《JAFC》来自文英庄藻 GH 16 βκ-卡拉胶酶底物识别和催化机理的结构研究
文摘
科学
2024-09-06 22:17
江苏
2024年8月，来自中国海洋大学的Fangyi Chen等人在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表了一篇题为Structural Insights into the Substrate Recognition and Catalytic Mechanism of a GH16 βκ-Carrageenase from Wenyingzhuangia fucanilytica的研究性文章。
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通讯单位：College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266404, P.R. ChinaAbstract
了解卡拉胶酶的底物特异性长期以来一直是生物技术应用领域关注的焦点。迄今为止，水解一种主要的混合卡拉胶红藻胶的βκ-卡拉胶酶的结构基础仍不清楚。本文确定了来自 GH16_13 的βκ-卡拉胶酶的代表 Cgbk16A_Wf 的晶体结构，首次阐明了该亚家族的结构特征。通过六糖结合复合物的结构分析和分子对接，阐明了底物结合模式。结合口袋涉及保守的催化基序和几个与底物识别相关的特定残基。通过定点诱变验证了残基 R88、E290 和 E184 的功能。将 βκ-卡拉胶酶与 κ-卡拉胶酶进行比较，我们认为它们不同的底物特异性部分是由于亚位点−1构象的不同所致，该研究对卡拉胶酶的识别机制有了更深入的认识，为酶的改造和卡拉胶寡糖的制备提供了有价值的理论支持。
海洋生态系统是一个巨大的、可再生的天然碳水化合物资源宝库。卡拉胶是一种从海洋红藻中提取的硫酸化多糖，用作食品添加剂。卡拉胶具有良好的凝胶形成性和生物相容性，使其在制药、生物材料、食品和化妆品行业得到广泛应用。(1−4)卡拉胶由重复的二糖单元组成，这些二糖单元形成交替的3-连接β- d-半乳吡喃糖(G单元)和 4-连接 α- d-半乳吡喃糖(D单元)或 4-连接 3,6-脱水-α-d-半乳吡喃糖(DA单元)的主链。根据硫酸盐取代的数量和位置，卡拉胶可分为四大类：λ-卡拉胶、ι-卡拉胶、κ-卡拉胶和红藻胶(图S1)。红藻胶是一种由 β- 和 κ- 卡拉胶基序混合而成的混合型卡拉胶，近年来受到越来越多的关注。理想的 κ-、ι- 或 λ- 卡拉胶是同质的，具有一种重复二糖单元(分别为 G4S-DA、G4S-DA2S 或 G2S-D2S,6S)，而红藻胶则表现出异质性，包含两种随机分布的重复单元(G4S-DA 和 G-DA)。
卡拉胶的物理和生化性质受其分子量的影响很大。较低分子量的卡拉胶寡糖具有更好的溶解性和稳定性，以及抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等多种生理活性。卡拉胶酶是一类降解卡拉胶的糖苷水解酶，可裂解卡拉胶中的β-糖苷键，生成新卡拉胶二糖系列产物，在寡糖制备及构效关系研究中具有重要作用。卡拉胶酶表现出相对严格的底物特异性，因为它们识别双半乳糖重复单元的不同硫酸化模式。实际上有四种类型的卡拉胶酶对应于四种主要类型的卡拉胶，λ-卡拉胶酶(糖苷水解酶 (GH) 家族 150)，ι-卡拉胶酶(GH82)，κ-卡拉胶酶(GH16_17)，和βκ-卡拉胶酶(GH16_13)。其中κ-卡拉胶酶是报道最多的，βκ-卡拉胶酶是最近才发现的，它们都属于GH16家族，这是一个具有进化多样性的大家族，但来自不同的亚家族。βκ-卡拉胶酶最初是在 2018 年发现针对红藻胶的酶活性时发现的，迄今为止，该亚家族中已有11种卡拉胶酶被鉴定(网址http://www.cazy.org/)，但尚未对其结构进行研究，GH16_13亚家族酶中底物识别的决定残基也尚未确定。
在前期研究中发现并鉴定了一种新的βκ-卡拉胶酶Cgbk16A_Wf，该酶来自海洋细菌Wenningzhuangia fucanilytica CZ1127。通过产物分析，我们认为Cgbk16A_Wf通过特异性地切割DA-Gβ1→4DA-G4S中的β-1,4键来降解红藻胶。这里，我们报告了 Cgbk16A_Wf 代表的 GH16_13 家族的第一个晶体结构。它显示了 B 族糖苷水解酶的一般 β-果冻卷折叠，并在底物结合亚位点具有特定的结构特征。通过对六糖产物的复合结构进行结构分析以及与四糖底物的分子对接，确定了底物结合模式。通过诱变研究验证了催化残基 E184 以及与底物识别相关的两个重要残基 R88 和 E290。与已知的 κ-卡拉胶酶结构进行结构比较表明，亚位点 −1 处的容纳口袋较小，无法承受半乳糖上的任何硫酸盐取代。这一发现揭示了底物特异性的结构基础，为酶工程提供了新的见解。
1.W. fucanilytica βκ-卡拉胶酶的整体结构以GH16_13为代表，βκ-卡拉胶酶Cgbk16A_Wf的三维晶体结构测定分辨率为1.52Å。它在正交晶系空间群P212121中结晶，并且在不对称单元中只有一个分子，氨基酸序列覆盖范围为Pro38至Asn318。数据收集和结构测定细节总结于表1中。Cgbk16A_Wf 的结构采用典型的 B 族 β-果冻卷折叠。它由两个反向平行弯曲的β片层形成的 β-夹层核心组成，分别由六条(β3、β4、β8、β13、β14、β16)和七条(β2、β7、β9、β10、β11、β12、β15)链组成，旁边有多个环和螺旋连接β链(图1)。弯曲β片层产生的深裂痕具有高度的序列保守性，被鉴定为催化通道。环和螺旋比β片层核心表现出更高的 B 因子，表明这些区域可能具有灵活性或动态性。由谷氨酸和天冬氨酸残基组成的催化三联体是GH16的一个明显结构特征，即β链上的EXDXE基序或β凸起上的EXDXXE。以Cgbk16A为代表的2GH16_13卡拉胶酶在催化通道中部的β10位上具有保守的EXDXXE催化基序（图1）。
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图 1. Cgbk16A_Wf 的整体结构。左侧的卡通图以彩虹渐变色显示，颜色从蓝色(N端)到红色(C端)。右侧的卡通图以青色显示β夹层核心。保守的催化残基以棍状显示。
使用 Dali 服务器在 Protein Data Bank 中搜索结构最接近的同源物。βκ-卡拉胶酶 Cgbk16A_Wf 的折叠与 GH16_14 中的 β-紫菜多糖酶 BpGH16C(PDB 编号：8EP4)的结构最相似，而不是与 κ-卡拉胶酶(PDB 编号：1DYP)的结构相似，均方根距离 (rmsd) 分别为 1.9 和 2.5 Å。这与它们在基于序列相似性建立的系统发育树上的位置一致，其中 GH16_13 和 GH16_14 占据最近的分支，表明它们具有较近的进化关系。然而，糖苷水解酶之间的进化关系密切并不一定意味着相似的底物特异性。具有各种底物特异性的酶可以来自共同的祖先，从底物相似性的角度看，βκ-卡拉胶酶和κ-卡拉胶酶可能拥有识别卡拉胶型半乳聚糖的共同的局部结构。Cgbk16A_Wf 对红藻胶表现出较高的催化活性和特异性。用 pHBAH 方法可以明显检测到野生型 Cgbk16A_Wf 催化的红藻胶水解反应。在 pH 6.0、40℃ 下测得的动力学参数Km、kcat和kcat/ Km分别为4.3 ± 0.3 μM、930.8 ± 28.8 s–1和 216.0 ± 9.4 μM–1 s–1。对琼脂糖、紫菜、κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和 λ-卡拉胶的催化活性可以忽略不计且无法检测到(图2A)。GH16糖苷水解酶采用双置换机制来断裂糖苷键，并且催化残基已被明确鉴定。在Cgbk16A_Wf 中，催化基序上的两个保守残基 E179和E184分别充当亲核试剂和一般酸/碱，而E184充当同位质子给体。E179和E184的侧链羟基均指向催化通道的中心，附近有数个水分子，它们之间的距离为5.5Å(图S4)，这个距离有利于糖苷水解酶在催化过程中进行质子转移。E184突变为丙氨酸导致活性丧失(图2 B)，证明了其在催化中的重要作用。![]()
图 2. Cgbk16A_Wf 的催化活性和特异性。(A)Cgbk16A_Wf 对不同底物的催化活性。(B)点突变对与底物结合和催化相关的关键残基的功能影响。野生型 Cgbk16A_Wf 的催化活性标准化为 100%。
通过浸泡获得了Cgbk16A_Wf与红藻糖六糖的复合物结构，在电子密度图中可以清晰地看到六糖的结构。然而，我们只捕获到了与负亚位点区域结合的产物状态(图3A)，这可能表明负亚位点对底物的亲和力强于正亚位点。通过叠加结构，我们观察到Cgbk16A_Wf的整体构象在与寡糖结合前后并没有发生明显的变化。仅在结合裂缝附近的残基的少数侧链表现出轻微的旋转运动(图3A)。这表明该酶不依赖灵活的构象变化来调节糖的结合。进一步分析了酶-产物界面，发现相互作用主要发生在亚位点−1至−2，外部半乳糖单元几乎不参与结合(图3 B)。底物的硫酸基团似乎不参与负亚位点区域的相互作用。![]()
图 3. Cgbk16A_Wf 与寡糖产物(DA-G4S-DA-G4S-DA-G)复合物的结构。(A)apo-Cgbk16A_Wf(灰色)与其与红藻糖六糖(青色)复合物的叠加。(B)酶与六糖产物之间的详细相互作用。相关残基显示为棒状。水分子显示为粉色球体。
糖苷酶的底物识别主要发生在其活性位点的−2至+2亚位区域。为了更深入地了解Cgbk16A_Wf底物识别和催化的分子机制，我们还将红藻糖四糖底物(DA-G)(DA-G4S)模型对接至结合位点(图4A)结合自由能最低的模型中，−1和−2位糖苷与晶体复合物中糖苷重合较好，表明对接结果可靠。E184羟基氧原子与β-1,4糖苷键氧原子的距离为3.2 Å，为发生催化反应的合理结合距离。极性相互作用主要集中在−1和+1亚位，疏水相互作用从−2亚位延伸至+2亚位(图4 B和图4C)Cgbk16A_Wf 中的E290和R88是两个可能参与底物结合的关键残基。E290通过其羟基与-1位点的G单元形成氢键，R88通过极性相互作用与-2和+1位点的DA单元发生相互作用。定点诱变实验表明，R88A突变导致催化活性急剧下降，残留效率约为野生型的15%，而E290G突变几乎消除了催化能力(图2B)。此外，催化三联体E179、D181和E184均参与与-1位点的G单元的极性相互作用。![]()
图 4. Cgbk16A_Wf 的底物结合模型。(A)通过红藻糖四糖 (DA-G-DA-G4S) 的分子对接揭示的活性位点中的底物结合模式。Cgbk16A_Wf 以表面形式显示，并根据静电势从蓝色 (+) 到红色 (-) 进行着色。四糖底物表示为黄色棒，六糖产物 (DA-G4S-DA-G4S-DA-G) 表示为洋红色棒。(B)以大比例显示活性位点的详细极性相互作用。与底物结合相关的残基以青色棒突出显示。(C)活性位点的疏水相互作用。
催化位点周围有许多疏水残基，即 W171、W206、W286、W294、F85、F292、F214和I204，与底物的糖苷链产生疏水和碳−π相互作用(图4 C)，其中除I204和F214外，大多数都是芳香族氨基酸，在 CAZy 数据库中 GH16_13 亚家族的 100个成员中是保守的。催化裂隙附近的芳香族残基通常对活性位点糖苷键的正确结合很重要。先前对 B 族纤维素酶的研究表明，芳香环在链糖通过结合裂缝的运输过程中发挥着作用。考虑到这些色氨酸和苯丙氨酸残基在催化通道中高度保守且普遍存在，它们对于底物结合和滑动可能至关重要。3.βκ-卡拉胶酶与κ-卡拉胶酶的比较表明-1亚位的结构构象决定底物特异性βκ-卡拉胶酶和 κ-卡拉胶酶是两种属于 GH16 家族的卡拉胶酶。κ-卡拉胶酶负责降解 κ-卡拉胶，而βκ-卡拉胶酶Cgbk16A_Wf只能催化红藻胶的水解，对κ-卡拉胶无催化活性(图2A)。为了解底物识别特异性，我们将Cgbk16A_Wf与已知的来自P. carrageenovora的κ-卡拉胶酶(CgkA_Pc)的结构进行了比较。虽然Cgbk16A_Wf与CgkA_Pc的氨基酸序列相似性(24%同一性，37%)较低，但整体结构相似(图5A和图5B)。Cgbk16A_Wf和CgkA_Pc的β-果冻卷核心重合性较好，而连接β-链的接头区域则存在明显差异。根据前人研究，这些位于催化口袋两侧的 β 链延伸被描述为“手指”。Cgbk16A_Wf 中不存在手指 F3，Cgbk16A_Wf 的手指 F6(P293 至 K299)比 CgkA_Pc(A261 至 P273)的手指 F6 短，防止其缠绕在催化裂隙周围。因此，Cgbk16A_Wf 具有更“开放”的通道形活性位点，而 CgkA_Pc 具有隧道形活性位点(图 5C)。这些不同的拓扑结构可能导致底物链方向和结合亲和力的差异。![]()
图 5. βκ-卡拉胶酶和 κ-卡拉胶酶的结构比较。(A)Cgbk16A_Wf 和 CgkA_Pc 催化模块的序列比对。二级结构元素标记在序列上方，F1–F6“手指”用方框标出。催化基序用下划线标出。突变位点用蓝色星号标记。(B)比对后从相同角度比较青色的 Cgbk16A_Wf 与黄色的 CgkA_Pc(PDB 代码：1DYP)。“手指”用灰色或橙色突出显示，并标记为 F1–F6。(C)Cgbk16A_Wf(青色)和 CgkA_Pc(黄色)的表面表示。活性位点用红色箭头标记。
亚位点的特征在酶的特定底物识别中起着至关重要的作用。κ-卡拉胶和红藻胶的基本组成不同，红藻胶中除了DA-G4S单元外还混杂有DA-G单元，这对应着-1亚位对不同底物的识别。Cgbk16A_Wf的-1亚位口袋主要由极性残基E290、R88、D288和疏水残基F85、W171、F292组成，CgkA_Pc中对应的残基分别为G258、G65、S256、Y64、W144、R260(图6A和图6B)可以看出，由于残基E290的侧链产生的空间限制，只有没有硫酸酯取代基的G单元才能进入Cgbk16A_Wf的亚位点-1口袋。而且，谷氨酸是一种带负电荷的氨基酸，它排斥带相同电荷的硫酸盐，导致G4S单元被排斥。CgkA_Pc中相应的残基是甘氨酸，它没有侧链，是电中性的，从而提供了足够大的口袋来容纳G4S单元。此外，CgkA_Pc中靠近极性硫酸盐的残基R260被Cgbk16A_Wf中的F292取代，形成相对疏水的环境。βκ-卡拉胶酶Cgbk16A_Wf结合口袋中涉及的残基在GH16_13亚家族中高度保守(图6C)，而κ-卡拉胶酶CgkA_Pc的两个关键对应残基G258和R260在其亚家族(GH16_17)中也保守，这可能是两个亚家族之间的共同区别。我们试图改造Cgbk16A_Wf的亚位点−1口袋，使其类似于CgkA_Pc，但是，即便酶浓度增加十倍，Cgbk16A_Wf的E290G/R88G/F292H/D288S也能四倍地水解κ-卡拉胶，这表明除了亚位点−1的构象外，可能还有其他因素决定了βκ-卡拉胶酶和κ-卡拉胶酶之间不同的底物识别特异性。![]()
图 6. Cgbk16A_Wf 和 CgkA_Pc 的亚位点 −1。(A)Cgbk16A_Wf 和 CgkA_Pc 的亚位点 −1 的表面表示(PDB 代码：5OCQ)。G 或 G4S 单元以洋红色显示。上方显示了 Cgbk16A_Wf 和 CgkA_Pc 的底物特异性的示意图。(B)Cgbk16A_Wf 的亚位点 −1 残基的叠加(青色)和 CgkA_Pc 的亚位点 −1 残基的叠加(黄色)。(C)亚家族中亚位点 −1 关键残基的保守性。
综上所述，本研究报道了GH16_13亚家族的第一个晶体结构。βκ-卡拉胶酶Cgbk16A_Wf采用典型的β-果冻卷折叠，保守的E179为亲核残基，E184为酸/碱催化剂。Cgbk16A_Wf主要通过氢键和疏水相互作用与其底物结合。R88和E290是参与底物结合的两个重要残基。将βκ-卡拉胶酶与κ-卡拉胶酶进行比较可以发现-1亚位的结构特征对于确定它们的底物特异性至关重要，但可能不是唯一的决定因素。由于保守的酸性谷氨酸残基(E290)产生的空间限制，βκ-卡拉胶酶Cgbk16A_Wf只能识别-1亚位没有硫酸酯取代基的半乳糖吡喃糖。而κ-卡拉胶酶的相应位置被一个小的甘氨酸(CgkA_Pc 中的 G258)取代，从而形成一个更大的−1位口袋，可容纳 G4S。这可能是区分这两个亚家族的统一特征。具有明确结构背景的GH16_13 βκ-卡拉胶酶可能是一种有前途的寡糖制备酶工具，也是酶工程的候选者。
原文：Structural Insights into the Substrate Recognition and Catalytic Mechanism of a GH16 βκ-Carrageenase from Wenyingzhuangia fucanilyticaDOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c05531
