《JAFC》利用一种独特的外切褐藻胶裂解酶制备DEH和富含古洛糖醛酸的褐藻胶
文摘
科学
2024-08-16 22:36
江苏
2018年1月，来自Royal Institute of Technology (KTH)的Yves SY Hsieh等人在J. Agric. Food Chem.上发表了一篇题为Preparation of 4‑Deoxy‑L-erythro-5-hexoseulose Uronic Acid (DEH) and Guluronic Acid Rich Alginate Using a Unique exo-Alginate Lyase from Thalassotalea crassostreae的研究性论文。
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通讯单位：Division of Glycoscience, School of Biotechnology, Royal Institute of Technology (KTH), AlbaNova University Center, Stockholm, SE-106 91, Sweden
Abstract
海洋多细胞藻类被认为是生产可持续生物燃料和商品化学品的有前途的作物。然而，它们的商业开发目前受限于缺乏适当和有效的酶将褐藻胶转化为可代谢的结构单元，如4-Deoxy-l-erythro-5-hexoseulose糖醛酸(DEH)。在此，我们报道了从海洋细菌Thalassotalea crassostreae中发现的一种独特的外切型褐藻胶裂解酶，其对poly-β-D-甘露聚糖醛( poly M ) 褐藻胶具有优异的催化效率，kcat为135.8 s-1，对poly-α-L-古洛糖醛酸酯( poly G褐藻胶)的kcat降低了5倍，为25 s-1。我们认为这种对poly M的偏好性是由于蛋白质活性位点的结构特征。该酶的作用方式和专一性使得设计一种有效且环境友好的工艺用于生产DEH和低分子量的富含古洛糖醛酸的褐藻胶成为可能。
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褐藻胶是褐藻细胞壁中含量最丰富的多糖之一，约占细胞总干重的22-44 %。可食用的褐藻，包括kombo (Saccharina japonica和Laminaria japonica)和wakame (Undaria spp)，在中国、日本和韩国的传统菜肴中很常见，在苏格兰和爱尔兰等北欧国家也有食用褐藻的报道，特别是在沿海地区，居民经常收获糖海带(海带latissima)作为食物和饲料或用作有机肥。褐藻由于其较高的生长速率和糖含量，作为更复杂工艺的资源也具有极好的潜力。事实上，由于食品工业的强劲需求以及生物乙醇和商品化学生产部门的日益关注，预计到2024年，海洋生物质的市场将达到220亿美元。在过去的10年里，由于深入的研究，利用纤维素、层粘胶蛋白或甘露醇从褐藻中生产生物乙醇的方法已经有了显著的改进近年来，研究人员开发了代谢工程微生物，用于将褐藻胶发酵成乙醇。然而，利用褐藻胶生产生物乙醇仍然是发酵过程中的一个主要瓶颈，因为它们不寻常的糖组成。事实上，与纤维素和层粘胶蛋白水解产生的可发酵葡萄糖(Glc)不同，酸处理的褐藻胶会产生不可发酵的D-甘露醛酸(M)和葡醛酸(G)，其M/G比例取决于褐藻胶的来源褐藻胶的分解代谢途径是通过酶将聚合物分解成不饱和单糖4-Deoxy-l-erythro-5-hexoseulose糖醛酸 (DEH)而启动的。DEH随后被还原为2-keto-3-Deoxy-D-gluconate (KDG)，然后进入enner-Doudoroff途径，产生两分子丙酮酸，丙酮酸随后可转化为两分子乙醇10(方案1)。
方案1. 褐藻胶的结构与代谢。DEH: 4-Deoxy-l-erythro-5-hexoseulose糖醛酸
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迄今为止发现的大多数褐藻胶裂解酶都是内切褐藻胶裂解酶(endo-Alys)，包括聚β-D-甘露糖醛酸( Poly M)裂解酶、聚α-L-古洛糖醛酸(poly G)裂解酶和双功能poly M/G裂解酶，这些酶都得到了广泛的研究。其中一些胞内酶被商业销售，作为分子剪刀将褐藻胶剪切成低分子量的褐藻胶寡糖(AOs)。然而，为了从AOs中产生可代谢的糖衍生物DEH，必须额外招募外切型褐藻胶裂解酶(exo-Alys)，通过β-消除将AOs进一步分解为单体DEH，但目前仅有少数文献报道了表征的exo- Alys。
我们对DEH的体外活性知之甚少，只知道它是褐藻胶分解代谢途径中的第一个中间体(方案1)。有人提出DEH具有高度的细胞毒性，可以抑制现有乙醇微生物的生长，尽管这一点从未得到实验证实。为了获得高收率和高纯度的DEH，并为进一步研究和开发该化合物提供可能，有必要建立一种高效、简单的可规模化生产方法。在这里，我们报道了一种独特的外型褐藻胶裂解酶(TcAlg1)的发现和表征，包括详细的动力学分析，该酶来自海洋细菌Thalassotalea cassostrea。对该酶降解褐藻胶的产物进行了分析。我们展示了一种简单方便的方法，利用TcAlg1从廉价的褐藻胶来源高效生产纯DEH和富G的褐藻胶，以期提高褐藻胶在生物启发工业过程中的价值。
TcAlg1的编码基因为WP_068546885.1，这是迄今为止未知的一种来自Thalassotalea crassstreae基因组的基因。该蛋白全长738个氨基酸，理论分子量为82.8 kDa。多肽序列包括一个预测信号肽(SP)、一个褐藻胶裂解酶家族结构域和一个肝素酶Ⅱ/Ⅲ样结构域。为了开始评估TcAlg1的功能，我们进行了序列比对和同源性建模。首先，将TcAlg1的蛋白序列与先前从PL17家族中鉴定出的三种褐藻胶裂解酶进行比对，即糖噬菌降解2-40T的Alg17C，鞘单胞菌降解2-40T的AlgL-25，鞘单胞菌降解2-40T的AlgL-25，假单胞菌降解2-40T的AlgL-11和Aly2，利用Clustal Omega27和ESPript.28进行比对我们发现TcAlg1与这些PL17外切褐藻胶裂解酶的序列一致性约为50%，其中Alg17C与TcAlg1的序列一致性最高(54%)，其次是Aly2(49%)和AlgL(46%)。因此，我们预测TcAlg1也是一种外切褐藻胶裂解酶。在这些蛋白中，一些关键氨基酸高度保守，包括活性位点的Asn201、His202、Tyr258和Tyr450;Asn149、Arg260、Tyr261、His413和Arg438在底物结合位点；和His415, Asp433和His464在假定的Zn2+结合位点(图1)在TcAlg1中发现的肝素酶Ⅱ/Ⅲ样结合域尚不清楚是否具有催化活性，但该结合域确实含有高度保守的氨基酸His413和Arg 438，可能参与褐藻胶的结合。![]()
图1. TcAlg1与其他具有特征的PL17褐藻胶裂解酶的序列比对：糖噬菌降解2-40T的Alg17C，鞘单胞菌MJ3的AlgL，假单胞菌OS-ALG9的Aly2。保守残基用红色框表示，相似残基用未填充的红色字母框表示。参与金属结合、活性位点和底物结合的残基分别用黄色、红色和蓝色星号标记。
以Alg17C为模板，利用SWISS-MODEL在线工具生成TcAlg1结构的同源性模型如前所述，这些蛋白具有较高的序列同一性，因此，它们有望具有高度的结构相似性(图2A)。TcAlg1具有一个N端α6/α6-桶结构域，包含活性位点和底物结合位点，以及一个C端β-片结构域，包含Zn2+离子配位位点(图2A)。连接这些结构域的是一个环路，在Alg17C中显示，该环路在底物结合时移动(图2A和B)。![]()
图2. TcAlg1的模型结构。(A) TcAlg1模型结构(蓝色)与Alg17C晶体结构(黄色)叠加，整体结构一致性较好。(B) tcalg1的表面图，α6/α6桶催化结构域为深蓝色，c端β片结构域为青色，一个重要环为黄色。红球代表Zn2+离子。酶活性部位的寡糖配体以绿色棒状显示。(C) TcAlg1(青色)、天然Alg17C(粉色)和配体结合Alg17C(深蓝色)活性位点残基的底物配位。(D) TcAlg1(青色)、天然Alg17C(粉红色)和配体结合Alg17C(深蓝色)的Zn2+离子配位。(E)在Alg17C的活性位点(黄色)，在+2 gula结合亚位点附近发现一个Ile(红色)。在TcAlg1(蓝色)中，这个残基被一个精氨酸(红色)取代，它似乎阻止了GulA在这个亚位点的结合。
用天然和载脂蛋白形式的Alg17C晶体结构来研究其与寡糖配体(褐藻胶衍生的MMG)的相互作用。该配体已与我们的TcAlg1模型结构覆盖，以研究酶-底物相互作用。在活性位点、底物结合位点和Zn2+配位位点的关键氨基酸上，我们的TcAlg1模型和Alg17C的晶体结构具有良好的结构对偶性(图2C和D)。在Alg17C结构中，残基Lys198靠近活性位点，但似乎与配体的距离不够近，无法直接相互作用。然而，在TcAlg1模型中，这个残基被一个Arg取代，它与底物的古洛糖醛酸部分有足够的极性接触，并可能将该糖与活性位点口袋的+2亚位隔绝(图2E)。与Alg17C相比，这可能会改变TcAlg1对富含M和g的底物的偏好。然而，通过对模型结构的简单检查，尚不清楚该氨基酸是否真的对TcAlg1的底物特异性有影响。为了充分表征新发现的蛋白TcAlg1的功能，并潜在地将该酶用于工业应用，TcAlg1的生产必须优化到商业上可接受的水平。我们认为大肠杆菌生长速度快，产量高，成本效益高，维护简单，是一种有吸引力的表达宿主选择令人鼓舞的是，经过初步研究，我们能够从1 L LB培养基中持续分离出198±23 mg纯化的TcAlg1，即使在商业实践中，这也是重组蛋白生产的杰出产量。SDS - PAGE分析显示，表达蛋白的表观分子量约为80 kDa(不含SP)(图3)，经色氨酸指纹图谱证实，纯化的TcAlg1序列覆盖率为88%。![]()
图3. 重组纯化TcAlg1的SDS-PAGE分析。左道：蛋白标记；右道：通过His-tag亲和层析纯化TcAlg1。
pH和温度对TcAlg1酶活性的影响通过使用一系列pH为2.0-10.0的缓冲液和在20-70 °C的温度范围内培养反应混合物来评估。体外研究表明，在pH 7.0时，在20 mM磷酸钠缓冲液中酶活性最高(图4A)，而在pH 2.0时，80%的酶活性丧失。我们发现最适反应温度为40 °C，虽然在20-30 °C仍保留85 %以上的酶活。这表明，如果反应在大约20 °C的环境温度下进行，将不需要或低能量输入用于催化。温度高于40 °C会导致显著的活性损失(图4B )，这主要是因为肉眼可见的蛋白质聚集。热稳定性测试进一步证实了这一发现，在开始反应之前，在40°C以上孵育1小时，酶失去了60%以上的活性(图4C)。最后，我们发现使用无缓冲液(pH 7)与20 mM磷酸钠(pH 7)一样有效。为了以最小的能量输入获得最高的酶效率，我们选择了中性pH和30 °C的反应参数进行进一步的实验。![]()
图4. TcAlg1的表征：(A) pH对酶活性的影响，(B)不同温度下的相对酶活性，(C)热稳定性测试。误差条表示三个实验重复的标准差。
三种褐藻胶底物，聚甘露醛酸(poly M)，聚古洛糖醛酸(poly G)，和商业褐藻胶混合M/G块(poly M/G)，对TcAlg1进行了测试。催化后，将反应混合物涂在薄层色谱板上。DEH化合物由于极性相对较低，其RF值高于其他反应产物，在三种反应混合物中均检测到(图5A)。用MALDI-TOF质谱分析产物(图5B)。在所有样品中检测到一个m/z比为198的离子，对应于单体介导的DEH。这些实验结果与我们基于序列比对的预测具有良好的一致性，表明TcAlg1是一种外切褐藻胶裂解酶，能够从poly M、poly G和poly M/G形成单体糖酸。![]()
图5. (A)褐藻胶(通道1)、poly G(通道2)和poly M(通道3)作为底物的酶促反应产物的TLC分析和(B)单糖产物的MALDI-TOF MS分析。
通过构建不同底物浓度下反应的非线性回归图，确定了TcAlg1的动力学参数(Km、Vmax和kcat)。当poly M作为底物时，Km、Vmax和kcat的值分别为9.2 mM、20.9 U/mg和135.8 s-1。相反，当poly G为底物时，TcAlg1的Km、Vmax和kcat值分别为23.9 mM、3.8 U/mg和25 s-1。测试Poly M/G，计算Km、Vmax和kcat值分别为27.9 mM、6.4 U/mg和41.7 s-1。这些动力学参数完全在有限数量的其他外褐藻胶裂解酶的范围内，包括AlgL和Atu302530和OalC.31TcAlg1对poly M的kcat实际上高于OalC，这对poly M底物具有高度特异性我们的动力学研究表明，TcAlg1对poly M的Vmax和kcat远大于其他被测底物，这表明TcAlg1也是一种M型外切褐藻胶裂解酶。从海洋生物质中提取褐藻胶后，剩余的纤维素、层粘胶蛋白和甘露醇可用于食品、饲料、材料和能源生产。然后，通过优化加载协同的内型和外切褐藻胶裂解酶或酵母菌株在细胞表面膜上显示多个褐藻胶裂解酶，可以从褐藻胶中生产DEH，但是从低分子量的AOs混合物中分离DEH是具有挑战性的，而且通常是耗时的。因此，我们有动力优化仅使用TcAlg1和最少下游加工步骤的高纯度DEH的生产。确定TcAlg1的最佳上样量为0.78 mg/ml底物溶液(2% w/v褐藻胶)，反应时间调整为12 h，以减少AOs的产生。通过在线多角度激光散射(SEC-MALLS)排粒径色谱法分析TcAlg1处理前后褐藻胶的分子量(表1和图6)。TcAlg1处理后的褐藻胶的色谱从高Mw区向低Mw区转移，信号分裂为峰1和峰2两个峰。同时也形成了DEH单体对应的大峰(图6)。测得褐藻胶原料的数均分子量(Mn)为17.5 kDa，重量均分子量(Mw)为54.2 kDa。经TcAlg1处理后，修剪后的褐藻胶(峰1 + 2)Mn降低8.6 kDa, Mw降低26.3 kDa。与酶孵育后，峰1和2测得的多分散指数( Polydispersity index，PI )也显著下降，这表明原始褐藻胶样品( PI = 3.7)中的异质性群体转化为均一组分，峰1和2的PI值分别为2和1.1 (表1 )。综上所述，我们优化了一种定量制备高纯度DEH ( 28 %的总收率)的条件。此外，该过程允许保留残留的褐藻胶，可以通过简单的乙醇沉淀步骤轻松地从DEH中分离。表1. TcAlg1处理前后褐藻胶的分子量分布及计算的多分散性指数(PI)
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图6. 用TcAlg处理前(蓝线)和后(红线)对sigma的褐藻胶进行SEC-MALLS分析的复盖RI色谱图。
Poly M / G (购自Sigma-Aldrich公司的褐藻胶)包含四种可能的连接组合：M-M，M-G，G-M和G-G。1H NMR光谱通过分析TcAlg1处理后海藻酸盐结构的变化来确定TcAlg1的底物偏好性(图7 )。TcAlg1处理后，含有M-block和MG-block亚基的相对丰度降低，而G-block的相对丰度在TcAlg1处理后增加。核磁共振研究表明TcAlg1优先攻击M-block，M-1M峰强度的高度降低证实了这一点，尽管M-G和G-M结构也受到影响。这表明TcAlg1优先作用于M-block，靶向褐藻胶富含M-M的区域，而在富含G-G的区域表现出明显降低的活性。这与我们的动力学研究结果一致，表明poly M上的反应速率比poly G上的反应速率高，这可能解释了SEC-MALLS证据表明TcAlg1产生了两个离散的褐藻胶群体。较高的分子量群体可能包含在酶处理后残留的聚合物中发现的G-G富区。这种底物偏好可以通过我们在TcAlg1同源模型中观察到的与Alg17C中未发现的Arg残基相邻的活性位点来解释，我们认为这可能会阻碍古洛糖醛酸在+2亚位点的结合(图2E )。![]()
图7. 部分水解褐藻胶的羟基核磁共振分析。蓝色，褐藻胶底物;红色，乙醇在酶促反应后沉淀褐藻胶。AB-nC表示糖醛酸B中质子n与邻近糖醛酸A和C的共振。
总的来说，经过TcAlg1处理后，褐藻胶的M/G比从1.7降低到0.8，FGG和FGGG值增加了约2倍(表2)。从材料的角度来看，富含G-block的褐藻胶使凝胶坚固而脆，而M块含量的增加使凝胶更有弹性，并且增加古脲酸含量有几个可取的好处。包括通过Ca2+或其他二价阳离子的G-block交联增强褐藻胶的胶凝性能此外，poly-G凝胶可以进一步化学修饰成多用途聚醛醛酸酯(PAG)凝胶，它具有更大的机械刚度，因此在许多领域都有应用，包括药物包装和输送，以及组织工程目前poly G的成本为每克60美元，比褐藻胶贵500倍。我们提出的使用单一酶富集G-G-block的方法可以在大规模应用时降低这些成本。表2. TcAlg1处理前后褐藻胶序列参数
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综上所述，本文通过建模和动力学研究对一种新的褐藻胶裂解酶TcAlg1进行了表征。我们的研究丰富了表征外切型褐藻胶裂解酶的小谱系，与OalC(唯一表征的poly-M特异性裂解酶)相比，它的催化效率更高。从大肠杆菌表达宿主中纯化的TcAlg1蛋白的异常高产量为大规模利用该酶开辟了许多机会。该酶具有外切型褐藻胶裂解酶活性，在水中具有活性，可从poly-M/G、poly-M和poly-G褐藻胶中生成不饱和单体DEH。克数量的纯DEH可以作为化学合成的原料或作为生物乙醇生产生物的碳源。活性位点周围的结构特征表明，TcAlg1对褐藻胶分子中的多M单元表现出底物偏好，并且我们已经证明了富集古洛糖醛酸的褐藻胶组分的制备具有生物模态Mw分布。
原文：Preparation of 4‑Deoxy‑L-erythro-5-hexoseulose Uronic Acid (DEH) and Guluronic Acid Rich Alginate Using a Unique exo-Alginate Lyase from Thalassotalea crassostreae.DOI: 10.1021/acs.jafc.7b05751
