海藻是生产生物活性物质和优质土壤健康增强剂的有效天然资源。作为第三代原料，海藻被广泛认为比陆地生物质具有更多的好处，例如显著的能量产量、更低的碳中和排放、以及更高的可持续性潜力（表1）。考虑到海藻中含有大量碳水化合物、矿物质和维生素，利用海藻生产生物燃料、医药产品和肥料非常有吸引力。

褐藻具有非常异质且独特的碳水化合物组成。褐藻胶是最丰富的结构多糖，占总干重的40%，纤维素的比例为16.9%。AOS是由褐藻胶生成的海洋低聚糖，含有α-L-古洛糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）。

越来越多的研究表明，聚合度为2~10的AOS能加速微生物代谢，促进根系生长，提高植物的产量和品质。此外，AOS还具有提高植物抗病能力、诱导植物免疫力的作用，可以作为一种新型的植物生长调节剂，制成生物肥料。

然而，由于结构细胞壁多糖，褐藻胶不易降解。目前，AOS的生产和收获成本仍然过高，更不用说寡糖肥料了。获得AOS的最有效处理方法是化学预处理结合高温处理。但是，这种方法耗能大，而且不太环保。例如，虽然使用稀酸处理海藻的效率通常很高，但会产生大量固体残留物。这些废物可占所用海藻生物质总量的30%。此外，预处理后通常会用氢氧化钠或固体石灰中和底物以消除发酵抑制剂，而这些抑制剂具有毒性并且会影响海藻中的营养成分。

目前，微生物酶解作为一种生物处理方法，具有良好的前景和成本效益。褐藻胶裂解酶，又称为甘露糖醛酸裂解酶（EC4.2.2.3）或古洛糖醛酸裂解酶（EC4.2.2.11），可催化褐藻胶的水解，褐藻胶是α-L-古洛糖醛酸与其C5差向异构体β-D-甘露糖醛酸的复合共聚物。裂解酶已从多种生物中分离出来，包括藻类、海洋无脊椎动物和各种微生物。褐藻胶裂解酶已从弧菌、芽孢杆菌、火炬菌和假交替单胞菌中广泛分离出来。然而，目前该应用受到菌株特性和海藻利用率低的限制。一方面，从海藻中提取海藻酸盐的工序繁琐，不能直接利用微生物来水解海藻。其次，微生物菌株分泌的褐藻胶裂解酶活性通常较弱，无法破坏细胞结构壁，将褐藻胶转化为低分子量的寡糖。在工程微生物中重组表达褐藻胶裂解酶是解决这一问题的一个很好的方法，目前已在大肠杆菌系统和毕赤酵母系统中成功重组表达了一些褐藻胶裂解酶。

由于纤维素是海藻中主要的结构细胞壁多糖之一，因此提出了纤维素酶也可以水解海藻结构。因此，建立了一种高效、快速的微生物褐藻胶裂解酶和纤维素酶联合水解方法。褐藻胶裂解酶可以分解海藻中褐藻胶的结构，将其分解为寡糖，同时释放营养物质。纤维素酶可以增强海藻的水解，产生更多的生物活性物质。

本研究分离得到一株新菌株Pseudoalteromonas sp.Alg6B，该菌株可产生褐藻胶裂解酶，且无需预处理即可直接水解海藻。此外，Alg6B分泌的褐藻胶裂解酶是一种特殊的多糖裂解酶，推测Alg6B既能对褐藻胶进行内切作用，又能对褐藻胶进行外切作用。为了验证纤维素酶具有加速海藻水解能力的假设，将Alg6B接种到海藻液体培养基中，并用纤维素酶进行发酵。因此，酶联合水解对海藻生物转化的效果是良好的。可以推论，Alg6B为AOS的生产提供了可行性，而褐藻胶裂解酶和纤维素酶的协同作用可为海藻肥料的生产提供新的途径。

1.海藻水解细菌的分离

以褐藻胶为唯一碳源共分离得到5株菌株,其中Alg6B在发酵培养中分泌粗褐藻胶裂解酶活性最高,水解海藻能力最强。图1显示Alg6B的褐藻胶裂解酶活力为35.2 U/ml，海藻水解率为60.5%，显示Alg6B的性能明显优于其他4株菌株。并揭示了褐藻胶裂解酶活性与海藻水解能力之间的关系，褐藻胶裂解酶活性越高，水解能力越强。本研究发现褐藻胶裂解酶活性与海藻水解速率呈正相关，为分离产褐藻胶裂解酶细菌提供了一种新方法。

图 1. Alg6B酶活力及水解速率定量分析。

2.Alg6B的表征

Alg6B经过反复接种和一系列优化，酶活得到有效提高。Alg6B周围形成透明区，其直径比为3.7；发酵24 h后水解效果明显，块状海藻全部转化为颗粒状，水解率由60%提高到76%。褐藻胶裂解酶的最大酶活达到54.5 U/ml,比酶活为545 U/mg。Alg6B的水解速率在pH 6.5到pH 8.0之间保持稳定，这意味着Alg6B优选在中性pH值的培养基中生长。最佳培养条件为160 rpm/min，推测低转速会阻碍Alg6B的生长，而高转速由于溶氧浓度高会抑制其生长。Alg6B在分离过程中即使在60℃的温度下也能存活，但最适生长温度为30℃，仅需8小时便可达到指数生长阶段，说明Alg6B具有较高的活力。

与其他菌株相比，Alg6B的酶活力虽然并不突出，但比活力却处于平均水平以上，说明Alg6B的产酶能力较强。据报道，活性较低的碳水化合物活性酶由于其具有更好的底物亲和力和更快的反应速率，可以有效地水解底物。可以推测Alg6B可能具有相同的优良特性，但还需要进一步的实验来支持这一点。此外，在37℃条件下，将Alg6B与培养基孵育12h后，检测到褐藻胶裂解酶的最大活性，同时，Alg6B具有较强的耐热性，在60°C条件下仍能存活。由于Alg6B在细胞壁表面产生多糖和荚膜，因此推测荚膜可以保护Alg6B免受极端环境的影响。

在之前的研究中，Geobacillus thermodenitrificans OS27具有最强的水解能力，经过5天后可以将裙带菜完全水解成更小的颗粒。此外，Microbulbifer sp.6532A可以在2天内将大部分裙带菜叶状体碎片水解成碎片。本研究中假交替单胞菌Alg6B的水解率在24h内可达76%，可以直接水解海藻，且效果良好。

3.Alg6B序列分析

对Alg6B的16SrRNA基因进行克隆、测序，并提交至NCBI（登录号MN872509）进行鉴定，经BLAST比对结果显示，Alg6B与Pseudoalteromonas agarivorans、Pseudoalteromonas arctica、Pseudoalteromonas distincta等菌株亲缘关系较近。根据邻接系统发育树，该菌株被分配到假交替单胞菌属（99%）并被命名为Pseudoalteromonas sp.6B。序列比对表明Alg6B与其它已知假交替单胞菌序列同源性为58%，其中与假交替单胞菌（UniProtKB:F3BPM5）同源性最高，为86%（图2）。依据16S rDNA序列的种间截断值99%同一性，我们推断Alg6B是Pseudoalteromonas distincta的一个新菌株。但目前尚未见Pseudoalteromonas distincta能产生褐藻胶裂解酶的报道。

假交替单胞菌在自然界中广泛存在，在水产养殖和食品安全方面具有潜在的应用。一方面，假交替单胞菌能产生多种生物活性物质，如多糖和多种酶。另一方面，假交替单胞菌具有抑制某些细菌的能力，并通过减少防污来保护环境，这表明它适合应用于农业。此外，菌株Alg6B已保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉），保藏编号为CCTCC M2019947。

图2.Alg6B的序列分析。利用Clustal W对Alg6B的结构序列与相关蛋白质序列进行比对，包括Alg6B（本文分离）、F3BPM5（Pseudoalteromonas distincta ATCC 700518 C30）、A0A290RK31（Pseudoalteromonas agarivorans DSM 14585）、A0A379HDJ4（Pseudoalteromonas nigrifaciens alyA）、Q3ILH5（Pseudoalteromonas haloplanktis TAC 125）、Q15PP1（Pseudoalteromonas atlantica T6c）、B2LME8（Pseudoalteromonas sp. SM0524）。红色标记的部分表示同源性水平等于100%，蓝色框内的红色字符表示同源性水平在70%~100%之间。结构序列比对上方显示了swiss-model预测的二级结构。蓝线表示α螺旋，黑色箭头表示β折叠。

4.AOS的生产与分析

为探讨Alg6B的作用方式，对不同时间的褐藻胶水解产物进行薄层色谱分析，发现Alg6B能将褐藻胶水解为二糖和四糖，且产物以二糖为主，即褐藻胶通过内切方式在内部裂解为寡糖。在薄层色谱板上，可以明显看到，仅15分钟后就产生了少量寡糖，2小时后可以检测到二糖。有趣的是，只有二糖和四糖，没有检测到三糖，这与Pedsa0632对polyMG和poly-G褐藻胶的内切作用模式一致。此外，Mathieu进一步得出结论，一些特征性的多糖裂解酶家族（PL6）产生二糖和四糖作为最终产物。因此Alg6B也可能属于PL6，低分子量寡糖具有更好的生物活性已得到广泛认可，这表明Alg6B可能是一种潜在的制备低分子量寡糖的工具。

为了进一步确定寡糖的最终聚合度，对经过一周完全水解并纯化的最终产物进行液相色谱-电喷雾质谱(LC-MS)检测。测定了峰1、峰2、峰3、峰4中寡糖的分子量分别为175.03、351.06、703.15、1055.23。其中峰2确定为100%相对含量，即二糖含量最高，说明水解产物为单糖、二糖、四糖、己糖。

有趣的是，最终产物中含有单糖，这意味着二糖是Alg6B能够识别和裂解的最短底物，从而以外切的方式释放单糖。过去几年，人们深入研究发现PL6家族的褐藻胶裂解酶具有不同的催化机制。亚家族1的PL6褐藻胶裂解酶采取内切式作用模式或外切式作用模式，进一步推测Alg6B属于PL6。另外，由于水解时间不足、浓度低，单糖和己糖在薄层色谱板上无法检测出来。但Alg6B水解模式的机理探讨还有待进一步研究，粗酶中可能存在对褐藻胶具有非特异性水解能力的酶，也能产生AOS。为了更好地了解Alg6B的水解模式，将在毕赤酵母中进行异质表达以进一步研究。

5.利用褐藻胶裂解酶和纤维素酶的组合水解海藻

纤维素酶的最佳添加量为600 U/ml绿色木霉固体纤维素酶（图3）。值得注意的是，Alg6B与纤维素酶发酵12小时后，水解效果肉眼可见。24小时后，所有切碎的海藻都转化成碎片和溶液，表明发酵完成。将海藻水解液经60目筛过筛，得到粒径小于0.3mm的碎片，根据公式计算水解率。

未接种Alg6B的海藻液体培养基由于挡板锥形瓶的剪切力，发生轻微水解，水解率为11%±5%。Alg6B发酵水解率为76%±8%,表明Alg6B分泌的褐藻胶裂解酶可以有效水解海藻。此外，海藻与Alg6B和固体纤维素酶联合水解的效果更好。水解率高达97%±1%，1克干海藻最终还原为0.03±0.01克。

为了进一步研究水解海藻的结构，进行了扫描电子显微镜（SEM）。SEM分析展示了水解前和水解后的海藻表面图像。海藻的典型表面均匀、光滑，接种Alg6B发酵24 h后，水解海藻表面疏松、形成凹凸不平的组织。此外，海藻的孔隙率更大的内表面暴露出来，表明细胞壁结构被Alg6B显著水解。并且接种Alg6B与纤维素酶结合24 h的水解海藻的结构表面更加不平整，形成较大的凹陷，说明纤维素在破坏完整细胞壁，促进水解方面起到了非常重要的作用。此现象与水解速率的结果是一致的。

图3. 不同纤维素酶对海藻水解的影响及海藻水解效果图片。G：固体纤维素酶：绿色木霉（酶活力15,000 U/g）；H：液体纤维素酶：黑曲霉（酶活力10,000 U/ml）。

6.海藻水解液成分测定

由表2可知，接种Alg6B与未接种Alg6B的海藻液体培养基pH值有明显差异，由于Alg6B的发酵作用，海藻水解液呈稍强的碱性。而未经接种的水解液pH值稳定在6，这意味着海藻水解液可以用来给酸性土壤施肥。这些数据，包括还原糖、无机氮、总氮、总磷的测定，表明 Alg6B 可以有效水解海藻并释放出各种营养物质，这些营养物质是肥料的基本营养成分。而且接种Alg6B和纤维素酶的海藻液体培养基的这些数据比接种Alg6B的海藻液体培养基的数据高出一倍，这表明褐藻胶裂解酶和纤维素酶的组合可以更有效地水解海藻。但对照组有机碳含量较高，有机碳含量的降低可能是由于Alg6B发酵所致，Alg6B发酵得越好，残留的有机碳就越少。纤维素酶可以减少有机碳的消耗，以维持较高的养分含量。

我们关于纤维素酶的研究结果与其他研究一致，他们发现利用商业纤维素酶混合物可以从海藻中有效获取可发酵糖。同样，另一项研究发现，提取行业产生的海藻废物可以用商业纤维素酶水解。本研究分离得到一株高产褐藻胶裂解酶的假交替单胞菌，并建立了一种新颖的褐藻胶裂解酶产生菌的分离方法。此外，该研究的一大亮点是成功验证了褐藻胶裂解酶与纤维素酶的结合，解决了海藻渣问题，促进了海藻产业的发展。

这项研究进一步表明纤维素酶对于破坏海藻细胞壁和促进海藻水解具有重要意义。需要进行进一步研究来确认Alg6B的特性，例如安全性，以决定Alg6B是否可以应用于食品工业。此外，Alg6B水解方式的具体机制尚不明确，其分泌的褐藻胶裂解酶的结构与功能之间的关系有待进一步研究。

表2.海藻水解物中的营养成分。

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结论

DOI:https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.123548