《IJBM》通过刚性柔性位点提高Penicillium janthinellum酸性木聚糖酶PjxA的热稳定性和比活性

文摘科学 2024-09-25 20:03 江苏

2024 年 5 月 25 日，来自北京工商大学的Wenqi Dong等人在International Journal of Biological Macromolecules上发表了一篇题为Improvement the thermostability and specific activity of acidic xylanase PjxA from Penicillium janthinellum via rigid flexible sites的研究性论文。

通讯作者：Xiuting Li

通讯单位：Beijing Technology and Business University, No 11 Fucheng Street, Haidian District, Beijing 100048, China.

Abstract

来自Penicillium janthinellum MA21601的酸性木聚糖酶PjxA具有良好的嗜酸性和酶活性，是降解木聚糖以实现生物质材料有效利用的理想候选酶。然而，PjxA的热稳定性差成为其应用的主要瓶颈。在本研究中，通过结合折叠自由能计算的结构和序列分析的计算模拟，确定PjxA的柔性位点并对其进行刚性化。最后，将两个单突变体S82N和D45N合理整合，构建了组合突变酶PjxA-DS。与PjxA相比，PjxA-DS在50°C时的半衰期长了115.11倍，比活力高了2.02倍。计算机模拟分析表明，S82N和D45N协同作用提高了PjxA的热稳定性。PjxA的N端和活性中心的稳定、表面正电荷的增加和亲水性的提高是PjxA热稳定性和催化活性提高的主要原因。柔性位点的刚性化是提高酶热稳定性的有效方法，S82N和D45N可以作为GH11酸性木聚糖酶热稳定性工程改造的有效靶点。

简介

木质纤维素的合理利用在缓解能源危机中具有潜在的应用价值。半纤维素是自然界中最丰富的木质纤维素之一。作为半纤维素的主要成分，木聚糖向寡糖的转化对木质纤维素的利用具有更广泛的意义。目前，降解木聚糖的方法主要有酸解、碱解、热解和酶解。其中，酶解具有条件温和、无毒副产物、产品特异性好等优点，成为工业上常用的方法。糖苷水解酶（GH）11家族的木聚糖酶由于底物特异性好、分子量小等优点而成为主要的工具酶。木质纤维素在高温和高酸度条件下的降解效率更高，可以防止处理过程中的微生物污染。因此，对木聚糖酶的耐热性和耐酸性提出了更高的要求。酸性木聚糖酶被广泛定义为可以在较低pH条件（3.0–6.0）下长时间保持高酶活性的木聚糖酶。然而，由于大多数天然酸性木聚糖酶的酶活性和稳定性不足，无法有效地进行降解转化。到目前为止，大多数酸性木聚糖酶的最适温度低于50°C，较差的热稳定性已成为其应用的瓶颈。有必要通过酶工程来改造酸性木聚糖酶的热稳定性。

随着生物信息学的发展，对蛋白质结构-功能关系的理解有助于酶的分子修饰。对嗜温和嗜热蛋白的结构研究表明，嗜热蛋白具有更刚性的结构。因此，柔性位点的刚性化对于提高酶的热稳定性很重要，这分两步进行，即柔性位点的预测和蛋白质柔性位点的刚性化。嗜温木聚糖酶结构中的柔性位点可以使用计算方法进行预测，例如B因子分析和分子动力学（MD）模拟。可以通过使用序列比对来定位嗜热木聚糖酶中的保守序列，来指导嗜温木聚糖酶中柔性区域的合理设计。因此，在高柔性的区域鉴定关键氨基酸并通过序列比对构建突变是提高GH11家族木聚糖酶热稳定性的可行策略。

在作者之前的研究中，克隆并表达了来自Penicillium sp. MA21601的GH11家族中酸性木聚糖酶PjxA，显示出很好的水解特性，表明其在功能性寡糖（XOS）生产中的潜在应用。然而，在50°C下培养30分钟后，酶活性几乎完全丧失。较差的热稳定性限制了其在工业应用中的使用，研究人员尝试在N端附近构建二硫键以提高其热稳定性，但与嗜热木聚糖酶相比仍然存在差距。为了进一步提高其热稳定性，在本工作中，通过分子动力学模拟和B因子分析定位了PjxA的柔性位点。通过对抗性酶的筛选和对折叠自由能的预测，最终构建了一个组合突变体PjxA-DS，与PjxA相比，它在50°C时表现出2.02倍的酶活性和115.11倍的半衰期。此外，使用MD模拟来探索突变后的构象变化和氨基酸相互作用网络，以阐明热稳定性和酶活性双重提高的潜在机制。这些结果不仅揭示了影响PjxA热稳定性的关键残基，而且可为GH11家族的酸性木聚糖酶的修饰提供参考。

结果

1.通过分子动力学模拟对PjxA进行热稳定性修饰

MD模拟可用于比较蛋白质构象在高温和低温状态下的波动。如图1A，PjxA在350K时的RMSD显著高于300K时，表明PjxA的构象随着温度的升高而变得不稳定。在图1B，确定了7个RMSF值在300K和350K之间差异较大的区域，标记为PTxA的区域之前已经研究过，而其他6个柔性区域被命名为I-VI并用虚线框标记。图1D显示6个高柔性区域位于PjxA的环区，它们是连接β片和α螺旋的非晶态区域。突变体通过野生型PjxA和11种最适温度>75°C的GH11家族中的嗜热木聚糖酶的多序列比较来鉴定（图1C，E）。

图1.通过在300 K和350 K下对酶进行分子动力学模拟，在高温条件下定位构象稳定性差的氨基酸区域。（A）PjxA在300 K和350 K时的RMSD。（B）PjxA在300 K和350 K下的RMSF。（C）PjxA与11种热稳定性GH11木聚糖酶的多序列比对。（D）PjxA的3D结构上六个区域的位置。（E）6个区域的序列保守性分析。

在50 °C下测定6个区域突变体的粗酶活性，并在45 °C下培养30分钟后测定残留活性（图2A）。与野生型PjxA相比，突变体II的酶活性显著增加，而突变体I和VI的酶活性和热稳定性均增加。因此，选择突变体I、II和VI进行纯化，结果如图4所示。通过SDS-PAGE分析显示，所有纯化的酶都集中在一个条带中，表明这些酶达到了电泳纯度。

图2.PjxA和突变体在50 °C下的酶活性和45 °C下孵育30分钟的残余酶活性。（A）PjxA和区域突变体。（B）PjxA和N末端突变体。

三种突变酶的最适pH值和最适温度与原始酶PjxA一致，分别为5.0和50 °C（表1)。所有三种突变酶都能保持良好的耐酸性（图5）。区域II突变的半衰期为8.24 min，是3种区域突变酶中最高的，是PjxA的1.38倍（表1），表明区域II突变对PjxA的热稳定性有改善的影响。区域II突变仅涉及PjxA上的一个氨基酸突变，即S82N。S82N可以提高PjxA的热稳定性，同时保持PjxA的酸稳定性和酶活性（1200.05 U/mg），是PjxA热稳定性修饰的重要靶点。

表1.突变体酶的特性

2.通过B因子对PjxA进行热稳定性修饰

四种耐热酶（PDB ID：2VUJ,2VUL,1M4W,1F5J）与来源于Talaromyces cellulolyticus的GH11木聚糖酶TcXylC（PDB ID：3WP3）结构重叠，它与具有已知晶体结构的PjxA具有最高的同源相似性（72.63 %），并且氨基酸根据其晶体结构中的B因子参数进行着色。如图3A，B因子的比较表明，四种耐热酶都具有较低的B因子。此外，比较图3A、B，可以清楚地观察到，3WP3重叠后，酶结构的N端颜色有明显的差异，表明3WP3的N端具有更高的B因子，这意味着PjxA在N端的柔韧性高于耐热酶。它是一个潜在的热稳定性改性区域。许多关于GH11木聚糖酶N端合理设计的研究稳定了N端结构并显著增强了酶的耐热性。N端氨基是热稳定性修饰的重要靶标。

图3.3WP3的重叠结构与PjxA具有最高同源性相似性的四种热稳定酶2VUJ、2VUL、1M4W和1F5J，由氨基酸的B因子着色。（A）使用2VUL作为参考，除3WP3外的四种热稳定酶的重叠结构。2VUL的可触及表面以B因子表示，透明度为40%。（B）包括3WP3在内的五种酶的重叠结构，以3WP3为参考，3WP3的可触及表面以B因子表示，透明度为40%。（C）PjxA中氨基酸的保守分布。（D）PjxA与11种热稳定性GH11木聚糖酶的N端多序列比对。（E）N末端（1-50个残基）的序列保守性分析。

PjxA的结构模型根据N端序列的保守性着色。(图3C），可以看出N端在整个酶结构中的序列保守性较低，研究证实N端的氨基酸与GH11木聚糖酶活性和热稳定性有关，刚性化该区域是提高热稳定性的有效策略。基于与11种耐热酶的多序列比较结果，通过选择具有较高保守性的氨基酸进行取代，共设计了23个N端突变体（图3D，E）。酶的折叠自由能（ΔΔG，kcal/mol）的变化定义为ΔG野生和ΔG变体，其中负ΔΔG表示残基取代使蛋白质稳定。为了提高获得显性突变体的效率，使用DS2020计算23个N端突变体的ΔΔG，最后设计了7个ΔΔG小于或等于0的突变（C43I、D45N、T47V、A32S、T29C、S27N、T3C）用于后续研究。

通过测定这7种突变酶的粗酶性质，可以发现突变体A32S、D45N和S27N的酶活性和热稳定性高于PjxA（图2B）然后纯化这三个突变体以进行进一步研究（图4）。在这3种突变酶中，D45N的比酶活性显著提高至1943.61 U/mg，比PjxA高54.44 %（表1)。这三种突变体的最适pH值为5.0，与PjxA相似。在pH2.0下孵育30 min，S27N和A32S的残留酶活性分别降低到48.32 %和48.29 %，但D45N的pH稳定性与PjxA相比显着提高。在pH 2.0–8.0范围内，D45N可以维持>80%的初始酶活性。D45N的最适温度为55 °C。此外，在50 °C下培养30 min后，除D45N外的所有突变酶的残留酶活性迅速下降，而D45N能够维持80.99%的初始酶活性。同时，D45N在50 °C下的半衰期为85.63 min，比PjxA的5.99 min长14.30倍（表1)。综上所述，D45N 突变显著提高了酶的比活性、最适温度、pH稳定性和热稳定性，表明D45N突变在改善PjxA的酶特性方面发挥着重要作用。

图4.木聚糖酶的SDS-PAGE分析。（A）纯化的PjxA及其区域突变体。（B）纯化的PjxA及其N端突变体。（M：Maeker）。

3.通过组合突变提高PjxA的热稳定性

酶由多个氨基酸组成，它们共同作用维持蛋白质的构象稳定性。在性能上取得显着改善的突变酶通常结合至少两个或多个位点，这突出了位点组合在蛋白质分子修饰过程中的重要性。多个突变位点的构建已被证明是提高酶的热稳定性的有力工具。此外，显性突变体的组合揭示了复杂的动作网络。它对理解蛋白质的功能和分析氨基酸之间的相关性具有重要的理论意义。S82N和D45N是修饰PjxA热稳定性的重要靶点。为了研究这两个位点对PjxA热稳定性的影响，以获得具有优异热稳定性的酸性木聚糖酶，在PjxA上同时构建了两个突变位点，命名为PjxA-DS。PjxA-DS的最适pH值为4.5，在pH 2.0下培养30 min后残留酶活性>70 %。PjxA-DS的最适温度与PjxA一致，在30 °C–50 °C下孵育30 min酶活性不受影响，而PjxA和单一突变酶在50 °C下孵育30 min均表现出不同程度的降低甚至失活（图5），表明两个位点的结合进一步增强了PjxA的热稳定性。PjxA-DS在50 °C时的半衰期确定为689.50 min，是PjxA（5.99 min）的115.11倍（表1)。与PjxA相比，S82N对底物的亲和力降低，催化效率低于PjxA，与PjxA相比（1258.42 U/mg），其比活性较低，为 1200.05 U/mg，（表1)。结合两个位点后，催化效率(kcat/Km）比PjxA增加1.71倍，PjxA-DS的比酶活性提高了2.02倍，达到2538.12 U/mg，表明PjxA-DS亲和力增加、转化率更高和比酶活性更高（表2)。大多数报道的酸性木聚糖酶酶活性低，热稳定性差。通过构建二硫键来增强酸性木聚糖酶的热稳定性是有效的，然而，通过点突变探索影响酸性木聚糖酶热稳定性的关键氨基酸位点的研究较少。在这项研究中，通过点突变获得的组合突变体PjxA-DS的酶学特性提高了酸性GH11木聚糖酶的热稳定性，目前处于领先地位。

表2.PjxA 和突变体对山毛榉木聚糖的动力学参数

图5.单一突变体（A，左），N末端突变体（B，左）和组合突变（C，左）的最佳温度。在不同温度（30-70°C）下，在50 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中的最佳pH值下测量；酶活性最高，为100%。区域突变体（A，右）、N末端突变体（B，右）和组合突变（C，右）的热稳定性。通过在50 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中以最适pH值在不同温度（30-55°C）下孵育30分钟来测定热稳定性；未处理的木聚糖酶的活性定义为100%。

4.水解特性分析

水解反应在pH 5.0和50 °C下进行，所有突变的水解产物类型与原始酶基本相同，以X2和X3为主。如图6，PjxA和S82N的水解产物收率相似，均在50 °C水解30 min后达到最高水平，而D45N和PjxA-DS的水解产物在水解30 min后仍呈上升趋势，这与D45N和PjxA-DS的热稳定性增加有关。PjxA 和S82N在50 °C下水解30 min几乎失去酶活性，而D45N和PjxA-DS均能维持>80 %的活性，并且随着时间的推移，D45N和PjxA-DS的水解产物表现出X4和X5降低，而X2和X3增加。与PjxA和S82N相比，更多的X4和X5被水解为X2和X3。D45N突变位点在提高PjxA的热稳定性方面发挥了重要作用。与D45N（2.70 mg/mL）相比，PjxA-DS的X2-X5水解产物产量提高到2.83 mg/mL，表明引入S82N位点可能有助于提高PjxA-DS的水解效率。

图6.野生型PjxA及其突变体与山毛榉木聚糖在pH 5.0，50 °C下反应不同时间间隔后的水解产物。（A）野生型PjxA，（B）S82N，（C）D45N，（D）PJXA-DS。X1：木糖；X2：木二糖；X3：木三糖；X4：木四糖；X5：木戊糖。

5.PjxA和突变的结构分析

蛋白质热稳定性的提高不仅仅是单个氨基酸的作用，而是由多个氨基酸的联合作用形成的效应网络，共同作用维持蛋白质的构象稳定性。因此，将有利突变体 S82N和D45N结合，获得更耐热的突变酶，揭示氨基酸之间相互作用的复杂网络和内在连接，对于理解蛋白质功能和分析氨基酸之间的相关性具有重要的理论意义。将双突变与单突变进行比较，发现PjxA-DS的热稳定性进一步提高，50 °C时的半衰期分别比S82N和D45N高83.68和8.05倍。尽管位点82和位点45之间的空间距离为21.1 Å，没有直接相互作用，但对热稳定性的综合影响明显大于单个位点效应的总和。有研究将5个氨基酸突变引入嗜温木聚糖酶SoxB中，并通过点突变验证每个氨基酸对SoxB热稳定性的贡献，发现5个氨基酸之间存在协同作用，导致其热稳定性大幅提高。因此，S82N和D45N突变的协同作用增强了PjxA的构象稳定性，导致PjxA-DS的热稳定性显著提高。

木聚糖酶的表面静电势也被认为与热稳定性和pH适应相关。计算出PjxA-DS的净电荷在+0.125时与D45N相似，PjxA在-0.875时与S82N相似。PjxA-DS净电荷的增加表明表面正电荷的增加，主要受D45N突变的影响。如图7A，D45N突变在第45位氨基酸附近增加了更多的正电位，而 S82N 突变附近的静电电位与PjxA基本相似。此外，有研究发现蛋白质表面增加的正电荷有利于木聚糖酶的热稳定性。该研究是通过在源自Aspergillus nigerBCC14405的木聚糖酶分子表面引入精氨酸突变来进行的。带正电荷的精氨酸胍基团为电荷之间的相互作用提供了表面积，从而提供了相互作用并增强了酶的热稳定性。此外，天冬氨酸是极性带负电荷的氨基酸，而突变的天冬酰胺是极性不带电荷的氨基酸。通过比较具有不同酸和碱适应的GH11木聚糖酶，发现嗜酸性木聚糖酶表面的极性不带电荷残基较多，疏水残基较少，导致带正电荷和带负电荷的残基比例较高，有利于其在酸性条件下的稳定。由此可见，PjxA-DS的酸适应增强与D45位点突变为Asn后电荷的变化有关。同时，PjxA-DS表面正电荷的增加表明突变优化了酶的表面电荷分布，酶的表面净电荷对其热膨胀和复性行为有重要影响，通过改变蛋白质的表面电荷分布来提高蛋白质的热稳定性是可行的。由于GH11木聚糖酶是一种水解酶，作用介质是水溶液，它是水溶性的，研究突变前后疏水性的变化可以更好地了解其在水性介质中的行为。PjxA-DS 的GRAVY值与 S82N一致，为-0.578，低于PjxA和D45N的GRAVY值（-0.564），如下所示图7B，突变为Asn后位点82附近的亲水性大于突变前Ser，表明S82N突变的引入使PjxA-DS更具亲水性。许多研究证实，分子表面亲水性的增加形成了水合层，这是酶热稳定性增加的主要原因。因此，S82N在改善PjxA-DS的亲水性方面发挥了重要作用。

图7.PjxA和PjxA-DS的静电势能和亲水性分析。A.PjxA（左）和PjxA-DS（右）的静电势能，酶的突变体S82N和D45N的静电势能用黑框标记。B.PjxA（左）和PjxA-DS（右）的疏水表面，酶的突变体S82N和D45N的疏水表面用黑框标记。

平衡酶热稳定性和酶活性之间的负相关一直是热稳定性改性的一个主要问题。出乎意料的是，在这项工作中，两个突变位点的引入显著提高了木聚糖酶PjxA的热稳定性，同时也增加了其酶活性。因此，探索增强酶活性的内在机制对酶修饰具有指导意义。通过AutoDock-Vina进行PjxA、PjxA-DS与X5的分子对接，计算对接结合能，并分析底物结合区蛋白质与木糖之间的氢键。与底物产生氢键相互作用的氨基酸几乎保持不变，突变没有改变它们的水解产物类型。从分子对接的结果（图8），当PjxA与X5结合时，Asp45与X5形成氢键，位于酶“拇指区域”的氨基酸倾向于与X5相互作用。比较形成氢键的两个原子之间的距离表明，与PjxA相比，X5倾向于位于PjxA-DS中结合口袋的中间，尽管它减少了与Pro126、Thr177和Asp45的相互作用，但更好地稳定了与结合区相互作用氨基酸的平衡。这有助于维持酶-底物相互作用，从而提高底物结合和产物释放速率，这也可以解释寡糖产量增加的原因（图8）。

图8.分析酶与木戊糖的氢键相互作用。A.野生型PjxA与木戊糖的氢键相互作用，相互作用在三维结构中的位置（左），相互作用关系的二维平面图（右）。B.突变体PjxA-DS与木戊糖的氢键相互作用（左），相互作用关系的二维平面图（右）。

研究表明，催化裂解的尺寸会影响底物与酶活性中心的结合。为了研究酶底物结合口袋的变化，使用Protein plus 分析完成分子对接后酶-底物复合物的结构，并计算结合口袋的表面积和体积。结果表明，PjxA-DS的结合口袋的表面积和体积为1235.32 Å2，721.41 Å3，比表面积为1.71；PjxA的为1190.63 Å2，735.23 Å3，比表面积为1.60。裂隙的宽度与底物转换空间有关，影响底物结合和产物释放的效率。PjxA-DS催化裂隙的较大比表面积促进了与底物的相互作用，从而提高了PjxA-DS的亲和力。PjxA-DS的底物结合能和Km分别为−10.60 kcal/mol和10.58 mg/mL，而PjxA的结合能和Km分别为−10.0 kcal/mol和15.00 mg/mL。

6.PjxA和PjxA-DS的分子动力学模拟分析

木聚糖酶在工业上具有广泛的应用，近年来，在高温和极端pH值等恶劣条件下具有高活性和稳定性的木聚糖酶的需求越来越大，因此通过酶工程技术修饰酶的热稳定性和耐酸性已成为可行的。在这项研究中，通过定位和刚性化酸性木聚糖酶PjxA的柔性位点构建了一种组合变位酶PjxA-DS，实现了比酶活和热稳定性的显着增加。通过木聚糖酶XynA的多重序列比较和靶向刚性诱变，获得了迄今为止最耐热的GH11木聚糖酶，在80 °C和90 °C下培养12小时，残留酶活性为>85%。这些结果表明，刚性柔性位点的方法在增强 GH11木聚糖酶的热稳定性方面的有效性。对酶分子动力学过程的计算机模拟可以帮助更好地了解酶的分子结构变化和催化机制。为了探索突变体PjxA-DS热稳定性和比活性增加的内在机制，使用GROMACS 4.5.4程序进行了MD模拟。众所周知，酶的生化性质和生物学功能与其构象灵活性、分子内波动等动态过程密切相关。与PjxA相比，PjxA-DS在MD模拟期间表现出较低的RMSD值（图9A），表明PjxA-DS的分子更刚性且构象更稳定。蛋白质的热稳定性与其RMSD值呈负相关，与其刚性呈正相关。较低的RMSD值表示较高的热稳定性。RMSF值代表氨基酸残基的灵活性。比较PjxA和PjxA-DS的RMSF值的波动和变化表明，并不是所有区域的构象稳定的组合而导致稳定性的增加。研究人员注意到PjxA-DS的N端残基1-10的RMSF值低于PjxA的RMSF值（图9B）较低的RMSF值表明突变导致特定区域的柔韧性降低，这增加了酶的结构刚性并大大提高了其热稳定性。这表明该突变在稳定PjxA的N端起积极作用。N端位于PjxA展开的起点，其柔韧性的增加容易触发整个酶结构的不可逆破坏，因此N端的稳定化对提高PjxA的热稳定性具有重要意义。此外，PjxA-DS从位点152到位点170的RMSF值（位于α-螺旋和连接拇指区域的环）也显著低于PjxA，表明突变也稳定了该区域。研究表明，酶α-螺旋区的稳定性与酶的整体稳定性密切相关。

图9.酶的分子动力学模拟。A.PjxA和PjxA-DS的RMSD，在整个模拟中以343 K进行分析。B.PjxA和PjxA-DS的RMSF。C.PjxA的动态互相关矩阵，D.PjxA-DS的动态互相关矩阵。青色表示正相关，粉红色表示负相关。

分子动力学动态相关矩阵（DCCM）表示蛋白质中每个氨基酸的特定原子（例如Cα原子）与其他氨基酸的特定原子之间的相关性，并提供有关蛋白质在大尺度上的相关运动的信息。DCCM计算的值范围从完全负相关的-1.0到完全正相关的+1.0，其中正（负）表示两个原子的运动方向相同（相反）。可以看出，PjxA-DS的N端区域比PjxA的N端区域有更多的青色块，表明正相关性增加（图9C、D）。有研究发现突变不仅会影响突变位点附近区域的刚度，还会影响远处区域的刚度.这证实了S82N和D45N的突变协同增加了N端氨基酸的正动力学相关性。值得注意的是，PjxA-DS的RMSF值高于PjxA在位点125附近。此外，PjxA-DS的N端与位点125之间的粉红色块明显增加，表明这两个区域之间的负相关性增加。这表明，如果N端区域更稳定，这将导致拇指区域的更大的波动，从而导致该区域的构象灵活性增加。这些信息可为PjxA的热稳定性改性提供参考。此外，通过比较PjxA催化活性中心（氨基酸86和177）附近的DCCM，发现PjxA-DS的45和82位点、N端和催化中心177之间的正相关性增加，表明这两个位点对活性中心177附近的氨基酸具有稳定作用，这表现在位点177附近PjxA-DS的较低RMSF值。催化中心的稳定性确保了酶的正常催化功能的实现，并促进了与底物的稳定相互作用，PjxA-DS与底物的较高亲和力也证实了这一点。此外，活性中心附近相关性的增加对其酶活性有积极影响。研究发现当酶在过渡态下进行催化反应时，催化中心附近的分子动力学相关网络使其活性中心表现出更紧密的构象，这有利于其活性，根据这一特点，通过引入突变来修饰酶，以增加突变位点与活性中心的相关性，这使酶活性增加了104倍。可以推测，PjxA中引入的两个突变位点通过增加酶与底物之间的亲和力以及通过增加催化中心的相关网络来提高热稳定性和酶活性。通过对GH11木聚糖酶的序列比较，发现S82和D45位点高度保守。因此，S82N和D45N是修饰GH11 酸性木聚糖酶热稳定性的有效靶标。

结论

在这项工作中，分子动力学模拟、B因子分析和多序列比对，结合折叠自由能计算来识别和刚性化GH11酸性木聚糖酶PjxA 的柔性位点。筛选出S82N和D45N两个显性突变。此外，通过整合这两个位点构建组合突变体PjxA-DS，在50 °C下比酶活为2538.12 U/mg、半衰期为689.50 min，分别是PjxA的2.02倍和115.11倍。酶表面正电位和亲水性的增加有利于提高酶活性、热稳定性和耐酸性。MD模拟表明，这两个突变位点共同作用稳定了N端和活性中心，从而提高了PjxA的结构的刚性。此外，酶的比表面积增大，底物结合口袋和扩展的分子动态相关网络都有助于提高的酶-底物亲和力。PjxA的热稳定性提高，使其在木聚糖水解行业的竞争力和适用性得到提升。此外，S82N和D45N作为优势位点，可为提高GH11酸性木聚糖酶的热稳定性提供参考。

原文：Improvement the thermostability and specific activity of acidic xylanase PjxA from Penicillium janthinellum via rigid flexible sites

DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.135399

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