2024年4月，山东大学的Xiyue Zhang等人在Bioresource Technology上发表了一篇题为Low-cost and efficient strategy for brown algal hydrolysis: Combination of alginate lyase and cellulase的研究论文。

褐藻胶主要来源于褐藻细胞壁。褐藻胶是继纤维素之后全球第二丰富的多糖，是一种可持续的可再生资源。褐藻胶由两种构象异构体组成，α-L古罗糖醛酸（G）和β-D甘露糖醛酸（M）。G和M随机排列并通过1,4-糖苷键结合，产生三种类型的褐藻胶嵌段：polyG、polyM和杂聚合物polyMG。褐藻胶的解聚是通过褐藻胶裂解酶通过β-消除糖苷键实现的。褐藻胶裂解酶被广泛用于彻底分解褐藻并制备褐藻胶分解产物不饱和褐藻寡糖（AOS）。与传统的化学和物理方法相比，酶法具有明显的优势，如环境友好、高效、可定制特定的寡糖，这些优势已在多篇综述中得到很好的总结。此外，褐藻胶裂解酶产生的不饱和AOS比通过化学和物理方法获得的饱和AOS在生理上更有益。与使用单一酶相比，不同褐藻胶裂解酶的组合似乎对AOS制备更有效。例如，当褐藻胶裂解酶AlyPB1与低聚褐藻胶裂解酶AlyPB2（均来自海洋细菌发光杆菌FC615）结合时，由于强烈的协同作用，AOS的转化率显著提高。最好使用褐藻胶裂解酶和纤维素酶的混合物直接从褐藻中制备AOS。由于成本低廉，粗褐藻胶裂解酶与纤维素酶的组合被认为是生产海藻肥料的可行方法，产生的AOS不仅可以促进细菌代谢活动，还可以刺激植物的生长。此外，褐藻胶裂解酶还显示出在降解细菌生物膜以治疗囊性纤维化方面的潜在应用。

本研究分离出一株海洋细菌弧菌B1Z05，并发现其能够高效降解褐藻胶。基因组分析表明，B1Z05具有一条较长的褐藻胶分解途径。大部分参与褐藻胶代谢的基因均受褐藻胶调控，B1Z05无细胞上清液具有较高的褐藻胶消化活性和低成本的制备条件，为生产聚合度为2~6的褐藻寡糖提供了可行的途径。在此过程中，多种具有多个结构域的褐藻胶裂解酶发挥着重要作用，当胞外粗制褐藻胶裂解酶与纤维素酶协同作用时，不同种类褐藻的水解率明显高于商业褐藻胶裂解酶产品CE201，且海藻提取物中含有丰富的植物激素。这项工作提供了一种简单而有效的方法来可持续生产AOS和海藻肥料。

1.Vibrio sp.B1Z05菌株的生理特性

B1Z05菌株表现出很强的利用褐藻胶的能力，并消化了L.japonica，24小时内水解率约为33%（图1A）。系统发育分析表明，B1Z05菌株属于弧菌属（参见补充材料）。Vibrio sp.B1Z05菌株在1.5–2%(w/v)NaCl中表现出最佳生长，而在无NaCl的情况下几乎不生长（图1B）。在0.5%铵盐存在的情况下产量最高（图1C）。这可能是由于鲍鱼肠道和海洋中的贫营养环境造成的。与此一致，Vibrio sp.B1Z05在LB培养基中几乎不生长。因此，NH4Cl被用作最佳培养条件的唯一氮源。Vibrio sp.B1Z05细胞在0.5% polyG存在下表现出最高的生长产量，其次是葡萄糖和褐藻胶（图1D）。在存在0.5% polyM的情况下观察到有限的生长，这表明其褐藻胶裂解酶可能是polyG特异性酶。尽管B1Z05可以与几丁质寡糖和N乙酰葡萄糖胺一起生长，但在存在来自蟹壳的不溶性几丁质底物的情况下没有观察到生长。此外，当褐藻胶浓度大于0.5%时，弧菌B1Z05表现出最佳生长状态，据此选定添加0.5%褐藻胶的改良M9培养基用于弧菌B1Z05的进一步培养。

图 1. 弧菌B1Z05的生理特性。(A)不同分离细菌对海藻海带粉末的水解速率。(B)在不同NaCl浓度下生长。(C)在不同氮源下生长。(D)在不同碳源下生长。代表性实验的结果进行了三次测量，并且值以平均值±标准差的形式给出。

与大多数已报道的含有少于10种褐藻胶裂解酶的褐藻胶降解微生物相比，弧菌B1Z05含有更多的褐藻胶裂解酶成员（17种褐藻胶裂解酶）（参见补充材料）。此外，还鉴定了与褐藻胶利用相关的其他成分，包括外膜转运蛋白（KdgM1-4）、内膜转运蛋白（ToaA-C）、候选转录调节因子（AusR1和AusR2）、不饱和糖醛酸的下游氧化（KdgF）和Entner-Doudoroff(ED)通路成员（DehR、KdgK和KdgA）（图2A）。B1Z05中的17种褐藻胶裂解酶可分为四个PL家族（图2B）。这些生物信息学分析表明B1Z05包含完整且扩展的褐藻胶利用途径。

图 2. (A)弧菌B1Z05中负责褐藻胶解聚的基因的分子组织。(B)17种褐藻胶裂解酶的系统发育分析。不同的褐藻胶裂解酶家族以(A)中所示的相应颜色表示。(C)qRT-PCR分析在存在和不存在褐藻胶的情况下可能利用褐藻胶的基因。以葡萄糖作为唯一碳源生长的样品作为参考。基因按其功能聚类，包括细胞外消化（蓝色柱）、寡糖运输（粉色柱）、细胞质消化（黄色柱）和调节剂（绿色柱）。对两个独立样本的结果进行了三次检查，值以平均值±标准差表示。差异表达被认为在倍数变化超过5时具有显著性（以虚线表示）。星号表示统计学上显著差异（*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001）。(D)用0.5%褐藻胶培养24小时后，弧菌B1Z05的分泌组中褐藻胶裂解酶的相对表达水平。

4.B1Z05无细胞上清液对褐藻胶表现出高活性

B1Z05表现出较高的褐藻胶降解能力，24小时内可降解33%的海藻。常见褐藻物种中的总多糖浓度为干重的40%至70%，而藻酸盐可占到约40%。因此，我们推测B1Z05菌株可以完全降解海藻中的褐藻胶。此外，B1Z05可以在褐藻胶存在下在过滤海水中生长。综合起来，这些数据表明B1Z05无细胞上清液可能因其高褐藻胶降解活性和低成本而可用于制备AOS。为了评估无细胞上清液消化褐藻的能力，首先研究了对褐藻胶的最佳反应温度，并且上清液在30◦C时表现出最高的褐藻胶溶解活性（参见补充材料）。对褐藻胶的活性水平在12小时后达到稳定水平。细胞外还原糖的浓度在培养8-10小时后达到峰值，随后随着培养时间的延长而降低，表明细胞外产物已被细胞利用（图3A）。B1Z05无细胞上清液的褐藻胶产物为聚合度为2~6的海藻酸寡糖（图3B、3C）。综上所述，这些数据表明B1Z05无细胞上清液可以提供一种以低成本生产AOS的可行方法，从而用于海藻肥料的可持续生产。

图 3.(A)B1Z05无细胞上清液的褐藻胶降解活性（左纵轴）以及在NaCl和KCl培养基中生长过程中细胞外还原糖的分析（右纵轴）。通过FPLC(B)和ESI-MS(C)对无细胞上清液进行褐藻胶产物分析。(D)B1Z05菌株生长的最佳KCl浓度。

5.B1Z05无细胞上清液与纤维素酶的组合能够有效水解海藻

低成本弧菌B1Z05无细胞培养上清液在生产海藻肥料方面具有很大的潜力，但NaCl的存在容易导致土壤盐渍化。另外，KCl更适合用于制备海藻肥料，因为K+在植物的不同生理功能中起着关键作用。因此，在KCl存在下，弧菌B1Z05的生长得到优化，并且在2％KCl存在下细胞的生长产量最高（图3D）。其中，KCl培养基为含有2%KCl和0.5%褐藻胶的改良M9培养基（省略NaCl），NaCl培养基为含有2%NaCl和0.5%褐藻胶的改良M9培养基。在KCl培养基中，B1Z05菌株的生长速度和细胞产量与NaCl培养基相似。然而，KCl培养基中无细胞上清液的蛋白质含量远高于NaCl培养基（见补充材料）。与此一致的是，培养24小时后，KCl培养基中无细胞上清液的褐藻胶降解活性比NaCl培养基中高100%（图3A）。

除褐藻胶裂解酶外，还需要纤维素酶才能完全降解褐藻。然而，当使用纤维素作为唯一碳源时，弧菌B1Z05无法生长。因此，采用青岛蔚蓝生物集团的商业纤维素酶产品CelL-15水解海藻L.japonica，可消化约30%的干重。L.japonica的水解率表明，B1Z05无细胞上清液和CelL-15的混合物在40℃时表现出最大的活性（见补充材料）。水解率比商业产品CE201和CelL-15高出49％（表1）。值得注意的是，该混合物的水解率远低于报道的酶法方案（97％），这可能是由水解产物处理方法不同造成的。在报道的方法中，仅通过过滤从反应混合物中去除大于0.3毫米的大碎片，从而导致更高的水解速率。此外，还使用了另外三种褐藻物种S.phyllocystum、H.fusifarme和A.nodosum（在中国被广泛用作海藻肥料）来评估B1Z05无细胞上清液的降解能力。无细胞上清液和CelL-15的水解能力远远高于商业酶CE201和CelL-15（表1）。因此，这些数据表明，B1Z05无细胞上清液与纤维素酶一起具有很强的降解不同褐藻物种的能力，并且可以低成本用于海藻生物转化。

6.多域褐藻胶裂解酶是褐藻胶降解的主要参与者

为了探究高效分解B1Z05无细胞上清液的机制，获取了蛋白质表达谱，分析了褐藻胶裂解酶的组成。在无细胞上清液中观察到9种褐藻胶裂解酶（3种PL6和6种PL7裂解酶）（图2D）。最初假设上清液中存在的某些褐藻胶裂解酶可能对褐藻胶具有高活性，从而导致褐藻的有效降解。为了验证这一点，对无细胞上清液中观察到的蛋白质进行了异源表达和纯化（见补充材料）。与弧菌B1Z05细胞在使用polyG作为唯一碳源时表现出最大生长产量的观察结果一致，具有相对高褐藻胶分解活性的酶(VBAly6、VBAly7、VBAly8和VBAly12)对polyG表现出的活性高于对polyM的活性（参见补充材料）。然而，与商业PL7褐藻胶裂解酶产品CE201相比，B1Z05无细胞上清液中存在的所有褐藻胶裂解酶对海藻酸钠的活性均明显较低（图4A）。另一方面，在无细胞上清液中含量较高的褐藻胶裂解酶均为多结构域酶（图4B），除VBAly16仅含有一个碳水化合物结合模块（CBM）结构域和一个催化结构域外，其余5种高表达的藻酸褐藻胶裂解酶除催化结构域外还含有两个额外的结构域。其中，PL7褐藻胶裂解酶VBAly2和VBAly8具有相同的模块组成，B1Z05无细胞上清液中所有PL7褐藻胶裂解酶的催化结构域均形成β-果冻卷结构（图4C），这是PL7家族裂解酶中的常见折叠。值得注意的是，三种PL7裂解酶的不同结构域之间的连接子有所不同，这被认为在褐藻胶溶解活性中起着关键作用。PL6褐藻胶裂解酶VBAly1、VBAly5和VBAly17具有相似的模块组织，包含一个N端催化结构域和C端的两个未知结构域。除PL6催化结构域外，未鉴定出与这两个C末端结构域具有同源性的蛋白。这两个C末端结构域折叠成β-三明治结构，这是CBM结构域的经典结构。因此，它们被提议作为CBM用于底物结合，并分别记为CBM-like 1和CBM-like 2。CBM对多种含有CBM的褐藻胶裂解酶中的褐藻胶降解具有不同的影响，这表现为热稳定性、酶活性、不溶性底物结合和产物分布的差异。因此，来自弧菌B1Z05的CBM也可能对褐藻中存在的不溶性褐藻胶的有效降解产生积极影响。此外，虽然来自弧菌B1Z05的PL6成员具有很低的褐藻胶分解活性，这是已报道的PL6褐藻胶裂解酶的共同特点，但当存在褐藻胶时，无细胞上清液中会出现高含量的PL6褐藻胶裂解酶蛋白（图2D），这表明PL6可能是褐藻中不溶性褐藻胶快速降解的关键因素。

图 4. (A)在B1Z05无细胞上清液中观察到的褐藻胶裂解酶相对活性。商业褐藻胶裂解酶产品CE201对海藻酸钠的活性约为3,000U/mg，用作对照。(B)无细胞上清液中不同褐藻胶裂解酶的模块化组成。右侧显示了每种蛋白质的相对含量。在PL6褐藻胶裂解酶中，存在两种未识别的结构域，根据AlphaFold2预测的结构，它们可能发挥CBM的作用。因此，它们被命名为CBM-like 1和CBM-like 2。所有褐藻胶裂解酶都含有信号肽（灰色柱），用于细胞外定位。(C)无细胞上清液中褐藻胶裂解酶的推定结构。结构由AlphaFold2预测。

7.B1Z05无细胞上清液和纤维素酶产生的海藻提取物富含植物激素

海藻提取物是植物激素的来源，对整个土壤-植物系统具有显著的有益作用。因此，需要对海藻肥料中的激素种类和浓度进行分析，以全面评价海藻肥料的质量（表2）。用B1Z05无细胞上清液和纤维素酶消化后，L.japonica提取物含有最高浓度的吲哚乙酸(IAA)。对于油菜素内酯，四种海藻提取物中香豆素甾醇(TY)含量相似，但在L.japonica和H.fusifarme中均发现了最高浓度的Castasterone(CS)。除二氢玉米素(DHZ)外，其他细胞分裂素的浓度在不同海藻提取物中相似，范围为1.6ng/g至6.0ng/g。H.fusifarme提取物中氨基环丙烷羧酸（ACC）含量最高。不同海藻提取物中赤霉素7和茉莉酸的浓度相似。对于水杨酸，L.japonica和H.fusifarme提取物中的水杨酸浓度高于S.phyllocystum和A.nodosum。本研究还将大型藻类中报告的最高植物激素浓度与海藻提取物中的植物激素浓度进行了比较。L.japonica提取物中的IAA含量比其他已报道的大型藻类物种高出116%。L.japonica和H.fusifarme中的CS含量明显高于报道的最高含量。S.phyllocystum和H.fusifarme的顺式玉米素含量比Hypneaspicifera的含量高出100%以上。四种海藻提取物中的DHZ含量明显高于其他大型藻类的含量。目前尚未有关于大型藻类的TY、ACC、茉莉酸或水杨酸的定量信息报道。综合起来，这些数据表明B1Z05无细胞上清液和纤维素酶产生的海藻提取物富含植物激素，B1Z05无细胞上清液可用于高效生产海藻肥料。

03

结论

DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.130481