2024年1月来自北京化工大学的Meixing Wang等人在International Journal of Biological Macromolecules发表了一篇题为Engineering polysaccharide hydrolases in the product-releasing cleft to alter their product profiles的研究性论文。

多糖水解酶由多种酶组成，包括淀粉酶、壳聚糖酶、异淀粉酶、麦芽糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等。它们可以将多糖分解成短寡糖（OS）甚至更小的分子，从而表现出显著的生物活性和功能。例如，壳聚寡糖（COS）及其衍生物已被证明具有多种生物活性，包括免疫刺激、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖、抗高血压、抗老年痴呆症、抗微生物、抗氧化、促进组织再生、增强药物和DNA递送以及钙吸收。对于生活方式改变的人来说，摄入果寡糖可能对调节脂质代谢和血清胆固醇水平有益。研究发现，一些OS有助于降低糖尿病前期并发症的风险，尤其是肾损伤和2型糖尿病，而另一些OS则可以通过减少氧化应激和神经炎症来延缓小鼠大脑的衰老。研究还发现，寡糖的多种成分可以促进益生菌的生长，同时抑制有害菌的生长，从而调节肠道菌群平衡，刺激短链脂肪酸的产生，并调节免疫系统。

目前，多糖水解酶的产物分布被认为主要受隧道形状和空间位阻的影响。例如，结构分析表明，木聚糖酶S7-xyl的254RL1变体扩大了隧道开口，缩短了隧道形状，有利于释放较大的终产物。β-甘露聚糖酶BaMan113A的变体F101E和N236Y成功地消除了立体屏障，使产物从甘露糖转变为一系列甘露寡糖。此外，β-葡萄糖苷酶Tn0602的单突变体F226G和双突变体F226G/F414S通过改变结构灵活性和减少受体隧道的空间位阻，提高了GOS的生产率并扩大了产品范围。此外，还研究了酪氨酸特异性化学修饰对Bacillus megaterium果聚糖蔗糖酶变体N126Y和S125Y的影响。根据所选位置的不同，修饰会导致短链寡糖的富集（变体N126Y）或引发高分子量聚合物的形成（变体S125Y）。这些产物的组成和多样性可能源于酶活性或底物特异性的变化，这可能会严重影响这些酶的潜在应用。通过研究多糖水解酶的产物分布，有可能发现酶与底物或产物之间的相互作用，并阐明其分子机制。这些信息将有助于开发高效的酶工程来优化产品分布，并有助于探索多糖水解酶在食品、制药和生物能源等行业中的应用。

此前，研究人员发现了一种多糖水解酶--新普鲁兰酶（NPase）Amy117，它水解普鲁兰，生成的唯一产物是潘糖。Amy117的一些同源物，如环麦芽糖淀粉酶（CDase）Amy98，也只水解普鲁兰产生潘糖，而麦芽糖淀粉酶（MAase）ThMA则产生葡萄糖、麦芽糖和潘糖的混合物。值得注意的是，Amy117及其同源物之间有超过60%的序列相同性。因此，为什么这些序列同源性如此高的酶在水解普鲁兰时会表现出相当不同的产物分布，这为研究不同水解产物的形成机制提供了宝贵的研究材料。之前的研究发现，Amy117及其同源物通常是二聚体酶，由一个分子的N端结构域和另一个分子的催化结构域形成一个狭窄的活性位点裂隙。因此，这种独特的结构排列为研究NPase（或MAase和CDase）的产物分布提供了新的灵感，而这种狭窄裂隙的工程学设计可实现对产物分布的灵活调控。

在这里，通过仔细的序列比对和结构分析，研究人员确定了位于产物释放裂隙出口处的一个关键残基，该残基似乎在决定所观察到的产物分布方面起着至关重要的作用。研究人员分别在Amy117和ThMA中利用基于结构的合理设计成功地改变了普鲁兰水解的产物分布。本研究不仅为研究多糖水解后产物分布的组成奠定了基础，还为设计糖苷水解酶所需的产物分布提供了框架。

1.序列比对和结构分析发现了一个非保守的独特残基

为了研究不同酶水解普鲁兰的不同产物分布，研究人员将Amy117与ThMA（Genbank编号：AAC15072.1）进行了比较，ThMA是一种具有已知三级结构的蛋白质，与Amy117有62%的同源性。与Amy117不同的是，ThMA将普鲁兰水解为一种混合产物（葡萄糖、麦芽糖、潘糖），这使得能够识别和分析两种酶之间的结构差异。

Amy117和ThMA被表征为二聚体，其活性位点裂隙狭窄且半封闭，由一个分子的N-末端结构域和另一个分子的催化结构域形成。具有高度序列同源性的酶在水解普鲁兰后表现出不同类型的产物，其原因可能与酶中存在狭窄的裂隙有关。在酶工程领域，人们发现隧道或裂隙起着至关重要的作用，因为它连接着酶的活性位点和外部环境。因此，这些隧道或裂隙的分布，如形状、大小、电荷和氨基酸残基的分布，会深刻影响酶的催化效率和产物选择性。因此，研究产物释放裂隙的机理对于优化酶的设计和应用具有重要意义。

为了进行详细研究，研究人员使用YASARA软件中的 AutoDock Vina方法进行了灵活对接。首先将潘糖与蛋白质的活性位点对接，发现潘糖的三个单糖从催化残基延伸到了蛋白质表面（图1A和B）。通过对接分析，确定了潘糖周围靠近蛋白质表面的氨基酸，包括Amy117的F294、M300、V297、T299、P166、T167、H204、D473、R477（图1A）和ThMA的F289、M295、V292、H294、P167、T168、H205、D468、R472（图1B）。值得注意的是，除了Amy117中的T299和ThMA中的H294外，这些位点在两个序列中都是一一对应的，而这两个位点由于性质不同而特别有趣（图1C）。在Amy117中，从潘糖（离活性位点最远的六碳糖环中的O4）到T299（OG1）的距离为11.3Å，在ThMA中，从潘糖（离活性位点最远的六碳糖环中的O6）到H294（CD2）的距离为6.8 Å。这一观察结果表明，ThMA中的H294位点可能会与潘糖发生额外的相互作用，从而可能阻碍其释放速度。因此，研究人员推测对该位点的直接突变可能会导致普鲁兰水解后的产物分布发生变化。

图1.结构分析和序列分析。A和B，裂隙内Amy117-潘糖（A）和ThMA-潘糖（B）复合物的结构分析。酶的二聚体形式由单体1（灰色）和单体2（蓝色）表示。被催化残基（红色）和邻近氨基酸（黄色和绿色）包围的潘糖显示为棒状模型。黑色虚线表示潘糖与T299（A）或H294（B）之间的距离，并标出了长度。C，Amy17和ThMA的序列比对。

2.单点变体改变了产物分布

为了验证Amy117中的T299对产物分布的影响，研究人员进行了定点突变，用组氨酸取代了Amy117中的T299。如图2A所示，研究人员对Amy117(T299H)变体的普鲁兰水解产物进行了TLC分析，发现最终产物发生了显著变化，从纯潘糖变成了含有潘糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。进一步测定了最佳反应条件下的比活性和相对活性，结果见表1和图2B。Amy117（T299H）变体表现出较低的比活性和催化效率（kcat/Km）。

图2.普鲁兰多糖水解产物和酶活性分析。A，Amy117、Amy117-T299H、ThMA和ThMA-H294T对普鲁兰多糖的水解产物; B，Amy117、Amy117-T299H、ThMA和ThMA-H294T在普鲁兰多糖水解中的相对酶活性。

为了进一步验证，研究人员对ThMA的相应位点进行了逆向工程，并检查了其产物分布。如图2A所示，通过比较WT ThMA和设计的变体ThMA(H294T)，成功地将水解物从普鲁兰完全转化为潘糖。此外，还测定了WT ThMA和ThMA(H294T)变体的比活性和动力学常数（表1），发现ThMA (H294T)变体的比活性提高了2.03倍。动力学数据显示，ThMA(H294T)变体的催化效率（kcat/Km）值比WT ThMA高2.05倍。

表1.Amy117和ThMA水解活性的动力学参数

3.Amy117（T299H）和ThMA（H294T）变体的结构分析

根据实验结果，Amy117和ThMA变体的引入导致了普鲁兰水解过程中产物概况的显著变化。为了进一步分析这些变体的结构影响，研究人员对Amy117(T299H)和ThMA(H294T)变体进行了结构建模和分子对接研究。具体来说，潘糖（六碳糖环中离活性位点最远的O6）与Amy117(T299H)(CD2)之间的距离减小到4.1 Å，而潘糖（六碳糖环中离活性中心最远的O4）与ThMA(H294T)(OG1)之间的距离则增加到了9.9 Å（图3）。与各自的野生型酶Amy117（11.3 Å）和ThMA（6.8 Å）（图1）相比，这些距离的巨大变化强烈表明关键残基与潘糖的距离与产物潘糖的释放潜力之间存在关联。

研究人员对这些奇特现象的解释是，在pH值为7时，氨基酸His的侧链含有一个带正电荷的N原子和一个带孤电子对的中性N原子，使其能够与潘糖形成更多的相互作用，从而导致其释放速度较慢。相反，当产物释放出口处的关键残基变为不带电的Thr时，潘糖的释放速度会更快，从而使酶生成的产物仅由潘糖组成。

图3.Amy117-T299H和ThMA-H294T的结构分析。A，在裂隙中具有潘糖的Amy117-T299H复合物的结构分析。B，在裂隙中具有潘糖的ThMA-H294T复合物的结构分析。

4.关键残留部位的通用性评估

为了进一步了解情况，研究人员对与Amy117同源性超过60%的淀粉酶之间产物释放出口处的氨基酸残基进行了全面比对，如表2所示。有趣的是，与Amy117的残基T299相对应的氨基酸在这些酶中并不保守。具体来说，在产生混合产物的淀粉酶中，发现与T299相对应的残基是Asn、His或Gln。相反，只产生潘糖的淀粉酶在T299的相应位点上有Thr和Glu。值得注意的是，Asn和Gln残基的侧链都含有一个含有N原子的酰胺基团，这可能使它们能够与潘糖形成更多的相互作用并减缓其释放速度，从而有可能更好地将潘糖限制在活性位点裂隙内，以便进行更多的消化。

表2.与Amy117具有超过60%同源性的淀粉酶的性质

表3.Amy117、ThMA及其突变体的相对活性

图4.普鲁兰水解产物和Amy117、ThMA及其突变体的酶活性的分析。A.通过Amy117、Amy117-T299 H、Amy117-T299N、Amy117-T299Q、ThMA、ThMA-H294T、ThMA-H294E的普鲁兰水解产物。B，Amy117的相对酶活性，将野生型Amy117对1%普鲁兰多糖的酶活性设定为100%分析。

图5.A, 普鲁兰多糖中重复潘糖单元及其连接的结构表示。六边形表示六碳糖分子。α-1，4和α-1，6糖苷键由黑色虚线和蓝色实线表示。潘糖单元，麦芽糖单元和葡萄糖单元也被说明。B, 八个葡萄糖连接的长链（G8）的化学结构。C,  Amy117的反应机理示意图。R1，供体的糖部分（底物）分子; R2，供体的糖离去基团。D和E, 在裂缝中具有G8的Amy117和Amy117-T299H的结构分析。F和G, ThMA和ThMAH294T的结构分析，其中G8在裂隙中。（棒状模型）是在狭窄的裂缝形成的蛋白质二聚体，而三个严格保守的催化残基（Amy117中的Asp333、Glu362和Asp429; ThMA中的Asp328、Glu357和Asp 424）用橙色标记。

03

结论

DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.128416