《J. Agric. Food Chem.》耐辐射奇球菌海藻糖合成酶的结构和突变分析揭示了麦芽糖-海藻糖的相互转化机制
文摘
科学
2024-08-16 22:36
江苏
2024年7月，来自国立阳明交通大学的Li-Ci Ye和Sih-Yao Chow等人在J. Agric. Food Chem.上发表了一篇题为Structural and Mutational Analyses of Trehalose Synthase from Deinococcus radiodurans Reveal the Interconversion of Maltose−Trehalose Mechanism的研究性论文。
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通讯作者：Li-Ci Ye; Sih-Yao Chow通讯单位：Department of Seafood Science, National Kaohsiung University of Science and Technology, Kaohsiung, Nanzih District 81157, Taiwan海藻糖合成酶(TreS)催化麦芽糖向海藻糖的可逆相互转化，在海藻糖生产中起着至关重要的作用。了解TreS的催化机理对于优化酶的活性和提高其工业应用的适用性至关重要。在这里，我们报道了耐辐射奇球菌海藻糖合成酶野生型和E324D突变体与海藻糖类似物井冈霉素A复合物的晶体结构。通过结构引导突变，确定了N253，E320和E324是+1亚位点中异构酶活性的关键残基。基于这些复杂的结构，提出了麦芽糖可逆转化为海藻糖的催化机理。这些发现极大地促进了我们对TreS反应机理的理解。![]()
海藻糖是一种非还原性的双糖，由两个葡萄糖分子通过一个1,1-糖苷键连接而成。在生物系统中，它扮演着多种至关重要的角色，例如作为碳和能量来源，细菌细胞壁的结构成分，信号分子以及在寒冷，脱水和高温等环境胁迫下的保护剂。海藻糖由于具有保护能力、稳定性和低反应性，被广泛应用于各个行业。例如，在食品工业中，它被用作食品添加剂，以增强食品的风味和稳定性。在医学应用中，海藻糖可以有效地保存器官和组织以供移植。
尽管其广泛的适用性，海藻糖的生产成本仍然相对较高，这促使研究更有效的生物合成过程以降低生产成本。工业上生产海藻糖最常用的方法是双酶法，即利用麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶将麦芽寡糖或淀粉转化为海藻糖。当使用淀粉和麦芽糊精作为底物时，该方法的转化率可达80%以上。然而，当使用支链淀粉和麦芽糖时，海藻糖的生产效率下降。单酶法可以克服这一局限性，直接利用海藻糖合成酶(TreS)实现海藻糖和麦芽糖的相互转化，而不需要辅酶(图1)。
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图1.DrTS催化麦芽糖与海藻糖的相互转化。DrTS; 耐辐射球菌海藻糖合成酶。
TreS属于糖苷水解酶家族13 (GH13)，由一个催化(α/β)桶作为中心核心和一个C端β-三明治结构域组成。迄今为止，已经有5个TreS被结构表征。基于结构和序列分析，耐辐射奇球菌([DrTS], PDB ID:4TVU)的TreS与耻垢分枝杆菌(PDB ID: 3ZO9, 54.9 %同一性)、结核分枝杆菌(PDB ID:4LXF ,同源性为55.7 %)、土生热杆菌(PDB ID:5X7U ,同源性56.8 %)和嗜热放线菌(PDB ID:5H2T ,同源性57.4 %)的TreS具有较高的同源性。来自这些生物的TreS具有高度的序列和结构相似性，并且具有相似的催化机制，涉及与共价糖基酶中间体的双重置换。然而，由于对TreS复杂结构的现有知识有限，麦芽糖和海藻糖相互转化的分子机制仍未得到解决。进一步阐明这一过程对于更全面地了解海藻糖的合成是必要的。在这里，我们阐明了来自D. radiodurans的TreS和E324D突变体与有效氧胺A（VAA）复合物的结构。通过分析这些复合物结构，我们确定了N253和E324是+1亚位点中维持海藻糖构象的关键残基。此外，结合N253突变体的结构分析和饱和突变分析，提出了麦芽糖和海藻糖相互转化的分子机制。这些发现加深了对TreS催化机理的理解，为进一步研究TreS的工程化应用奠定了基础。
使用类似的条件对rec-WT和突变体蛋白进行蛋白纯化。从1 L LB培养基中可获得约20-30 mg的DrTS蛋白。通过SDS-PAGE验证蛋白纯度后，对蛋白进行定量，4 ℃下进行活性分析。对于用于结晶的rec-WT和突变体蛋白，透析缓冲液改为20 mM HEPES (pH 7.5)，100 mM NaCl，1 mM二硫苏糖醇。透析后，使用凝胶过滤来增强蛋白质的均一性。收集含有重组DrTS蛋白的组分，进一步浓缩至终体积为100-250 μL。WT和突变蛋白均表现出稳定性，并随后用于结晶和活性分析。有研究表明，在海藻糖存在的情况下，VAA是TreS的竞争性抑制剂。在这项研究中，在VAA的存在下，二元DrTS-VAA复合物晶体的衍射分辨率为2.83 Å。DrTS-VAA的晶体结构符合P212121空间基团，每个不对称单元容纳2个DrTS二聚体。DrTS的溶液SAXS分析表明其在溶液中以二聚体形式存在。每个DrTS原聚体由一个催化(α/β) 8桶构成中心核心，并伴有C末端的β -三明治结构域(图3A )。VAA被深深地容纳在由亚结构域B和催化核心结构域组成的口袋中。VAA与DrTS的结合涉及两个C7-环醇单元上的所有羟基(OH)。具体来说，-1位的C7-环醇单元与Y66堆叠，而C7-环醇的O2与R207，D209，E251，H318和D319形成氢键。环醇的O3与H318和D319相互作用紧密，O4与D63和R398形成氢键，O6与H106和Q177形成氢键。非糖苷C-N键的N原子与E251OE1相互作用。在+1位的C7-环醇单元中，O2和O3与E320紧密接触，O7与E324和N253形成氢键(图3B )。![]()
图3. (A) DrTS−VAA结构。该蛋白由a (α/β)8桶(红色)、子结构域B(蓝色)、结构域C(青色)和两个ts特有模块(绿色为S7，黄色为S8)组成。(B) VAA和DrTS之间的相互作用网络。VAA以wheat表示。氢键用黑色虚线表示。模拟退火后的Fo−Fc省略图在3σ水平上轮廓化。DrTS;耐辐射球菌海藻糖合成酶;VAA，有效氧基胺A。
Apo与复合物结构的比较表明，VAA的结合没有导致构象变化，这表明活性位点在闭合构象中组织良好。海藻糖与VAA在结构上的相似性可能解释了DrTS-VAA复合物结构与海藻糖结合的相似性。值得注意的是，N253，E320和E324被认为在海藻糖结合以及麦芽糖和海藻糖的相互转化中起着至关重要的作用。DrTS-VAA复合物的结构分析揭示了N253在海藻糖结合和葡萄糖旋转中的潜在意义。为了验证N253的功能，构建了N253的饱和突变体文库。结果表明，只有4个突变(N253C、N253A、N235L和N253D)保留了异构化活性。其中，N253C保留了约40%的海藻糖产量，而N253A、N253L和N253D保留了约5-10%的海藻糖产量。相反，其他N253突变体表现出完全丧失异构化活性。有趣的是，N253C、N253A、N253L、N253Q和N253D的水解活性增强，而其他14个突变体的水解活性与WT相似。重要的是，只有N253R的异构化和水解活性完全丧失(表1)。表1. DrTS +1亚位突变对异构酶和水解酶活性的影响。
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为了阐明N253突变体的分子基础，我们测定了N253C、N253E、N253H、N253Q和N253T的晶体结构。这些突变体的晶体结构表现出与DrTS-Tris相似的闭合构象。进一步分析显示，N253E和N253Q在葡萄糖+1亚位诱导空间位阻，阻断海藻糖结合。此外，N253T和N253H失去了与E324的相互作用，从而阻止海藻糖结合。用Cys取代N253增强了E324的柔韧性，导致活性位点上方形成一个小孔径，有利于水的进入。这使得水分子能够进入活性位点并攻击糖基酶中间体，增加突变体的麦芽糖水解酶活性。这些结果表明N253在进化过程中经历了强烈的纯化选择，这一保守残基对异构酶活性至关重要。
我们之前的研究表明，WT和N253A突变体的结构几乎相同，唯一显著的区别是Glu324侧链的旋转取向。在N253A突变体中，破坏Asn253和Glu324之间的相互作用导致Glu324侧链的位置移动。这种转变创造了一个开口，使溶剂分子能够进入酶的活性部位在这项研究中，我们发现Asn253和Glu324直接与VAA相互作用。这表明Asn253和Glu324的功能作用对异构酶活性至关重要。4.结构引导诱变阐明了一个共识基序，NHDELTLE，这是异构酶活性的必要条件先前的研究强调了TreS中几个基序的保守性。在DrTS-VAA复合物结构中，一个共有的基序NHDELTLE被确定参与VAA在+1位点的结合，由残基E320和E324介导。为了阐明这些残基的功能意义，将谷氨酸突变为天冬氨酸，在保持电荷的同时缩短了侧链。结果表明，突变体E320D和E324D在保持水解酶活性的同时，完全丧失了异构酶活性。有趣的是，E324D的水解酶活性提高了2倍。在E324D突变体的活性位点上形成的孔穴可能有利于水的进入，从而增强水解酶的活性。为了进一步验证E324的功能，我们对E324D-VAA复合物进行了结构分析。大多数WT-VAA和E324D-VAA复合物的相互作用网络相似，但有一个值得注意的例外：E324D失去了与VAA中O7原子的相互作用(图4 )。这种结构的改变可能会阻碍葡萄糖的旋转，从而导致异构酶活性的丧失。我们的结构和突变分析为NHDELTLE是异构酶活性所必需的功能基序提供了有力的证据。![]()
图4. WT-VAA(绿色)和E324D-VAA(洋红色)活性位点的叠加显示，在这两个变体中，VAA以相似的构象结合。然而，尽管有这种相似性，E324D-VAA完全失去了它的异构酶活性。VAA，有效氧基胺A;野生型。
对5个Tre S的结构比较发现，MtTS、MsTS和TcTS具有开放的TS构象，而DrTS-VAA和TtTS-Tris具有闭合的构象。在TS的开放构象中，B亚结构域从活性位点向外旋转，S7亚结构域的一个环阻碍了底物的进入。相反，在DrTS-VAA和TtTS-Tris复合物中，亚结构域B、S7和活性位点残基之间的相互作用封闭了活性位点的入口。这种排列方式产生了针对异构酶活性进行优化的有序活性位点。活性位点的闭合构象在DrTS-VAA和TtTS-Tris中一致。这种由底物诱导的构象是一种保守的特征，对于催化分子内异构化是必不可少的。以DrTS-VAA结构为模板，通过分子建模来预测海藻糖分子与DrTS活性位点的结合，并利用这些信息来预测能量最小化。由于DrTS和奈瑟菌多糖区淀粉蔗糖酶(NpAS)在活性位点结构上惊人的相似，使用NpAS-麦芽糖七糖复合物的非还原末端麦芽糖基残基来拟合-1和+1亚位。此外，我们模拟了一个麦芽糖分子进入活性位点。基于我们的研究结果，我们提出了一个三步过程:糖基化(糖基TreS +葡萄糖)、葡萄糖旋转和去糖基化(海藻糖形成)(图5)。![]()
图5. DrTS的两种结合模型。DrTS与模拟麦芽糖和海藻糖在+1亚位上的相互作用网络。氢键用灰色虚线表示。DrTS;耐辐射球菌海藻糖合成酶。
TS有两种可能的结合模式：麦芽糖和海藻糖结合模式。当葡萄糖在+1亚位从麦芽糖中解放出来时，它可以在这两种模式之间切换，这表明葡萄糖旋转在控制正向和反向反应中都起着关键作用。突变的E324或N253都能消除异构酶活性，表明它们在这一过程中起着关键作用。此外，E324或N253很可能与葡萄糖的O6相互作用。葡萄糖O6与酶的相互作用促进了E324和N253介导的葡萄糖旋转。E324D-VAA的复杂结构支持这一观点。海藻糖的合成对极端环境中的微生物至关重要，因此了解其机制具有重要意义。TreS酶以保守的氨基酸基序为特征，通过类似于GH13家族成员的双重机制发挥其催化活性。海藻糖由于其独特的性质，在食品、医药、化妆品等行业得到了广泛的应用。我们的结构和突变分析提供了关于DrTS中保守残基N253在反应特异性方面的功能作用的见解。结合这些发现以及TS和其他GH13酶的机制和结构研究，提出了DrTS的反应机制(图6A-F)。
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图6. DrTS的催化机理。(A)海藻糖释放和载脂蛋白状态。(B)麦芽糖结合。(C)糖基化状态。(D)葡萄糖的水解和释放。(E)葡萄糖旋转。(F)去糖基化状态。DrTS;耐辐射球菌海藻糖合成酶。
麦芽糖结合后，底物的非还原末端葡萄糖与−1亚位上的GH13保守残基结合。这些酶-底物相互作用诱导子结构域B向活性位点旋转约9度，形成封闭的活性位点构象。在+1亚位点中，如DrTS-麦芽糖复合物模型所示，麦芽糖中葡萄糖的+1亚位点直接与Y213以及独特的TS残基E320和E324相互作用。底物结合后，亲核试剂D209攻击葡萄糖+1亚位的C1，形成共价糖基酶中间体。封闭的活性位点不仅提供了保护中间体免受水的亲核攻击的环境，而且还保留了葡萄糖的裂解+1亚位，供N253和E324旋转。随后，葡萄糖分子旋转并攻击带有OH1基团的共价中间体，从而完成分子内异构化，形成海藻糖。在DrTS中，活性位点入口上方广泛的相互作用网络稳定了封闭构象，特别是R148、N253、E324以及D153和N347之间的相互作用。残基N253在维持E324侧链的取向方面起着至关重要的作用。用Ala、Cys、Glu、His、Gln和Thr取代N253，以及用Ala取代R148，使E324的侧链具有柔韧性。因此，在蛋白质表面观察到诱导形成水进入活性位点孔的突变，导致突变体N253A、N253C和R148A的水解活性更高，异构酶活性更低(图S5A−D)。此外，本研究中的DrTS - VAA结构表明N253与海藻糖的结合取向比麦芽糖更接近。在N253Q、N253E和N253T突变体中，海藻糖中葡萄糖的+1亚位与引入的侧链原子之间存在潜在的空间位阻，这为它们的活性提供了深入的了解。综上所述，我们的研究结果表明，保守的N253和E324残基已经在各自的位置上进化成为有效异构化催化的最佳氨基酸。N253不仅通过与E324的相互作用参与闭合构象的形成，而且在决定异构酶和水解酶的偏好方面也起着关键作用。本研究结果为今后TreS在海藻糖和其他有价值的双糖生物合成中的工程和应用提供了结构基础。
原文：Structural and Mutational Analyses of Trehalose Synthase from Deinococcus radiodurans Reveal the Interconversion of Maltose−Trehalose MechanismDOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c03661
