《AEM》通过宏基因组学洞察海带相关微生物群对褐藻多糖的动态降解性
文摘
科学
2024-09-27 15:54
江苏
2023年11月，Yi-Shuo Zhang等人在《Applied and Environmental Microbiology》上发表了一篇题为Metagenomic insights into
the dynamic degradation of brown algal polysaccharides by kelp-associated
microbiota的研究性论文。
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通讯单位：State Key Laboratory of Microbial Technology,
Marine Biotechnology Research Center, Shandong University, Qingdao, China.
Abstract
海洋细菌在海藻多糖的降解和循环中起着重要作用。然而，海带腐烂过程中附生细菌群落的动态及其在海藻多糖降解中的作用尚不清楚。在这里，我们进行了宏基因组分析，研究了海带Saccharina japonica早期和晚期腐烂阶段附生细菌群落的特征和预测代谢能力。在海带腐烂过程中，主要的附生细菌群落从Gammaproteobacteria转变为Verrucomicrobia和Bacteroidetes。在海带S.
japonica的早期腐烂阶段，附生细菌主要以来源于海带的不稳定的褐藻胶为降解目标，其中γ-变形杆菌弧菌科（特别是弧菌）和冷单胞菌科（特别是冷单胞菌属）是关键的褐藻胶降解菌，它们中富含属于多糖裂解酶（PL）家族PL6、PL7和PL17的褐藻胶降解酶。更为复杂的岩藻多糖在S. japonica腐烂后期更易被附生细菌降解，这些细菌主要来自Verrucomicrobia（特别是Lentimonas）、Planctomycetes的Pirellulaceae（特别是Rhodopirellula）、Kiritimatiellota的Pontiellaceae和Bacteroidetes的Flavobacteriaceae，它们依赖于使用GH29、GH95和GH141家族的糖苷水解酶（GH）以及S1_15、S1_16、S1_17和S1_25家族的硫酸酯酶来解聚岩藻多糖。基于宏基因组组装基因组的分析，重建了优势附生细菌群体中海藻多糖降解的途径。本研究揭示了不同附生细菌在褐藻多糖降解中的作用。重要性：海带是沿海海洋生态系统中重要的初级生产者。多糖作为褐藻生物质的主要成分，构成了海洋中很大一部分有机碳。然而，对于海带腐烂过程中参与褐藻多糖降解过程的附生细菌的身份和途径的了解仍然不清楚。本文基于宏基因组分析，研究了 Saccharina japonica 腐烂早期和晚期阶段附生细菌群落的演替及其代谢潜力。我们的研究揭示了在海带腐烂过程中藻类多糖降解细菌的转变，从降解藻酸盐的伽马变形菌转变为降解岩藻聚糖的疣微菌、浮霉菌、基里蒂马蒂菌和拟杆菌。提出了一种在海带腐烂过程中附生微生物对藻类细胞壁多糖（一种复杂的有机碳）进行动态降解的模型。这项研究加深了我们对附生细菌在海洋藻类碳循环以及藻类培养中病原体控制中的作用的理解。
褐藻是沿海海洋生态系统中重要的初级生产者，每年为全球初级生产贡献约1亿吨生物量。在褐藻中，海带目可以形成海带林，这是海洋中最具生产力的生态系统之一。海带林通过藻类渗出或细胞死亡，将其光合作用产生的大量碳以溶解有机碳和颗粒有机碳的形式输出到周围的海水和深海。异养海洋细菌负责代谢和再矿化藻类衍生的有机碳，从而在藻类碳循环中发挥关键作用。
多糖是大型藻类生物质的主要成分，构成了海洋中有机碳的很大一部分。在褐藻中，褐藻胶、岩藻多糖和昆布多糖是主要的多糖，其相对丰度因物种和季节而异。褐藻胶通常是褐藻细胞壁中最丰富的多糖，占其干重的40%。它是一种线性多糖，由两个糖醛酸单体，β-D-甘露糖醛酸和它的C5-异构体α-L-古洛糖醛酸组成，并通过1,4-糖苷键连接。宏基因组和基因组分析表明，海洋褐藻胶降解细菌主要隶属于拟杆菌门和γ变形菌门。褐藻胶的微生物降解是由褐藻胶裂解酶催化这种多糖解聚引发的。在寒冷沿海沉积物的宏基因组中，检测到细菌的褐藻胶裂解酶基因大部分属于多糖裂解酶(PL)家族，包括PL6、PL7和PL17。岩藻多糖也是褐藻细胞壁中的结构性多糖，占其干重的3%-28%。它是一种高度异质的硫酸化多糖，具有复杂的分支结构。除岩藻糖外，岩藻多糖还包括其他单糖，如半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和糖醛酸。岩藻多糖根据糖骨架分为两大类: 由α-1,3或交替的α-1,3/1,4连接的L-岩藻糖组成，在O-2、O-3或O-4上硫酸化，以及由甘露糖、半乳糖或葡萄糖醛酸组成，并带有硫酸化岩藻糖分支的的异型岩藻多糖。由于其复杂的化学结构，岩藻多糖被海洋细菌降解的速度比昆布多糖和其他不稳定的褐藻多糖要慢。到目前为止，只有来自拟杆菌门，γ变形菌门和浮霉菌属-疣微菌门-衣原体(PVC)的有限数量的海洋细菌分离物被报道具有岩藻多糖降解能力。海洋疣微菌属“Lentimonas”sp.
CC4是一种高度专门化的岩藻多糖降解菌，它使用数百种酶来分解岩藻多糖，主要是来自糖苷水解酶(GH)家族GH29、GH95和GH141的外切酶。根据对潮间带沉积物和藻华期间微生物群落的宏基因组分析，参与海洋岩藻多糖降解的酶大部分属于GH29和GH95科，主要分布在拟杆菌门、γ变形菌门和PVC群中。昆布多糖是褐藻中主要的胞内储存多糖，占其干重的35%。与褐藻胶和岩藻多糖相比，它的结构相对简单，由具有β-1,3-连接骨架（20-30个残基）和少部分的β-1,6-连接分支的葡萄糖单体组成。昆布多糖也存在于硅藻中。在硅藻为主的水华过程中，拟杆菌门和γ变形菌门被认为是关键的昆布多糖降解菌，它们编码的糖苷水解酶通常来自GH3、GH16、GH17和GH30家族，用于昆布多糖降解。藻类相关细菌和自由生活细菌在藻类多糖的降解和循环中都起着至关重要的作用。与浮游细菌降解藻多糖的广泛研究相比，关于附生菌在藻多糖循环中的作用的报道要少得多。与巨藻属和其他褐藻相关的微生物群落表现出与周围海水中不同的特征。此外，附生菌的多样性和组成可能受到寄主物种身份、叶片组织年龄和海带状况的影响，并表现出季节性演替。虽然一些与海带相关的海洋细菌的多样性和褐藻胶降解潜力的宏基因组研究包括巨藻和裙带菜已被报道，但海带腐烂过程中附生微生物群落的演替动态及其降解岩藻多糖、昆布多糖和其他藻类多糖的代谢能力尚不清楚。海带的典型代表种日本海带（Saccharina
japonica，以前称为Laminaria japonica）是野生种群的多年生藻类，其孢子体的寿命为两年一次，在亚洲也有一年或两年一次的栽培。海带的自然降解过程复杂，受多种因素影响。在这里，为了简化日本海带的腐烂过程并集中研究主要的海带相关微生物，我们使用了相对简单的实验室腐烂模拟物。通过宏基因组分析，研究了日本海带腐烂过程中附生微生物群落的演替及其降解褐藻多糖（包括海藻酸盐、岩藻聚糖和昆布多糖）的代谢潜力。基于宏基因组组装基因组（MAG），重建了优势附生细菌群落中藻多糖降解的途径。最后提出了海带腐烂过程中附生微生物动态降解藻类多糖的模型。
1.海带腐烂过程中附生细菌群落的变化
2019年9月，在中国渤海潮间带采集到Saccharina
japonica海带。为了了解海带腐烂过程中附生细菌群落的动态，利用从海带S. japonica腐烂早期和晚期表面拭取的细菌中提取的环境DNA构建了鸟枪法宏基因组测序文库。两个样本共获得52.12 Gb干净数据，占原始数据总量的99.8%(数据集S1)。在从海带宿主中去除读数后，剩余的干净读数被组装成0.39至0.42
Gb的重叠群，平均N50为2,447 bp(数据集S1)。基于宏基因组数据的分类分析显示，γ变形菌门在附生细菌群落中占主导地位，在腐烂早期和晚期分别占总数的77.5%和57.4%(图1)。在腐烂早期，来自γ-变形菌门的莫拉氏菌科（31.4%）和弧菌科（27.2%）的成员最丰富，在腐烂晚期分别下降到18.4%和1.0%。在早期腐烂阶段也检测到相当数量的肠杆菌科，包括γ-变形菌门（3.4%）、梭状芽孢杆菌属（3.7%）和梭杆菌属（4.1%），而在晚期腐烂阶段，它们的相对丰度低于0.5%。在腐烂后期在腐解后期，以来自γ变形菌门的海洋螺菌科（19.4%）和莫拉氏菌科（18.4%）为主。α变形菌门、黄杆菌（拟杆菌门）和疣微菌纲（疣微菌门）的相对丰度从腐烂早期的≤2.0%显著增加到腐烂晚期的6.7%~
12.7%。此外，来自γ变形菌门的盐单胞菌科成员(特别是科贝特氏菌属)在海带腐烂过程中持续出现，约占群落组成的4.0%(图1)。在属水平上，γ变形菌门中的莫拉菌科的嗜冷杆菌属数量最多，占18.2% ~ 31.0%。其他属包括弧菌属(γ变形菌门中的弧菌科，占17.6%)、光杆菌属(γ变形菌门中的弧菌科，占6.6%)和梭菌属(梭菌门中的梭菌科，占3.4%)在早期腐烂阶段占主导地位。而海洋螺菌属(γ变形菌门中的海洋螺菌科，占12.4%)，嗜热杆菌属（α变形菌门中的玫瑰杆菌科，4.7%）、海洋杆菌属(γ变形菌门中的海洋杆菌科，4.5%)和海洋单胞菌属(γ变形菌门中的海洋螺菌科，3.5%)在腐烂后期富集。在藻类腐烂过程中观察到的附生细菌群落的变化(图1)可能与海带S.japonica的腐烂条件有关，这可能是由于不同附生细菌群在利用褐藻多糖方面的能力不同。![]()
图1.与 S. japonica 相关的细菌类群在早期 (a) 和晚期 (b) 腐烂阶段的相对丰度。“其他细菌”代表在类别水平上相对丰度低于 1% 的细菌群。2.褐藻胶降解菌及其褐藻胶裂解酶基因的变化
在褐藻中，最丰富的多糖通常是褐藻胶，而细菌分泌的褐藻胶裂解酶被认为是其降解的关键。目前，根据CAZy数据库，褐藻胶裂解酶被划分为14个多糖裂解酶家族，包括PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39和PL41。宏基因组分析显示，褐藻胶降解附生细菌及其褐藻胶裂解酶基因在海带腐烂过程中发生了变化(图2)。在海带S. japonica的早期腐烂阶段，在附生细菌中共鉴定出113个褐藻胶裂解酶基因，主要属于γ变形菌门，其次是拟杆菌门(图2a和c)。在这些基因中，38.9%的基因编码潜在的胞外酶(图2a)。大多数（80.0%）预测的细胞外褐藻胶裂解酶属于 PL7 家族，主要归属于Gammaproteobacteria的弧菌科（特别是弧菌）和Psychromonadaceae（特别是Psychromonas）（图2b 至 d）。此外，一小部分(14.4%)预测的胞外褐藻胶裂解酶是PL6和PL17酶，主要存在于拟杆菌门(如黄杆菌科)中(图2b至d)。已经表征的PL6和PL7褐藻胶裂解酶表现出不同的底物特异性和作用方式。而PL17酶通常作为外切低聚褐藻胶裂解酶，可将褐藻胶寡糖降解为不饱和单糖。上述携带胞外褐藻胶裂解酶基因的细菌群被认为是潜在的褐藻胶降解菌。此外，大多数潜在的胞内褐藻胶裂解酶被归为PL17、PL15和PL7，主要分布在弧菌科(特别是弧菌)、冷单胞菌科(特别是冷单胞菌)和黄杆菌科(图2)，强调了它们在降解早期腐烂的海带中褐藻胶的关键作用。与早期腐烂阶段相比，在腐烂后期检测到的细菌褐藻胶裂解酶基因数量相似，但丰度显著降低(图2a)。在腐烂后期，在携带褐藻胶裂解酶基因的附生细菌中，γ变形菌门的成员显著减少，同时拟杆菌门、疣微菌门和浮霉菌门的成员显著增加(图2c)。大多数褐藻胶裂解酶，包括潜在的胞外和胞内酶，属于PL6、PL7和PL17家族，主要分布在γ变形菌门(如冷单胞菌科)、拟杆菌门的黄杆菌科和疣微菌门(特别是Puniceicoccaceae)中(图2d)，这表明这些细菌群在降解晚期腐烂的海带来源的褐藻胶中发挥了重要作用。在巴塔哥尼亚大陆架，添加的褐藻胶几乎可以在7天内被交替单胞菌科和其他浮游细菌完全降解。与晚期腐烂海带相关的褐藻胶降解细菌数量较低，这表明大多数海带衍生的褐藻胶可能在 S. japonica 相对早期的腐烂阶段被附生细菌降解。在褐藻胶裂解酶的作用下，褐藻胶在细胞外被降解为低聚物，进一步被细菌细胞吸收和利用。因此，我们还研究了海带腐烂过程中参与褐藻胶利用的外膜转运蛋白基因及其相关细菌群的变化。褐藻胶低聚物通过大多数褐藻胶降解细菌的多糖利用位点(PUL)系统编码的可预测的SusC转运蛋白被转运到周质中，并可能通过弧菌菌株中的孔蛋白KdgM/N。与观察到的附生细菌褐藻胶裂解酶基因的下降一样，与早期相比，它们参与褐藻胶利用的外膜转运基因的相对丰度在后期下降，进一步支持褐藻胶在相对较早的腐烂阶段优先被附生细菌降解。在腐烂早期，参与褐藻胶利用的外膜转运蛋白基因主要分布在弧菌科(尤其是弧菌)中，其次是黄杆菌科和拟杆菌科。![]()
图2.海带腐烂过程中，降解褐藻胶的附生细菌及其褐藻胶裂解酶基因发生变化。（a）预测的细胞外和细胞内褐藻胶裂解酶基因相对丰度的变化。每个样本显示了相关褐藻胶裂解酶基因的相对丰度和数量（括号中）。（b）预测的细胞外和细胞内褐藻胶裂解酶基因家族的变化。（c）含有预测的细胞外或细胞内褐藻胶裂解酶基因的细菌群在类别水平上的变化。在（b）和（c）中，“X1-Extra”和“X1-Intra”分别表示预测的早期腐烂海带相关细菌的细胞外或细胞内褐藻胶裂解酶基因，“X2-Extra”和“X2-Intra”分别表示预测的晚期腐烂海带相关细菌的细胞外或细胞内褐藻胶裂解酶基因。(d) 热图显示了预测的细胞外褐藻胶裂解酶基因及其相关细菌群的相对丰度 (log2) 的详细变化。热图中的颜色表示相对基因丰度，范围从高 (黑色) 到低 (白色)。热图顶部显示了每个家族的褐藻胶裂解酶基因的相对丰度和数量 (括号中)。3.岩藻多糖降解细菌及其岩藻多糖降解基因的变化
除了褐藻胶，岩藻多糖也是褐藻细胞壁中的一种结构性多糖。从中国青岛培养的海带S. japonica中提取的岩藻多糖糖馏分，含有75%的1,3-连接岩藻糖残基和25%的1,4-连接岩藻糖残基，在骨架中的O-4和/或O-2被硫酸化。在CAZY数据库中，针对岩藻多糖中岩藻糖苷键的岩藻多糖酶分为七个家族，包括GH29、GH95、GH107、GH139、GH141、GH151和GH168。在海带腐烂过程中，附生细菌倾向于利用GH29、GH95和GH141酶降解岩藻多糖(图3)。目前，GH29、GH95和GH141家族的岩藻多糖活性糖苷键水解酶都是外切酶。因此，我们假设，降解岩藻多糖的附生细菌可能主要通过外酶如高度专业化的岩藻多糖降解菌“Lentimonas”sp.
CC4来分解和利用海带衍生的岩藻多糖。
在海带S.
japonica腐烂早期，检测到的岩藻多糖酶基因数量和丰度相对较低，几乎全部分布在拟杆菌门(黄杆菌科和紫单胞菌科)中(图3)。然而，在海带腐烂晚期，岩藻多糖酶基因的数量和丰度显著增加，胞外与胞内岩藻多糖酶基因的丰度比进一步增大(图3a)，说明附生细菌主要在腐烂后期更倾向于利用复杂的岩藻多糖。在腐烂晚期，主要的岩藻多糖降解细菌群落从拟杆菌门的成员转变为疣微菌门、浮霉菌门和基里蒂马提拉菌门的成员(图3)。疣微菌属（特别是慢单胞菌属）是具有推测的岩藻多糖酶基因最丰富的细菌类群(图3d)。浮霉菌门中的浮球菌科属(特别是红螺旋菌属)、基里蒂马提拉菌门中的蓬蒂埃拉菌科(特别是蓬蒂埃拉菌属)和拟杆菌门中的黄杆菌科也有助于岩藻多糖的降解(图3d)。岩藻多糖不同于褐藻胶、昆布多糖和其他褐藻多糖，岩藻多糖是一种高度硫酸化的多糖。除了糖苷水解酶，微生物降解岩藻多糖还涉及到硫酸酯酶。然而，到目前为止，硫酸酯酶及其细菌来源在海洋环境中的分布在很大程度上是未知的。因此，我们分析了海带腐烂过程中硫酸酯酶基因及其相关菌群的变化(图4)。与岩藻多糖酶基因(图3a)一样，后期的硫酸酯酶基因数量和丰度都高于早期(图4a)。此外，胞外与胞内硫酸酯酶基因的丰度比在后期也有所增加(图4)，进一步证明附生细菌对岩藻多糖的降解主要发生在腐烂后期。目前，根据SulfAtlas数据库，已鉴定的岩藻多糖硫酸酯酶可分为5个家族，分别为S1_13、S1_15、S1_16、S1_17和S1_25。在海带腐烂过程中，携带硫酸酯酶基因的附生细菌群从拟杆菌门和γ变形菌门的成员转移到PVC组的成员(图4c)。在腐烂后期，硫酸酯酶以属于S1_15、S1_16、S1_17和S1_25家族的潜在的岩藻多糖硫酸酯酶为主，主要分布在疣微菌门( 如慢单胞菌属、疣微菌科和未分类的丰祐菌纲)、基里蒂马提洛塔门(特别是蓬蒂埃拉菌科的蓬蒂埃拉菌属)、和拟杆菌门(特别是黄杆菌科)(图4d)，进一步表明这些细菌群在岩藻多糖降解中的重要作用。![]()
图3.海带腐烂过程中，降解岩藻聚糖的附生细菌及其岩藻多糖酶基因的变化。（a）预测的胞外和胞内岩藻多糖酶基因相对丰度的变化。每个样本显示了相关岩藻多糖酶基因的相对丰度和数量（括号中）。(b) 预测的胞外和胞内岩藻多糖酶基因家族的变化。(c) 含有预测的细胞外或细胞内岩藻多糖酶基因的细菌群在类别水平上的变化。在 (b) 和 (c) 中，“X1-Extra” 和“X1-Intra” 分别表示来自早期腐烂海带相关细菌的预测细胞外或细胞内岩藻多糖酶基因，“X2-Extra” 和“X2-Intra” 分别表示来自晚期腐烂海带相关细菌的预测细胞外或细胞内岩藻多糖酶基因。(d) 热图显示了预测的细胞外岩藻多糖酶基因及其相关细菌群的相对丰度 (log2) 的详细变化。热图中的颜色表示相对基因丰度，范围从高 (黑色) 到低 (白色)。热图顶部显示了每个家族的岩藻多糖酶基因的相对丰度和数量 (括号中)。![]()
图4.海带腐烂过程中产生硫酸酯酶的附生细菌及其硫酸酯酶基因的变化。（a）预测的胞外和胞内硫酸酯酶基因相对丰度的变化。每个样本都显示了相关硫酸酯酶基因的相对丰度和数量（括号中）。（b）预测的细胞外和细胞内硫酸酯酶基因家族的变化。(c) 含有预测的细胞外或细胞内硫酸酯酶基因的细菌群在类别水平上的变化。在 (b) 和 (c) 中，“X1-Extra” 和“X1-Intra” 分别表示来自早期腐烂海带相关细菌的预测细胞外或细胞内硫酸酯酶基因，“X2-Extra” 和“X2-Intra” 分别表示来自晚期腐烂海带相关细菌的预测细胞外或细胞内硫酸酯酶基因。(d) 热图显示了预测的细胞外硫酸酯酶基因及其相关细菌群的相对丰度 (log2) 的详细变化。热图中的颜色表示相对基因丰度，范围从高 (黑色) 到低 (白色)。热图顶部显示了每个家族的硫酸酯酶基因的相对丰度和数量 (括号中)。4.昆布多糖降解细菌及其昆布多糖降解基因的变化分析
昆布多糖是一种葡聚糖，是褐藻中主要的胞内储存多糖。褐藻中昆布多糖的相对丰度会因物种、季节和栖息地而异。2012年8月从库纳什尔岛(鄂霍次克海)采集的海带S. japonica样本被发现只含有0.8%的昆布多糖。在海带腐烂过程中，分泌潜在昆布多糖降解酶的附生细菌丰度低(图5)可能反映了本研究中海带S. japonica样品中昆布多糖含量较低。在海带S. japonica的早期腐烂阶段，参与昆布多糖降解的最多的葡聚糖酶属于GH3家族，主要归属于拟杆菌科（如拟杆菌科和黄杆菌科）（图5d）。在腐烂后期，除拟杆菌科外，Kiritimatiellota（特别是Pontiellaceae）和Verrucomicrobia（特别是Verrucomicrobiaceae）也是潜在的昆布蛋白降解菌，它们富含GH3和GH128葡聚糖酶（图5d）。表征的GH3葡聚糖酶通常是外切酶，可以从昆布多糖和其他葡聚糖中释放葡萄糖，而GH128酶对β-1,3-葡聚糖表现出多种外切和内切活性。值得注意的是，在海带腐烂过程中，一些附生γ变形菌群(例如肠弧菌和海龟细菌)似乎不能分泌昆布多糖酶/葡聚糖酶，但在细胞内具有潜在的GH1、GH3或其他葡聚糖酶。这表明它们更倾向于利用昆布多糖低聚物而不是聚合的昆布多糖。这些细菌可能通过吸收其他降解者产生的昆布多糖低聚物，参与腐烂的海带衍生的昆布多糖的降解。
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图5.海带腐烂过程中昆布多糖降解附生细菌及其昆布多糖降解基因的变化。（a）预测的细胞外和细胞内昆布多糖降解基因的相对丰度变化。每个样本都显示了相关昆布多糖降解基因的相对丰度和数量（括号中）。(b) 预测的胞外和胞内昆布多糖降解基因家族的变化。(c) 含有预测的胞外或胞内昆布多糖降解基因的细菌群在类别水平上的变化。在 (b) 和 (c) 中，“X1-Extra”和“X1-Intra”分别表示来自早期腐烂海带相关细菌的预测胞外或胞内昆布多糖降解基因，“X2-Extra”和“X2-Intra”分别表示来自晚期腐烂海带相关细菌的预测胞外或胞内昆布多糖降解基因。(d) 热图显示了预测的胞外昆布多糖降解基因及其相关细菌群的相对丰度 (log2) 的详细变化。热图中的颜色表示相对基因丰度，范围从高 (黑色) 到低 (白色)。热图顶部显示了每个家族的昆布多糖降解基因的相对丰度和数量 (括号中)。为了预测褐藻多糖在附生细菌中的降解途径，我们组装了32个完整性>70%且污染<6%的非冗余细菌MAG。这些MAGs被划分为11个细菌类别，在附生宏基因组中表现出显著的丰度(图1)。这些MAGs中的18个，包括7个γ变形菌门MAGs,
4个黄杆菌门MAGs, 2个丰祐菌纲 MAGs，以及螺旋体门,芽孢杆菌纲, α变形菌纲，疣微菌纲和基里蒂马提拉菌纲中的单个MAG，都具有藻类多糖降解基因(图6和7)，表明它们具有降解褐藻多糖的能力。![]()
图6. 热图显示了 MAG 中假定的褐藻多糖降解酶的同源物的数量。![]()
图7.附生 MAG 中的关键褐藻胶降解基因 (a) 和岩藻多糖降解基因 (b)。根据其功能注释，使用不同颜色的箭头表示开放阅读框 (ORF)。根据 dbCAN 和 Pfam 分析，指示了假定的褐藻胶裂解酶、GH 和硫酸酯酶。MFS，主要设施超家族；TRAP，三部分 ATP 独立周质；ABC，ATP 结合盒。6. γ变形菌利用褐藻胶途径的重建
七种Gammaproteobacteria MAG，包括两种Pseudoalteromonas MAG（X1_bin3和 X2_bin5）、两种 Shewanella MAG（X1_bin53和 X2_bin34）、一种 Psychromonas MAG（X1_bin8）、一种 Cobetia MAG（X2_bin1）和一种 Marinomonas MAG（X2_bin13），都含有褐藻胶裂解酶基因（图 6 和7），表明它们具有降解褐藻胶的能力。除 X1_bin8 外，所有这些 MAG 都仅具有褐藻胶降解基因，而没有其他藻类多糖降解基因，表明它们具有作为专门的褐藻胶降解剂的潜力。据报道，Pseudoalteromonas、Shewanella、Psychromonas、Cobetia和 Marinomonas 属的成员具有褐藻胶降解能力。利用褐藻胶的细菌有三种降解褐藻胶的途径，大多数褐藻胶降解细菌的PUL系统，γ变形菌弧菌菌株的“分散”系统，以及α变形菌菌株鞘氨单胞菌A1及其近缘菌的“坑”运输系统。标志性susC基因的存在(图7a)表明，这些γ变形菌MAGs似乎通过PUL系统利用褐藻胶。预计这些MAGs会分泌一到四种属于PL6, PL7和/或PL17的胞外褐藻胶裂解酶，这些酶可以将聚合褐藻胶分解成低聚物。一旦通过SusC转运蛋白转运到周质空间，低聚物被来自PL17或其他家族的褐藻胶裂解酶进一步降解为不饱和单糖。不饱和单糖随后通过内膜MFS渗透酶转运到细胞质中(图8a)。这些γ变形菌MAGs拥有所有的进一步分解不饱和单糖所必需的酶基因，kdgF ,dehR ,kdgK和eda。通过这四种酶，细胞内单糖将被转化为三磷酸甘油醛和丙酮酸，进入糖酵解途径(图8a)。![]()
图8.预测代表性附生 MAG 中褐藻多糖的降解途径。（a）X1_bin53（希瓦氏菌科）。（b）X1_bin16（肠杆菌科）。（c）X2_bin3（红藻科）。（d）X2_bin21（Pontiellaceae）。（e）X1_bin9（黄杆菌科）。（f）X2_bin33（黄杆菌科）。参与褐藻胶、岩藻多糖和昆布多糖利用的酶分别用红色、绿色和蓝色表示。褐藻胶、岩藻多糖和昆布多糖多糖利用中涉及的转运蛋白的符号分别显示为红色、绿色和蓝色。实线箭头表示酶促反应，虚线箭头表示运输。未知的转运蛋白用问号 (?) 表示。根据 PSORTb v3.0 (57) 和 CELLO v.2.5 结合 SignalP 5.0 预测酶/转运蛋白的细胞位置，未显示无法预测细胞位置的酶。DEH，4-脱氧-L-赤式-5-己糖醛酸；KDG，2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸；KDPG，2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸。所有来自PVC组的四个MAGs，包括X2_bin3,
X2_bin9, X2_bin16和X2_bin21，都是从晚期腐烂的海带相关细菌宏基因组中重建的。这些MAGs含有3-50个来自GH29、GH95和/或GH141家族的外切岩藻多糖酶的同源物，0-5个来自内切GH168岩藻多糖酶的同源物，以及23-41个来自S1_15、S1_16、S1_17和S1_25家族的岩藻多糖硫酸酯酶的同源物(图6)，表明它们在岩藻多糖降解中的作用。X2_bin3、X2_bin9和X2_bin21可以分泌一系列岩藻多糖酶和岩藻多糖硫酸酯酶，将岩藻多糖降解为部分脱硫的岩藻低聚糖(图8c和d)，而X2_bin16似乎针对岩藻寡糖降解，可能是由于细胞外缺乏岩藻多糖酶。据报道，一些拟杆菌门具有针对岩藻多糖的PULs，其中岩藻多糖降解基因与一些外膜susC基因聚集在一起。这些PULs中编码的SusC蛋白被认为可以促进岩藻寡糖和岩藻糖进入这些拟杆菌门。然而，来自PVC组的所有MAGs都缺乏这种SusC蛋白的同源物，并且迄今为止，PVC组中负责导入胞外岩藻寡糖的外膜运输载体仍然未知。一旦进入周质，这些寡糖就会被周质岩藻多糖酶和岩藻多糖硫酸酯酶进一步水解成岩藻糖。然后，岩藻糖通过L-岩藻糖/H+协同载体FucP进入细胞质。目前，目前，细菌岩藻糖分解代谢分为两种途径，涉及激酶的磷酸化途径和不含激酶的非磷酸化途径。两种 Puniceicoccaceae MAG（X2_bin3 和X2_bin9）被认为采用磷酸化细菌微区室(BMC) 途径代谢岩藻糖（图8c），类似于 PVC 组的其他岩藻多糖降解细菌，例如“Lentimonas” sp. CC4和 Planctomyces limnophilus。在变旋酶FucU、FucI异构酶、FucK激酶和FucA醛缩酶的作用下，细胞内的岩藻糖转化为有毒的乳醛中间体，最终在BMC中发酵成1,2-丙二醇和乳酸(图8c)。与利用岩藻糖的大肠杆菌菌株一样，蓬蒂埃拉菌科 MAG (X2_bin21)似乎采用了不含BMC的磷酸化途径(图8d)。在这一途径中，岩藻糖通过FucU、FucI、FucK和FucA酶依次转化为醛，然后醛被脱氢酶AldA有氧氧化为乳酸，或被还原酶FucO厌氧还原为1,2-丙二醇(图8d)。除外膜转运基因外，X2_bin21具有一个内膜toaABC转运基因和利用褐藻胶所需的所有酶基因(图8d)。这表明X2_bin21也有降解褐藻胶的能力，这在基里蒂马蒂门中从未报道过。虽然没有发现变旋酶FucU/FucM，但阿克曼菌科MAG
(X2_bin16)似乎使用非磷酸化的岩藻糖途径(路线III)，类似于黄单胞菌。除了FucU/FucM外，该途径还涉及其他酶，包括脱氢酶FucD (EC 1.1.1.122)、水解酶FucB、脱氢酶FucC、脱氢酶FucF和水解酶FucG，将岩藻糖转化为乳酸和丙酮酸。众所周知，拟杆菌门的成员在多种PULs促进的多糖降解中起着关键作用。基因组分析显示，五种黄杆菌科MAGs中有四种，包括X1_bin9、X1_bin54、X2_bin25和X2_bin33，具有针对褐藻胶、昆布多糖和岩藻多糖的PUL（图7），表明它们具有很强的降解褐藻多糖的能力。像其他拟杆菌门一样，这些黄杆菌科MAGs具有通过PUL系统利用昆布多糖的完整途径(图8e和f)。它们还具有代谢昆布多糖所需的所有转运蛋白和酶(图8e和f)。这些MAGs可以分泌几种推测的GH16 β-1,3-葡聚糖酶和其他葡聚糖酶，将细胞外昆布多糖裂解成寡糖，通过SusC转运到周质，并被潜在的周质GH3和/或其他葡聚糖酶水解成葡萄糖。一旦通过MFS进入细胞质，葡萄糖通过糖酵解途径进一步分解代谢(图8e和f)。尽管在这些MAGs中参与岩藻多糖降解的潜在岩藻多糖酶和岩藻多糖硫酸酯酶的数量和家族不同，但岩藻多糖利用的核心途径，包括岩藻多糖在细胞外分解成低聚岩藻糖，岩藻寡糖在周质内水解成岩藻糖，以及岩藻寡糖/岩藻糖的运输保持一致(图8e和f)。然而，岩藻糖的分解代谢途径在这些MAGs中是不同的。X1_bin9、X1_bin54和X2_bin25倾向于使用不含BMC的磷酸化途径来分解岩藻糖(图8e)，而X2_bin33似乎会使用非磷酸化的岩藻糖途径(途径III)(图8f)。最近，发现杆菌门丹毒科细菌参与了岩藻多糖的降解。然而，丹毒科在褐藻胶降解中的作用尚不清楚。褐藻胶的内膜ABC转运蛋白的同源物、三种潜在的细胞内褐藻胶裂解酶和单糖分解代谢酶(KdgF、DehR、KdgK和Eda)的存在表明，丹毒科MAG (X1_bin7)可能有助于褐藻胶的降解。此外，基因组分析表明，α-变形菌ParashinghorhabdusMAG（X2_bin11）倾向于使用PUL系统进行褐藻胶代谢，这与其近亲鞘氨醇单胞菌A1的“坑”运输系统不同。到目前为止，关于藻类降解螺旋体属的报道很少，螺旋体属在藻类多糖降解中的作用很大程度上是未知的。与海带相关的晚期腐烂螺旋藻科MAG(X2_bin45)具有代谢褐藻胶所需的所有转运蛋白(SusC和MFS)和酶，可能采用PUL系统来利用褐藻胶。除了潜在的细胞内岩藻多糖酶外，X2_bin45还具有利用岩藻糖所必需的转运蛋白(SusC转运蛋白、ABC转运蛋白和TRAP转运蛋白)和酶(图7b)，表明它更倾向于使用岩藻糖/岩藻寡糖而不是聚合物岩藻多糖。预测X2_bin45会使用没有BMC的磷酸化途径来分解岩藻糖。此外，X2_bin45具有利用昆布多糖的完整途径。此外，基因组分析表明，肠杆菌科MAG (X1_bin16)不能降解岩藻多糖或其他褐藻多糖，但似乎可以分解岩藻糖。除外膜转运基因外，X1_bin16含有一个内膜ABC转运基因和所有磷酸化岩藻糖途径所需的酶基因，而不含BMC。10. 海带腐烂过程中附生微生物群降解褐藻多糖的建议模型途径基于宏基因组分析，提出了海带降解早期和后期阶段附生微生物群对海藻多糖的动态降解模型(图9)。在海藻腐烂过程中，与海带S. japonica相关的海藻多糖降解细菌从γ变形菌门转变为PVC类群和拟杆菌门。海带衍生的不稳定的褐藻胶在相对较早的腐烂阶段被附生细菌降解，主要属于γ变形菌门弧菌科(特别是弧菌)和冷单胞菌科(特别是冷单胞菌)，它们富含PL6、PL7和PL17褐藻胶裂解酶(图9)。冷单胞菌、希瓦氏菌和其他属可能分泌不止一种类型的褐藻胶裂解酶来降解褐藻胶(图9)。此外，这些γ变形菌门中的一些具有褐藻胶利用途径(图8)，支持γ变形菌门在褐藻胶降解中的作用。在腐烂后期，更复杂的岩藻多糖成为首选的降解底物，主要由附生疣微菌（特别是 Lentimonas）、浮霉菌纲的Pirellulaceae（特别是Rhodopirellula）、Kiritimatiellota的 Pontiellaceae 和拟杆菌纲的 Flavobacteriaceae 降解，这些菌群富含GH29、GH95 和 GH141 家族的糖苷水解酶以及S1_15、S1_16、S1_17 和S1_25 家族的硫酸酯酶（图9）。PVC类群的许多属(如慢单胞菌属、蓬蒂菌属和红螺旋菌属)和拟杆菌门(如卓贝尔氏菌属、福尔摩沙菌属)与晚期腐烂的海带相关，可以产生多种参与岩藻多糖降解的糖苷水解酶和硫酸酯酶(图9)。此外，从晚期腐烂阶段重建的 PVC 组中的所有四个MAG 都具有岩藻多糖利用途径（图 8），进一步表明 PVC 组在岩藻多糖降解中发挥着作用，尤其是在 S. japonica 的晚期腐烂阶段。此外，从早期和晚期腐烂阶段重建的五个拟杆菌 MAG 中有四个具有利用褐藻胶、岩藻多糖和昆布多糖的途径（图 8），表明它们具有很强的降解褐藻多糖的能力。![]()
图9.建议一种模型，用于研究海带腐烂过程中附生微生物群对褐藻多糖的降解。与早期腐烂的日本海藻有关的褐藻胶降解细菌群的符号被缩放到相应细菌群的相对丰度（括号中），这些细菌群含有预测的胞外褐藻胶裂解酶。与晚期腐烂的S. japonica相关的岩藻多糖降解细菌群的符号大小与含有预测的细胞外岩藻多糖酶的相应细菌群的相对丰度（括号中为黑色）成比例。对于岩藻多糖降解细菌群，还显示了含有预测的细胞外硫酸酯酶的单个细菌群的相对丰度（括号中以绿色表示）。欧拉图显示了胞外藻类多糖降解酶在早期和晚期衰变阶段的分布，其中酶符号的大小根据每个样本中相应酶基因的相对丰度进行缩放，重叠区域代表某些附生细菌共有的酶。
综上所述，本文揭示了海带S.japonica腐烂过程中附生细菌群落的演替及其在褐藻多糖降解中的作用。这项研究为更好地了解附生细菌在藻类细胞壁多糖（海洋环境中一种复杂的有机碳形式）降解中的作用奠定了基础。
原文：Metagenomic insights into
the dynamic degradation of brown algal polysaccharides by kelp-associated
microbiotaDOI: https://doi.org/10.1128/aem.02025-23
