磷酸结合位点中的精氨酸残基游离时，酶将无活性，而当残基与果糖-1，6-二磷酸相互作用或被化学修饰时，酶将被激活。蛋白酶是工业上最重要的酶之一，用于蛋白质的水解和肽的生产，并且已经报道了固定化嗜热蛋白酶的许多实例。Caldolysin是一种对金属螯合剂敏感的胞外蛋白酶，来源于Thermus aquaticus T351菌株，是第一个报道的嗜热蛋白酶固定化的例子。将酶固定在Sepharose 4B、CM纤维素和可控孔玻璃（CPG）上，具有良好的固定化产率，但比活性适度降低，这取决于所使用的支持物。对固定在溴氰活化琼脂糖4B上的酶的进一步研究表明，观察到的游离酶的底物抑制消失。所提出的机制涉及底物从“抑制位点”的空间排斥，而不显著干扰活性位点，这可能是第一次证明固定可以防止抑制。随后，将嗜热酶（一种来自普通Thermoactinomyces vulgaris的热稳定蛋白酶）共价固定在聚丙烯酰胺凝胶中。酶和凝胶基质之间的共价键数量估计为每个蛋白质4个，观察到的效应与这种多点连接有关。虽然固定化制剂保留只有20%的天然酶的比活性，最佳温度是大大高于游离酶。在68 ℃时，固定化的嗜热酶比该温度下的天然酶活性高10倍以上。将来自Thermus菌株Rt41A的细胞外蛋白酶固定在受控孔玻璃珠上。固定化导致酶在蛋白质和肽底物上的最适pH值大幅降低，但在80 ℃下在5至11的pH范围内增加了稳定性。稳定化主要归因于防止自溶（图7）。固定化酶也已用于二肽合成。糖聚合物的水解在高温下增强，这增加了底物溶解度并限制了微生物污染。这在Termamyl®（来自Bacillus licheniformis的热稳定淀粉酶）在淀粉的工业糖化中的广泛应用中特别明显。虽然不需要用于大批量工业应用，但B. licheniformis β-淀粉酶通过使用戊二醛共价固定到β-氨基丙基二氧化硅上而进一步稳定。几种嗜热木聚糖酶的固定化已有报道。将来自Thermotoga sp.菌株FjSS 3-B.1的木聚糖酶固定在多孔玻璃珠上，使其在95 ℃下的半衰期与90 ℃下的游离酶的半衰期相似。有趣的是，溶质如山梨糖醇和木聚糖增加了可溶性酶在超高温下的热稳定性（在90%山梨糖醇中在130 ℃下的半衰期，60分钟），但固定化制剂（半衰期，1.3分钟）没有增加。已通过包埋在褐藻胶中、通过共价固定在壳聚糖上以及通过离子键连接至Eudragit S-100来固定嗜热菌Lantarissus SSBP木聚糖酶。非共价连接的酶在Eudragit S-100上的活性最大，并且在70 ℃下显示出比游离酶更高的热稳定性，尽管在固定化酶的活性最佳pH值（6.5）下没有观察到变化。将几种固定化方案应用于来自嗜热篮状菌的木聚糖酶，其中最有效的一种（具有98.8%的产率和99.2%的木聚糖酶活性回收率）是使用明胶和戊二醛作为交联剂。固定化酶的最适pH值从7变为8，最适活性温度没有变化，并且在50 ℃下连续多次水解循环中保持稳定。该固定化酶制剂成功地应用于以麦麸半纤维素为底物的大规模连续生产木二糖。不同来源的木糖苷酶与木聚糖酶共固定化。嗜热菌的作用使木聚糖糖化的效率加倍，证明了两种酶的协同作用。由于底物的溶解度增加、果糖产率提高以及与上游酶消化单元操作的工艺兼容性，使用高温在糖的异构化中是有意义的[154]。在游离状态下，在不存在二价阳离子的情况下，来自Thermus aquaticus的d-木糖异构酶在70 ° C下以4天的半衰期失活。在阳离子的存在下，在相同温度下保持完全活性至少一个月。附着到环氧活化的琼脂糖和共聚集与牛血清白蛋白得到固定化的阳离子无酶制剂具有相同的稳定性作为补充Mn 2+或Co 2+的游离酶。这些结果表明，亚基解离（可通过固定或阳离子补充来防止）是观察到的失活的可能机制。来自超嗜热菌海栖热袍菌Thermotogamaritima和T. neapolitana 5068的木糖（葡萄糖）异构酶已经以游离和固定化的形式用于生产高果糖糖浆。在pH 7.0和Mg 2+存在下，T.Neapolitana酶的酶切温度高于100 ℃;来自T. maritima的酶在一定的失活条件下，可溶性形式的酶表现出多相失活特征，其中在快速初始下降之后，衰减速率显著减慢。然而，在共价固定到玻璃珠上之后，酶的失活的特征在于单相一级衰减速率介于可溶性酶的初始快速相和较慢相之间。在同时存在Co2+和Mg 2+的情况下，固定化酶制剂显示出在80 ℃下催化葡萄糖到果糖转化的能力，估计的寿命生产率为2000 kg果糖/kg酶，该值与目前在55-65 ℃下使用的酶相当，但具有更高果糖产物浓度的额外优势。在90 ° C下，估计Thermotoga neapolitana的酶的终生生产力为1000 kg kg−1 。通过与戊二醛和聚乙烯亚胺交联固定来自Thermoanaerobactermathranii的l-阿拉伯糖异构酶，并在65 ℃下用于从d-半乳糖生产d-塔格糖。使用30%g/mL的d-半乳糖溶液，d-塔格糖的产率为42%，并且没有检测到除d-塔格糖和d-半乳糖之外的糖。使用热稳定的β-半乳糖苷酶和热稳定的L-阿拉伯糖异构酶证明了在单个反应器中乳糖直接转化为塔格糖。这两种酶还成功地与市售的葡萄糖异构酶组合，用于将乳糖转化成包含乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖和塔格糖的增甜混合物。嗜热性氧化还原酶的固定化有许多实例。尽管由于NAD（P）辅因子的低热稳定性，不赞成使用非常高的温度，但嗜温氧化还原酶的低功能稳定性刺激了对更热稳定的同系物的研究。将来自极端嗜热嗜酸古菌Sulfolobus solfataricus的NAD+依赖性醇醛/酮氧化还原酶共价固定在Eupergit C（环氧树脂载体）上。将固定化酶用于3-甲基-2-丁酮的立体专一性还原，并在异丙醇存在下原位再生PEG-NADH。未报告酶稳定性或灭活率数据。使用氢化酶用分子氢直接还原辅因子可能为还原性生物转化中的辅因子再生提供了一种有吸引力的方法。利用循环伏安法将Pyrococcus furiosus的氢化酶I吸附到电极上。在进一步的实验中，氢化酶被吸附在石墨珠上，并用于在连续操作的流化床反应器中用分子氢将NADP+连续还原为NADPH。以甲基、辛基和十六烷基Fractosil为载体，采用疏水吸附法固定化了Thermoanaerobacter brockii乙醇脱氢酶。与游离酶相比，固定化酶的热稳定性增强，pH和温度最佳值均发生改变。类似地，将来自Thermus thermophilus HB27的醇脱氢酶共价固定在各种活化的载体上（用醛或环氧基团活化），其稳定因子（5- 10倍）与通过将酶离子吸附到聚乙烯亚胺涂覆的载体上获得的稳定因子相似。作者推荐优先使用离子吸附，其基础是吸附非常强，但该过程是可逆的，固定化方案快速，活性产率高，并且在有机溶剂存在下固定化酶比共价制备物更稳定（可能是因为溶剂与酶环境的负分配）。该制备用于苯乙酮的不对称还原以产生（S）-（−）-1-苯基乙醇，对映体过量超过99% 。来自嗜热栖热菌的谷氨酸脱氢酶是一种同源三聚体，其催化谷氨酸可逆氧化为β-酮戊二酸和氨，其中NAD+或NADP+作为辅因子（或NAD（P）H用于还原），并且已提出用于还原和氧化辅因子的再生。由于其三聚体性质，低pH失活是通过酶亚基的解离触发的;在亚基解离的情况下，酶是非常稳定的，导致选择这种酶作为研究寡聚酶中亚基解离过程的模型系统。在标准条件（pH 10）下，固定在乙醛酰琼脂糖上可增强酶的稳定性，即使在解离不是灭活第一步的条件下也是如此。这种酶也被用作一个模型，耦合固定化和纯化的多聚体酶从嗜热微生物克隆在嗜温宿主。其中一种策略是在中性pH值下固定在乙醛氧基载体上。在乙醛酰载体上的第一次固定需要建立几个同时的酶载体连接。在中性pH值下，这是不可能的，除非酶具有几个末端氨基（pK 7-8）。应当认为，在嗜温宿主中克隆的多聚体嗜热酶是在热冲击后保持其四级结构完整的唯一多聚体蛋白质，因此这些蛋白质提取物的特异性固定化应当允许多聚体嗜热酶的纯化。谷氨酸重组Thermus thermophilus谷氨酸脱氢酶，在大肠杆菌中表达。在pH 7下，将大肠杆菌的蛋白质共价固定在乙醛酰载体上，证明了能够通过防止亚基解离进行单步纯化、固定和稳定的方案的有效性。通过离子交换的固定是一个多点过程：已经证明，低电荷密度离子交换剂只能吸附可以与宽间距离子基团相互作用的大蛋白质。使用含有环氧基团的异官能支持物（不会以显著的速率使蛋白质变性）和在支持物上产生酶离子交换所需的最低量的氨基，使用重组T. thermophilus谷氨酸脱氢酶作为一步纯化（通过选择性离子交换）和固定化-稳定化（通过在环氧基团上的多点共价连接）的模型，使用这种定制的支持物。研究发现，最稳定的酶制剂是通过在pH 7下固定在乙醛酰琼脂糖上，然后在pH 10下制备的酶制剂。
从牛奶中去除乳糖是为乳糖不耐受人群生产奶制品的一个要求，以防止在某些奶制品生产过程中乳糖沉淀（例如，冰淇淋），以加速发酵，并在乳品乳清中，改善其作为发酵介质用途。这些方法利用了β-半乳糖苷酶的催化特异性。这组酶也可用于合成低聚糖。在牛奶中乳糖的水解中使用适度高温可有效减少微生物生长，甚至提供了将加热灭菌与乳糖去除相结合的前景。因此，游离的和固定化的嗜热β-半乳糖苷酶的性质受到了相当大的关注。将来自嗜热厌氧菌菌株NA 10的热稳定β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）共价固定到多孔陶瓷载体SM-10上。在测试的不同固定化方案中，当用戊二醛活化的3-[2-（2-氨基-乙氨基乙氨基）丙基]三甲氧基硅烷将酶共价固定到硅烷化的SM-10上时，在70 ℃孵育3 h后获得最高的残余活性。酶的性质几乎相同的游离酶。在巴氏灭菌温度（65 ℃）下，固定化酶的半衰期估计约为450 h。该酶也通过戊二醛交联固定化，但功能稳定性较低。作者认为，稳定性较低是由于载体表面存在残留的游离醛基引起的。通过共价连接将来自真菌Talaromyces thermophilus CBS 236.58的β-半乳糖苷酶固定到Eupergit C上，结合效率为95% 。固定化增加了酶的活性和稳定性，在高pH值和升高的温度下，与游离酶相比。例如，在50 ℃下，游离酶和固定化酶的半衰期值分别为8小时和27小时。从使用20%乳糖作为底物的生物转化实验中可以明显看出，固定化酶显示出很强的转半乳糖基化活性，导致形成感兴趣的低聚半乳糖（优化后为34%）。将Sulfolobus solfataricus的β-糖苷酶固定在用戊二醛活化的壳聚糖上，产率为80% 。与游离β-葡萄糖苷酶相比，固定化酶显示出相似的最适pH值（pH7.0）和温度-活性曲线（高达80 ℃）。然而，固定化酶更耐热，并且不受葡萄糖抑制。固定在Eupergit C上的来自Pyrococcus furiosus的极耐热β-糖苷酶已用于以乳糖为底物生产寡糖。该酶的高稳定性使得可以在高反应温度下操作并增加底物浓度。随后水浓度的降低降低了有利于转半乳糖基活性的水解速率，并提高了寡糖产率。然而，注意到使用非常高的温度促进通过美拉德反应形成棕色色素，并且这些色素加速酶的失活速率。这个问题没有通过酶固定化来解决。开发了一种微流体反应器，用于在80 ℃下用来自Pyrococcus furiosus固定化超嗜热β-糖苷水解酶（CelB）进行连续流生物催化转化。通过与戊二醛交联到氨基硅烷化的微结构化表面上进行共价蛋白质附着。而酶KM是不变的，乳糖水解的活化自由能从72 kJ/mol的游离酶中的38 kJ/mol的固定化酶。通过树枝状聚合物接头将酶共价连接到微通道壁上恢复了原始的Ea值。固定化酶微反应器用于在80 ℃下连续转化100 mM乳糖，并在60%的稳定底物转化率下操作5天。在使用微结构化流动反应器对该酶进行的进一步研究中，在用氨丙基三乙氧基硅烷官能化的α-氧化铝上进行固定化，然后用戊二醛活化。该反应器用于乳糖（100 mM）在80 ℃下的连续水解，时空产率为500 mg葡萄糖/（mL h），转化率稳定在≥ 70%。固定化酶在操作条件下的半衰期为15天。来自Thermus sp.菌株T2的乳糖酶是一种四聚体酶，已用于开发新的固定化稳定策略。将酶固定在各种异功能环氧载体上，环氧-硼烷载体产生具有最高稳定性的制剂。最佳衍生物在70 ℃下对乳糖底物具有高度活性（超过1000 IU/g），在这些条件下长时间孵育后仍保持其活性。该酶通过离子交换在涂有离子聚合物的载体上进行可逆固定，如聚乙烯亚胺、天冬氨酸葡聚糖和硫酸盐葡聚糖。在所有情况下，获得了强结合但不变形的固定化产物，适合在广泛的条件下应用，而没有酶解吸的显著风险。Thermus乳糖酶的大尺寸允许通过多个连接吸附，使这种酶的可逆固定化，纯化和预防亚基解离在非常严格的条件下的战略发展的一个很好的模型。例如，高度活化的IMAC支持物已用于在50 mM咪唑存在下选择性地吸附酶，而在1 M NaCl存在下，它也与高度活化的阴离子交换剂结合。将Thermus T2 β-半乳糖苷酶以His标记的嵌合蛋白的形式选择性固定并纯化在环氧-亚氨基二乙酸-Co2+基质上。该策略基于环氧化物不能直接吸附可溶性酶，但亚氨基二乙酸-Co2+将选择性吸附聚组氨酸标记的蛋白质。即使使用粗提取物，也实现了非常高的酶负载。考虑到蛋白质与异功能载体的物理和共价连接的协同效应，最近已经表明，使用具有低氨基密度的新型环氧-乙醛氧基-氨基载体可以实现大型Thermus T2 β-半乳糖苷酶的协同单步固定化-纯化稳定化。固定化制备的Thermus T2 β-半乳糖苷酶已经成为乳糖水解中许多动力学研究的主题。例如，通过其伯氨基固定在用三羟甲基膦活化的载体上的酶显示出降低的酶活性，但增加了稳定性。游离酶和固定化酶都被半乳糖竞争性抑制，半乳糖在固定化制备中减少了50%。仅观察到游离酶的葡萄糖抑制。也有报道称，在杂官能环氧载体上的固定化大大降低了这种抑制。在5%乳糖的水解中，使用游离酶的产率仅为90%，而使用固定化酶产生定量产率。豆浆是一种营养饮料，通常可以替代牛奶，特别是对于婴儿来说。使用β-半乳糖苷酶水解不可消化的β-低聚糖（例如棉子糖），而不改变豆乳的任何其他营养成分，提供了一种增强其商业用途的方法。来自Thermus sp.菌株T2的稳定β-半乳糖苷酶已使用乙醛氧基、环氧基或戊二醛基团活化的载体共价固定。在所有情况下，获得非常活跃的生物催化剂，并获得最高的功能稳定性，使用戊二醛活化的支持。如果先将酶吸附到胺化载体上，然后用戊二醛处理，则稳定性提高。该制剂在pH 7和75 ℃下48 h后保留90%的初始活性，而可溶性酶在类似条件下仅8 h后就完全失活。在增强热稳定性的同时，固定化将活性的“最适”温度从65 ℃（可溶性酶）提高到70 ℃。将酶可逆地固定在涂有聚乙烯亚胺或硫酸葡聚糖的载体上也诱导了一定的稳定性。β-葡萄糖醛酸酶在纤维二糖的水解（在纤维素的降解中）和β-葡萄糖衍生物的生产中具有潜在的应用。这些酶的固定化的实例包括Pyrococcus furiosus β-葡糖苷酶的共价衍生物的制备，以及它们在转葡糖基化中的应用，使用伯和叔有机醇和仲人工有机硅醇作为糖苷配基，纤维二糖作为葡萄糖供体。酯酶和脂肪酶是生物催化中最广泛使用的酶之一，部分原因是它们具有广泛的底物特异性和区域或对映体选择性。对这组酶的兴趣反映在过去2-3年中发表的大量关于这些酶及其应用的综述论文中。在嗜热脂肪酶中，最常用的（可能是由于其广泛的商业可用性）是来自真菌Thermomomobacter lanobacterosus的脂肪酶。这种酶已经被固定在不同的材料上，但由于这项工作最近才被审查，因此在此不作介绍。已经报道了来自芽孢杆菌属的嗜热代表的许多脂肪酶和酯酶。这些属的许多成员最近已被重新分类为Geobacillus, Axoxybacillus等，但在这里我们使用的术语芽孢杆菌。在存在和不存在0.1% Triton X-100的情况下，通过吸附在多孔聚丙烯（Accurel EP-100）上固定Bacillus thermoleovorans CCR 11脂肪酶。固定化增加了酶的热稳定性（游离酶在70 ℃孵育1小时后恢复的活性低于固定化酶在90 ℃的活性），并降低了短链酯底物的比活性（例如，用C6，降至25%），但不改变最适pH。将来自未鉴定的thermophilic Bacillus的脂肪酶固定在不同的固体载体上并用于酯化反应。将酶吸附在二氧化硅和HP-20珠（疏水支持）上，然后在HP-20上与戊二醛交联。该方法提高了酶的热稳定性：固定化酶的最适温度提高了近5 ℃，而在70 ℃时，固定化酶的半衰期比游离酶提高了近2.5倍。将凝固Bacillus coagulans脂肪酶固定化于硅胶上，用于酯化反应。固定化显著增强了热稳定性，乙醇和丙酸的酯化在55 ℃下12小时内产生的反应产率超过95%。有几个已发表的固定化来自不同B. stearothermophilus的酶的例子。嗜热脂肪菌，一种众所周知的中度嗜热菌。通过多点共价连接将来自该生物体的酯酶固定于乙醛酰琼脂糖。固定化条件优化后，酯酶制剂的稳定性增加了600倍（取决于pH值），当与单点共价衍生物相比时，多点共价连接后保留了65%的初始活性。多点共价连接的酯酶衍生物在30 ℃下在50%DMF或DMS中1周后保留超过70%的初始活性。这种结构稳定化在各种变性条件下（例如，在高浓度氯化钠和有机溶剂的存在下）。中链（C8）脂肪族对硝基苯基酯底物，其包裹可溶性酶，被证明更容易被固定化酶水解。一株B. stearothermophilus的耐热脂肪酶。嗜热脂肪菌MC 7通过不同技术固定化。发现最有利的固定化方法是在DEAE纤维素上进行离子交换。研究最多的嗜热芽孢杆菌Bacillus脂肪酶可能是来源于B. thermocatenulatus脂肪酶。SchmidtDannert及其合作者于1994年首次描述。作者发现，脂肪酶几乎不可逆地结合在各种色谱基质上，例如Amberlite和Serolite，并且以这种形式非常稳定。酶的结构最近已被解析，显示出覆盖活性中心的不寻常的双“盖子”结构。复杂的构象变化涉及从封闭形式到开放形式的转变。已经产生了该脂肪酶的各种固定化形式，并且证明了功能特性可以通过固定化来调节，但是完全功能性保持在固定状态。酶被强烈吸附在疏水载体上，固定化制剂表现出超活化和稳定性。在65 ℃下，固定化在十八烷基-Sepabeads上的。B. thermocatenulatus脂肪酶在数天后仍保持100%的初始活性该酶也被用作中性pH下乙醛酰载体上酶固定化的模型，其中硫醇化合物被用于稳定亚氨基化学。来自其他微生物来源的嗜热脂肪酶也被固定化。例如，将来自thermophilicRhizopus oryzae的脂肪酶固定到各种基质（Duplant、Celite和Amberlites）上，选择Amberlite IRC 50作为最合适的吸附剂。在有机介质中重复使用固定化脂肪酶在30 ℃环己烷中用正己醇水解等摩尔量的油酸三周，导致合成活性下降18%。相比之下，水解三辛酸甘油酯的能力在同一时期下降了80%。水性介质中的酶泄漏（但不是在无水介质中）可能是这些结果的解释。Thermus thermophilus和T. aquaticus将水生细菌固定在十辛基-Sepabeads上，产生在中温温度下具有10倍增强活性和增加功能稳定性的制剂。作者推测，在中温温度下增加的活性可能是由于脂肪酶保持在其开放形式，并且构象活化的要求可能解释了天然酶在低温下的低活性。文献中报道了许多其他嗜热酶的固定化实例。例如，来自B. stearothermophilus的固定化d-乙内酰脲酶。嗜热脂肪菌用于从D-L-5-（4-羟基苯基）乙内酰脲生产N-氨基甲酰基-D-P对羟基苯基甘氨酸。采用吸附法将海因酶固定在不同载体上，发现DEAE-纤维素树脂的固定化效果最好，酶活回收率>90%。在55 ℃和pH 9.0下，生产速率在9次连续操作中保持恒定。ATP合酶来自B. stearothermophilus将嗜热脂肪菌包封在脂质体中，然后将其固定在多孔玻璃珠上。该固定化酶与来自E. 2.6.1.19大肠杆菌用于从其非手性2-酮酸前体2-氧代-4- [（羟基）（甲基）膦酰基]丁酸生产1-膦丝菌素[1-高丙氨酸-4-基（甲基）次膦酸]。将来自B stearothermophilus的固定化天冬氨酸转氨酶与来自E. 2.6.1.19大肠杆菌用于生产l-膦丝菌素[l-高丙氨肽-4-基-（甲基）次膦酸] 。邻苯二酚2，3-双加氧酶（EC 1.13.11.2）来自B.stearothermophilus。已将嗜热脂肪菌固定在高度活化的乙醛酰琼脂糖上。固定化条件优化后，固定化儿茶酚2，3-双加氧酶的稳定性基本上不受蛋白质浓度的影响，而游离酶在低蛋白质浓度下迅速失活。固定化增加了酶的温度，在20 ℃时达到最大活性，在可溶性酶完全失活的底物浓度下保持活性，并增强了催化过程中对失活的抵抗力。这些变化归因于构象硬化和酶亚基解离的阻止。Thermoanaerobacter sp.环糊精葡糖基转移酶的研究共价结合在Eupergit C上。固定化环糊精葡聚糖基转移酶与可溶性环糊精葡聚糖转移酶的最适温度(80~85℃)和pH(5.5)相近，但pH值越高，固定化环糊精葡聚糖转移酶的pH谱越宽。固定化酶在95℃时的半衰期是可溶酶的5倍。固定化酶的选择性(由环糊精与低聚糖的比例决定)向低聚糖生产转移。固定化酶还用于以淀粉和蔗糖为原料合成麦芽寡糖基呋喃果糖，产率达80%以上。用不同的载体和固定化方法固定化了环糊精的葡萄糖转移酶，其中乙氧基琼脂糖固定化的活性和稳定性最高。固定化率接近100%，活力回收率约为32%。在85℃下，该生物催化剂能够以比可溶性酶更快的速度从糊精或可溶性淀粉(均为1%(w/v))中合成环糊精(CDs)。此外，该生物催化剂在85℃下反应5h后仍保持90%的初始活性。来自Thermus thermophilus的无机焦磷酸酶（Pyr）与肺炎球菌LytA自溶素的胆碱结合结构域的C末端融合，通过在高离子强度下在DEAE-纤维素上的亲和吸附选择性固定和纯化。将来自Thermus thermophilus HJ 6的热稳定海藻糖合酶固定在用戊二醛活化的壳聚糖上（40%活性回收率）。游离酶和固定化酶在70 ℃下的半衰期分别为5.7天和6.3天。通过在聚丙烯酰胺凝胶中包埋，并在4 ℃下共价结合于Euper git C珠和Amberlite-XAD 57上，固定化来自Geobacillus pallidus RAPc的酰胺酶。每个过程产生低蛋白结合和低活性。然而，在25 ℃下交联固定在Eupergit C珠上导致高蛋白结合产率和高固定比活性（80%）。pH范围有所扩大，稳定性增强（在60 ℃时增加6倍）。在Eupergit C上固定化并与酶的1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）碳二亚胺交联的制剂显示出底物抑制降低（抑制常数增加2倍）。来自Thermotoga maritima的嗜热二鸟苷酸环化酶通过使用甲基三甲氧基硅烷的溶胶-凝胶技术固定化，用于环状二GMP的酶促生产。将来自芽孢杆菌属嗜热菌株的漆酶固定在玻璃碳电极上用于生物燃料电池应用。通过电化学还原原位生成的氨基苯基重氮盐的玻碳电极功能化。漆酶修饰电极的最佳操作温度为45-50 ° C，催化活性可稳定至少7周。来自Thermus thermophilus strains HB 8和HB 27的过氧化氢酶已被固定在几种载体上，最稳定的制备物是使用乙醛酰琼脂糖获得的。然而，固定化酶衍生物的稳定性依赖于酶浓度，这表明亚基的解离可能在酶制剂的失活中起着关键作用。这种酶的CLEA的产生防止了这种解离，大大提高了酶的操作稳定性。小型化流动反应器技术的发展为工艺开发提供了一种具有成本效益的方法。已成功地固定在小型化的流动反应器通道，无论是通过直接绑定到整料或通过捕获的交联酶的熔块上的氨基酰化酶从Thermococcus litoralis。类似地，将来自Sulfolobus solfataricus MT4的（+）-β-内酰胺酶的交联酶聚集体固定在毛细管柱微反应器内。嗜热（+）-内酰胺酶在80 ℃测定温度下保持6 h的初始活性为100%。在另一个例子中，已经开发了含有来自Thermococcus litoralis的整体固定化L-氨基酰化酶的微反应器用于生物转化反应，并且已经进行了一项研究来调查固定化酶的立体特异性和稳定性。固定化嗜热蛋白具有广泛的应用前景。例如，从Synechococcus vulcanus中分离的铁氧还蛋白已被固定在CNBr-琼脂糖凝胶，并用于纯化菠菜叶绿体中的铁氧还蛋白依赖性酶。类似地，Thermococcus菌株KS-1伴侣蛋白与异源嗜温和嗜热酶的共固定已用于增强酶稳定性。设计了一种新的自复性酶-伴侣嵌合体，由青霉素酰胺酶和嗜热伴侣蛋白组成，在含水有机混合物中发挥作用。嵌合体结构的设计包括酶和伴侣之间的柔性接头和添加的几丁质结合结构域以促进嵌合体固定到几丁质支持物。固定化嵌合体在甲醇水溶液中合成阿莫西林的生产率在95 h时比缺乏伴侣结构域的固定化青霉素酰胺酶高2.8倍。嗜热蛋白结合域也被用来固定蛋白质。构建了含有乙醇酸Thermoanaerobacter ethanolicus乳糖酶和纤维素结合模块CelD两种不同模块的融合蛋白的重组表达载体，并在大肠杆菌中表达。编码CelD结构域的模块导致融合蛋白强烈结合到纤维素载体上，使该构建物能够在高温下用于连续流动系统中的乳糖水解。超嗜热酶（来自Pyrococcus furiosus）与来自嗜温Clostridium cellulovorans的碳水化合物结合结构域的融合提供了一种用于产生具有温度敏感性可逆固定化的稳定生物催化剂的优雅方法。重组融合酶在80-90 ℃下以游离形式具有活性，但在30-40 ℃下通过亲和吸附固定在纤维素上。这两种模式之间的温度转换很窄，发生在40-50 ℃的范围内。该系统可用于回收用于生物转化非常大或不溶性底物的酶。由于其高储存和操作稳定性，嗜热酶已被广泛考虑用于生物传感器。在传感器设计中，酶通常被固定，使得信号在紧邻换能器的位置产生。来自B. stearothermophilus的β-葡糖苷酶和葡糖激酶。嗜热脂肪菌已被用于设计离子敏感场效应晶体管β-葡萄糖苷传感器。通过将L-谷氨酸脱氢酶固定在碳糊电极中，用聚乙烯亚胺甲苯胺蓝O氧化还原聚合物介体和乳糖醇/DEAE葡聚糖稳定系统制备电流型L-谷氨酸传感器。酶稳定性足够高，使得电极的物理稳定性（不是酶稳定性）是选择分析温度的限制因素。由“双层包封”诱导的来自热硫化氢梭菌的乳酸脱氢酶的稳定性高达12.8倍（在70 ° C下）。相反，乙酸激酶在类似条件下不显示稳定性。这两种固定化酶用于流动注射分析系统中测定L-乳酸或乙酸。一种来自B. stearothermophilus的细胞内心肌黄酶。固定在Immobilon亲和膜上的嗜热脂肪菌在0.1至1000 μ mol L−1的NADH分析范围内可操作，检测限（LoD）为0.05 μ mol L−1 NADH。将心肌黄酶与不同的脱氢酶共固定化，可以构建葡萄糖（LoD 0.5 μ mol L−1）、乙醇（LoD 1.0 μ mol L −1）、乳酸（LoD 1.0 μ mol L−1）和β-羟基丁酸（LoD 0.5 μ mol L−1）的电流传感器。来自B. stearothermophilus的乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）的六组氨酸标记变体。将嗜热脂肪菌固定在聚（苯胺）-聚（丙烯酸酯）（PANi-PAA）或聚（苯胺）-聚（乙烯基磺酸盐）（PANi-PVS）复合膜上。C末端和N末端标记的酶都很容易固定在聚合物电极上，并催化乳酸盐和NAD+转化为丙酮酸盐和NADH。N-和C-标记的酶膜均显示出比野生型更高的NADH依赖性电流输出。光系统复合体的固定化可能是嗜热酶作为生物传感器最复杂的应用之一。这种电极适合作为检测光系统II抑制剂类除草剂的生物传感器。例如，Synechococcus bigranulatus的光系统II通过一层聚对苯二酚(PolySBQ)物理吸附在金电极上，提供了一种无介体的电子传输机制。固定化光系统的稳定性与自由光系统相当。固定化（透析膜截留）光系统II从S.elongatus已被用于检测残留的三嗪类、脲类和酚类除草剂。除草剂的检测是基于这样的事实，即在人工电子受体的存在下，光诱导的电子转移通过孤立的光系统II颗粒伴随着释放的氧气，这是抑制除草剂的浓度依赖性的方式。该系统产生了一种可重复使用的除草剂生物传感器，具有良好的稳定性（在25 ° C下使用35小时后仍保留50%的初始活性）和高灵敏度（敌草隆的检测限为5 × 10 - 10 M）。将来自相同来源的光系统II固定在丝网印刷传感器的表面上，该传感器由沉积在聚合物基底上的石墨工作电极和Ag/AgCl参比电极组成。该传感器具有良好的稳定性（半衰期为24 h），对敌草隆、莠去津和西玛津的检测限较低（约为0.001 μ M），可重复使用。其他实例包括使用来自东京Sulfolobus tokodaii的固定化脱卤酶检测卤代有机化合物或使用来自G. stearothermophilus固定在金电极上的嗜热脂肪菌。3.同时利用化学修饰和固定化来改善嗜热菌产酶的性质固定化和化学修饰的耦合使用已成功地用于优化嗜热生物催化剂的性能。Thermus thermophilus菌株HB 8和HB 27过氧化氢酶在固定于乙醛酰琼脂糖上时是热稳定的，但仍会发生亚基解离和活性丧失。固定化酶与葡聚糖的进一步交联阻止了这一过程，产生了在广泛条件下高度稳定的酶制剂。在将Thermus菌株T2 β-半乳糖苷酶固定在硼酸酯环氧-Sepabeads上的情况下，酶活性非常稳定，但在某些条件下仍释放蛋白质亚基。鉴于这种酶在食品制备中的使用，蛋白质“污染物”的释放被认为是不可接受的。虽然用完全氧化的醛葡聚糖处理诱导酶失活，但用部分氧化的葡聚糖处理产生稳定的四级结构，在修饰后保留超过80%的酶活性。固定化嗜热酶的化学修饰已被用于改变催化行为。例如，T. lanuginosus用乙二胺和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺对固定化脂肪酶进行了部分胺化。这种处理提高了外消旋扁桃酸甲酯水解中的酶活性和对映体特异性。B. thermocatenulatus脂肪酶的活性位点Cys 64残基。将固定在溴化氰-或甘油-琼脂糖珠上的热小链菌脂肪酶用吡啶基二硫化物聚胺化葡聚糖或吡啶基二硫化物单羧化聚乙二醇进行位点特异性修饰。虽然改性衍生物的活性强烈依赖于固定化制剂，但在许多情况下活性得到增强。修饰的酶与不可逆抑制剂的反应比未修饰的酶快得多，这一事实表明化学修饰可能稳定了脂肪酶的开放形式。来自B. thermocatenulatus and T. lanuginosus的脂肪酶通过在辛基-琼脂糖上的界面活化可逆地固定，使用乙二胺和1-乙基3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺完全胺化，从载体上解吸，然后共价固定在乙醛酰琼脂糖上。该方案增加了蛋白质表面上的反应性氨基的数量，并促进多点共价连接。引入的氨基的pK值约为9，使得可以使用比标准固定化方案中典型的更低的反应pH。这些非常活跃和稳定的生物催化剂在生物柴油生产中表现出增强的性能，可选择进行多次酶失活/再活化循环。类似地，来自T.通过用聚乙烯亚胺处理嗜热菌促进经由离子交换的固定化。聚乙烯亚胺-酶复合物经离子交换吸附后，用戊二醛交联，防止酶亚基解离。
本文综述了利用固定化和化学修饰等酶技术手段来提高稳定的嗜热酶的性能的可能性。
随着新分类群的不断分离以及宏基因组研究中基因和基因组序列的日益可用性，对嗜热生物酶学的兴趣预计将继续下去。还预测，无论是否采用化学或遗传工程，这些基因产品的开发仍将是日益增长的全球生物技术工业的一个重点领域。鉴于这一情况，有必要考虑瓶颈和限制仍然存在的地方。一个远未完全解决的问题是有效和可靠的表达（特别是嗜热酶基因在异源宿主中的超表达）。虽然这不是一个可以使用酶技术工具解决的问题，但它仍然是嗜热酶的商业实施的限制。尽管被认为是成熟的技术，具有改善酶特性的能力，但这些技术可以进一步增强，特别是在固定化化学的精细控制方面。大多数固定化过程远非随机的，可以通过理解决定蛋白质在载体上的取向和酶-载体相互作用程度的变量来实现对酶固定化的控制。这可以通过开发定制的异功能支持物来实现，该支持物与定点诱变相结合，将促进工业酶的位点特异性固定化和刚性化。尽管在设计这种载体方面已经取得了一些进展，并且靶向酶工程技术已经很好地建立，但是将两者结合用于制备下一代固定化酶产品仍然是一个未解决的问题。在许多已发表的嗜热酶固定化的例子中（表1），酶的稳定性是低优先级的，其他因素，如比活性和催化特异性。本文综述的研究表明，适当设计的固定化方案可用于解决这些稳定酶中的其他功能问题（如底物或产物抑制和酶选择性）。在其他情况下，酶已经呈现出所需的性质。对于这些情况，应应用极其简单、温和和廉价的固定化方法（例如，可逆吸附）。化学改性是固定化生物催化剂设计中的附加步骤，其中成本和附加反应步骤必须与工艺收益相平衡。为了充分利用这项技术，需要更具体的化学试剂，真正设计用于对酶（修饰，交联）产生某些期望的效果。这可以进一步刺激设计和制备更有效的生物催化剂或生物传感器，并进一步增加嗜热（和其他）生物催化剂的工业应用。这些修饰的工业性能，应受益于固定化酶的修饰的设计，正如我们在这篇评论中所述。当需要游离酶时，只有设计出与化学修饰相容的可逆固定化方法（即，设计成经受化学修饰但可允许释放经修饰的酶的固定化），才能实现其全部优点。迄今为止，疏水载体上的脂肪酶疏水吸附似乎是唯一解决的情况，甚至这对所有类型的修饰都不是有效的。因此，在这篇评论中提出的所有策略的综合发展需要实际解决工业中酶的问题，但解决方案似乎每天都在接近。
原文：Enhancing the functional properties of thermophilic enzymes by chemical modification and immobilizationDOI: https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2011.06.023
