基于对海洋粘细菌E. salina SWB005的基因组分析，鉴定出一种具有保守GH13结构域的推测的麦芽寡糖形成淀粉酶(命名为AmyEs)(GenBank：WP_106391772.1)。预测的淀粉酶含有708个氨基酸残基，N末端有一个信号肽(16个氨基酸残基)。AmyEs与其他已报道的α-淀粉酶的序列同一性较低，进化关系较远，例如来自Geobacillus sp.(4E2O，31.35％同一性)、Anoxybacillus sp.(5A2A，27.45％同一性)和Geobacillus sp.(1QHO，28.76％同一性)的酶。根据 Interpro 数据库的定义，AmyEs 的氨基酸序列具有 GH13 α-淀粉酶的一般结构特征，包含E组结构域(IPR014756)、GH13 催化结构域(IPR006047)和 C 端 β-折叠结构域(IPR013780)。序列分析表明，AmyEs 包含保守的催化三联体 Asp402-Glu434-Asp508、7 个 CSR 和一对保守的色氨酸残基，这些残基属于 GH13_a1、a2、a3、a4 和 xy 亚家族(图 S1)
GH13 家族是淀粉酶的主要来源，从 CAZy 数据库中已鉴定出超过 15 万个成员GH13 家族被分为 46 个亚家族进一步分析了AmyEs与46个不同GH13亚家族的306个代表成员的进化关系(图1)。AmyEs 在整个家族 GH13 进化树中形成一个独立的簇，这可能建立一个新的 GH13 亚家族，因为它们与 46 亚家族一起独立聚类。AmyEs 的同源蛋白被注释为预测的淀粉酶，未经功能表征，所有来源细菌均被鉴定为海洋粘细菌。系统发育分析表明 AmyEs 与亚家族 GH13_3、4、26 和 33 的成员不同(图 S2)。从分类学的角度来看，包含 AmyEs 及其同源蛋白的新组是令人感兴趣的，因为到目前为止，海洋粘细菌 α-淀粉酶仅位于这个独立的簇中。因此，可以合理地预期来自海洋粘细菌的 AmyEs 和同源蛋白将定义一个具有潜在催化特异性的新型 GH13 亚家族。
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图 1 . α-淀粉酶家族 GH13 代表的进化树。该树说明了 AmyE 与来自 GH13 的 46 个不同亚家族的 306 个成员的相关性。GH13 亚家族通过不同的颜色相互区分。蛋白质来源的标签通过 NCBI 登录号显示。使用 MEGA11 程序将该树计算为最大似然树。该树由 iTOL 程序显示。
带有C端His 6标签的重组AmyE在P. pastoris GS115 中异源表达，并通过 Ni-NTA 亲和层析柱纯化。从SDS-PAGE分析中观察到单一条带，与计算的分子量 75.7 kDa一致，表明纯度高。使用可溶性淀粉作为底物进一步研究了 AmyE 的生化特性。AmyEs 的最适温度为60℃。在40℃下孵育100分钟后，AmyEs 仍保留其原始活性的 90% 以上，而在高于50℃ 的温度下，酶活性急剧下降。AmyEs 在 pH 6.0 PBS 缓冲液中表现出最高活性，在 pH 6.0–9.0 范围内保留其活性的 70% 以上。在不同缓冲液中孵育 12 小时后，AmyEs 在 pH 6.0–10.0 范围内保留了 70% 的初始活性，表明其具有高 pH 耐受性。研究了金属离子对AmyEs活性的影响。AmyEs的水解活性受到大多数添加金属离子的显著影响。据报道，许多重金属离子会强烈抑制α-淀粉酶的活性，例如Cu2+、Hg2+、Fe3+和Zn2+。Mg2+和Fe2+略微提高了AmyEs的酶活性，而Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Co2+和Cr3+对AmyEs的活性有不同程度的抑制作用。这些结果表明AmyEs是一种不依赖金属离子的淀粉酶，其活性受到大多数重金属离子的强烈抑制，可能是由于活性位点被占据所致。Ca2+通常是大多数α-淀粉酶维持稳定性和高效水解的重要金属离子。两个保守的Ca2+结合残基N322和D371。
在AmyE中发现了10%的AmyE活性被1和5mMCa2+抑制。然而，在2mMCa2+存在下，AmyE在60℃下孵育12小时后仍保持90%的活性。当孵育时间延长至4天时，添加2mMCaCl2可使AmyE在50℃和55℃下保留73%和59%的活性。这些结果表明AmyE的水解活性与Ca2+无关，而添加Ca2+可显著增强AmyE的热稳定性，类似于α-淀粉酶GTA。就化学试剂对 AmyEs 活性的影响而言，大多数有机溶剂和洗涤剂对 AmyEs 活性有显著的负面影响，例如异丙醇、乙腈、Triton X-100、Tween 80、SDS 和尿素。在 5 mM DTT 存在下，AmyEs 活性显著活化 21.5 %，但在10 mM DTT 浓度下活性丧失 33.5 %，表明 -SH 基团在 AmyEs 催化活性中起一定作用。AmyEs对金属螯合剂的存在很敏感，在1 mM和10 mM浓度的EDTA下，AmyEs的活性分别降低了53.2%和完全活性。
3.AmyEs 是一种高效的麦芽六糖形成 α-淀粉酶，可选择性裂解高支链淀粉
底物光谱分析表明，AmyEs对糊化可溶性淀粉的活性最高，其次是豌豆淀粉、马铃薯淀粉、马铃薯直链淀粉、小麦淀粉和玉米淀粉(图 2a )。AmyEs 对玉米支链淀粉和糖原的活性有限，分别为 65.3 U/mg 和 25.4 U/mg，使用普鲁兰多糖和葡聚糖作为底物时未检测到活性。AmyEs 对可溶性淀粉的比活性测定为 146.3 U/mg，高于Aerobacter aerogenes(0.41 U/mg) 和Bacillus circulansF-2 (54.8 U/mg) 的 G6-淀粉酶Bacillus stearothermophilus的G6-淀粉酶AmyMH表现出最高的活性(58,000U/mg)，但其活性是以Ca 2+非依赖的方式进行的。![]()
图2. AmyEs的底物特异性。(a) AmyEs对各种底物的比活性。不同字母表示处理间有显著差异( p <0.05)。(b) AmyEs水解各种底物的水解产物的薄层色谱分析。(c) AmyEs水解后的麦芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)和麦芽七糖(G7)产物的薄层色谱分析。(d) AmyEs水解的玉米淀粉、CS4(通过AqGBE处理制备的高支链玉米淀粉)和糖原的水解产物的HPLC分析。
为了进一步确定AmyEs的产物分布和水解特性，用薄层色谱分析了AmyEs对不同淀粉样品和MOS(G5-G7)的水解产物(图2b)。在可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉和豌豆淀粉的水解中观察到了相同的产物形成。在水解产物中，麦芽六糖(G6)是主要产物，同时还产生了少量的麦芽寡糖，例如G3-G5和G7-G8。在从土壤粘细菌中鉴定出的G6-淀粉酶AmyM中也观察到了类似的结果。然而，仅检测到由 AmyEs 水解糖原而产生的麦芽六糖 (G6)。此外，AmyEs 对 G5 和 G6 没有活性，但对 G7 有轻微反应 (图 2c)，表明AmyEs仅作用于DP>6的寡糖。糖原是一种高度支化的葡萄糖聚合物，包含线性 α-1,4 糖苷键和 α-1,6 连接分支。我们推断淀粉的支化程度决定了 AmyE 的产生。为了验证我们的假设，通过葡聚糖分支酶 AqGBE 制备了链长分布发生变化的改性玉米淀粉 CS4, CS4 DP 6–12 的比例增加，分子量分布稳定。正如预期的那样，AmyEs 将 CS4 水解成纯度高、副产物较少的 G6 (图 2d).这些结果表明来自海洋粘细菌的AmyEs是一种新型的G6-淀粉酶，优先将支链淀粉水解成G6，并选择性裂解高支链淀粉。使用可溶性淀粉、玉米支链淀粉、马铃薯直链淀粉、牛肝糖原、牡蛎糖原和高支链玉米淀粉 CS4 作为底物测量了 AmyEs 的动力学参数。如表 S2 所示， AmyEs 对可溶性淀粉、玉米支链淀粉、马铃薯直链淀粉、牛肝糖原和牡蛎糖原的V max值分别确定为 273.0、211.6、227.9、57.9 和 30.4 μmol/mg/min。使用 CS4 作为底物，AmyEs 的最高V max值确定为 396.9 μmol/mg/min，由此观察到与可溶性淀粉 (353.9 s -1 ) 相比具有最高k cat值 (514.4 s -1 ) 的高效底物转化。此外，通过 Lineweaver-Burk 图测定的 AmyEs 水解可溶性淀粉的K m 值为 8.7 mg/mL，而AmyEs 水解 CS4 和玉米支链淀粉的K m 值分别增加到 17.8 mg/mL 和 24.3 mg/mL。这些结果表明 AmyEs 对具有特定侧链长度的分支淀粉具有有效的底物转化，这取决于其底物选择性，而不是底物亲和性。考虑到淀粉水解形成G6的能力，AmyEs的底物消化能力通过测量DH值来确定。如图3所示，1% 玉米淀粉经 AmyEs 水解后，DE 值为 28%(图 3a). 淀粉酶的活性抑制一般出现在底物和产物过量的情况下，且DE值总是随着底物浓度的升高而降低，如土壤粘细菌AC19产生的淀粉酶AmyAc.而不同浓度的玉米淀粉经AmyEs水解后最终DE值相近，且水解速率降低，水解平衡时间延长，表明海洋粘细菌AmyEs具有潜在的底物和产物耐受性。AmyEs水解CS4、牛肝糖原和牡蛎糖原的最终DE值分别比玉米淀粉低22.4%、23.6%和10.3%(图3bd). 底物的性质，如底物分子的结构、底物的大小以及底物链中存在的键的类型可能决定 AmyEs 的水解效率。![]()
图3 . AmyEs对不同底物的水解曲线。(a) AmyEs对不同浓度玉米淀粉的水解曲线。(b) AmyEs对1％CS4的水解曲线。淀粉水解反应体系含0.2U/mL酶剂量，在50℃下用2mM CaCl 2进行。(c) AmyEs对牛肝糖原的水解曲线。(d) AmyEs对牡蛎糖原的水解曲线。糖原水解反应体系含1％糖原和1.5U/mL酶剂量，在50℃下用2mM CaCl 2进行。
为了确定 AmyEs 对淀粉的作用方式，分析了不同反应时间的水解产物。如图 S5a 所示，在早期时间点产生具有高 DP 的寡糖，随后积累 G6-G8，最终产物由高水平的 G6 和微量的 G2-G5 组成。在大多数 G6 淀粉酶中，当反应时间延长时，主要产物 G6 可以水解成 G2 和 G4，这需要仔细控制酶水解条件以实现高产量 G6然而，随着反应时间的延长，AmyEs 中 G6 的产量并没有下降。在AmyEs处理的玉米淀粉的碘结合光谱中，随着反应时间的延长，吸收峰明显减小并左移(图S5b)，表明玉米淀粉中的α-1,4-糖苷键被AmyEs水解，并且支链淀粉的比例增加。这些结果表明AmyEs对普通淀粉底物的作用方式为内溶性。为了进一步确定侧链分布对 AmyEs 产物形成的影响，对分支淀粉 CS4 和糖原的水解进行了时间过程分析。AmyEs 将分支淀粉 CS4 水解为初始水解产物中 DP 较低的多糖，并观察到主要产物 G6 的快速积累(图 S6a)，表明 AmyEs 的内溶作用在 GS4 水解过程中受到限制，导致从内源性到外源性的更快转变。牛肝糖原和牡蛎糖原的水解导致 G6 的积累，牛肝糖原水解观察到少量 G7(图 S6b)，但牡蛎糖原没有(图 S6c)。糖原具有高度分支的结构，外部较短。因此我们推测，α-1,6-糖苷键密度高、外链较短的淀粉底物决定了G6-淀粉酶AmyEs的底物选择性，迫使AmyEs主要通过外切方式水解底物。为了评估玉米淀粉在不同时间段的水解情况，采用HPSEC-MALLS-RI测定了改性淀粉的分子尺寸分布(图4a )。由于AmyEs水解，在初始阶段观察到双峰分布。随着反应时间的延长，原始大分子的分解和大糊精分子的进一步水解，导致峰1的比例减少和洗脱时间延长(18分钟)，这归因于分子量(M w)从1.08×10 6 Da降低到1.09×10 4 Da(表S3)。与此同时，峰2(20分钟)的比例迅速增加，峰2的洗脱曲线略微向较低M w区域 移动。![]()
图4.AmyEs水解不同底物的分子尺寸表征。(a)1％玉米淀粉经AmyEs水解不同时间的产物的精细分子尺寸分布。(b、c、d)1％CS4、牡蛎糖原和牛肝糖原经AmyEs水解的最终产物的精细分子尺寸分布。
还评估了 CS4、牛肝糖原和牡蛎糖原最终水解产物的分子大小分布变化。与玉米淀粉相比，观察到了相似的分子量分布(图 4)。AmyEs 处理导致所有测试底物的峰 1 的 PDI 降低，表明高分子量组分从非均相聚合物系统转变为更均相的系统。然而，CS4、牛肝糖原和牡蛎糖原的最终水解产物峰 1 的M w分别为2.21×10 4 Da、7.93×104 Da、5.36×10 5 Da，与玉米淀粉相比， M w 较高。牛肝和牡蛎糖原的 M w分别降低了 1.2 倍和 1.1 倍，M wCS4 的分子量降低了 2.2 倍，与玉米淀粉相比，AmyEs 水解引起的分子量变化较小。由于支链键的阻塞，大分子限量糊精总是在淀粉酶水解支链多糖时残留。这些结果表明AmyEs水解可以产生寡糖和葡聚糖，并且葡聚糖的Mw可能由支链密度决定，从而影响底物的转化率。为了进一步研究AmyEs对玉米淀粉的水解过程，利用HPAEC对不同处理方法制备的改性淀粉产物的结构进行了表征。结果如图5所示,一个结果表明，在水解后期，DP > 7 的寡糖比例明显降低，导致 DP < 7 的寡糖链比例升高(70.1 %)，与薄层色谱结果一致(图 S5a)。随着水解程度的加深，G2-G5 和 G6 的比例分别升高至 29.9 % 和40.2 %(表 S4)，而 G8 和 G9 的比例则从 4 小时的 23.5 % 降低到 48 小时的 4.4 %。由于 AmyEs 对 G7 的水解效率低，G7 的比例维持在 19 % 左右，后期仅略有下降。此外，随着反应时间的延长，DP > 9 的寡糖比例先呈降低后上升的趋势，推测这些积累的聚合度较高的寡糖中含有 α-1、6 个连接的支链可抵抗 AmyE 的进一步水解。![]()
图5.AmyEs水解淀粉产物的寡糖组成分析和链长分布。(a)1％玉米淀粉经AmyEs水解不同时间的产物的寡糖组成分析。(b、c、d)1％玉米淀粉、CS4和牡蛎糖原经AmyEs水解的最终产物的链长分布。
为了进一步确定玉米淀粉、CS4、牛肝糖原和牡蛎糖原经 AmyEs 处理后残留支链淀粉的精细结构，分析了脱支处理后最终水解产物的链长分布。与对照相比，AmyEs 处理显著改变了链长分布，在测试底物中通常表现出从长链(DP > 10)向短链(DP < 10)的较大转变(图 5)如所列表 1，与 CS4(分别为 33.4%、4.4% 和 0.3%)和牡蛎糖原(分别为 37.7%、9.6% 和 2.6%)相比，DP 为 13–24(52.4%)、DP 为 25–36(12.9%)和 DP > 36(6.7%)的单元链在玉米淀粉中更加丰富。在经 AmyEs 处理的玉米淀粉中，DP ≤ 10 的链的比例从 14.7% 显著增加到 81.2%，同时长链大量水解。DP ≤ 10 的积累归因于长链的消化，从而导致 MOS 的产生和具有 α-1,6-键的短链的增加。然而，AmyEs 处理的 CS4 和牡蛎糖原中 DP ≤ 10 的链比例分别显示出较低的增量，分别为 49.5 % 和 23.4 %。CS4 和牡蛎糖原中较高的 α-1,6 键合比应该具有较高的耐水解性内链含量，尤其是对MFAses的影响，因此调控侧链的形成、减少内链的非特异性水解有利于提高AmyEs的产物特异性，而这可以通过适当的分支酶预处理来实现。表1.AmyEs水解产物的支链长度分布。
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AmyEs对高分支底物主要表现出外切活性的水解特性启发我们构建异步转化策略，通过分支酶改造提高AmyEs的MOS转化效率。采用HPLC定量分析了AmyEs催化水解产物寡糖(G1-G8)的组成和转化率。如图6所示图,玉米淀粉和AmyEs催化的CS4水解产物具有相似的转化率(超过70％)，但寡糖比例不同。与玉米淀粉相比，CS4水解产物中G6的产量增加了9.5％，而G1-G5和G7的产量分别降低了5.4％和1.7％。相反，在牛肝糖原(50.6％; G1-G7)和牡蛎糖原(22.5％; G2，G3，G6和G7)中观察到较低的寡糖转化率和不同的产物特征，但G6的比例分别显著增加至71.1％和82.1％。通过 AmyEs 水解玉米淀粉、CS4、牛肝糖原和牡蛎糖原，G6 的产量分别为 0.40、0.45、0.36 和 0.18 mg G6/mg 底物。
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图6.不同底物与AmyEs孵育所得水解终产物分布及寡糖转化率。将市售底物玉米淀粉、牛肝糖原、牡蛎糖原用AmyEs处理；通过AqGBE改性制备高支链CS4，再用AmyEs水解。不同麦芽寡糖产物比例代表麦芽寡糖与G1至G8总质量的质量比。寡糖转化率(★)代表G1至G8总质量与底物原始质量的比值。G6转化率(○)代表G6质量与底物原始质量的比值。每个值代表三次独立测量的平均值。转化率或G6比例用不同字母表示的平均值表示差异显著(p < 0.05)。
在我们之前的研究中，AqGBE 被鉴定为一种有效的 1,4-α-葡聚糖分支酶,通过侧链修饰，AqGBE处理增加了CS4中α-1,6连接支链的比例，导致其向短链(DP 6–12)和长链(DP 25–36)方向大幅转变(图5).改性玉米淀粉CS4具有更多的非还原端，分子量更低，有利于促进AmyEs的外切淀粉分解活性(图 4和5)通过比较AmyEs对CS4和玉米淀粉的水解，发现以CS4为底物时，AmyEs具有较低的底物亲和力和较高的周转率，表明AmyEs可能对高支链淀粉具有底物选择性。通过分析CS4和糖原的产物形成情况，我们得出结论，AmyEs水解CS4减少了长链寡糖的形成，提高了产物的特异性，从而增加了G6产物的含量和纯度。这些结果表明，通过分支酶对淀粉进行定向链修饰，可以提高MOS形成淀粉酶的底物选择性。近年来，高产量和高纯度的 MOS 的生产变得越来越有吸引力，需要优化的加工操作和酶水解方法来制造 MOS。其中，G6和G7已被报道在诊断方面有特定的应用，作为蛋白质和细胞的特异性识别标记。通过淀粉衍生方法将低成本淀粉转化为具有特定 DP 值的高比例 MOS 通常使用特异性酶 MFAses 来实现。然而，MFAses的随机攻击模式总是会产生不良的水解产物，从而降低 MOS 的产量和纯度。因此，具有优异催化性能和产物特异性的新型 MFAses 有利于在工业条件下制备 MOS。在本研究中，我们报道了一种来自E. salina的新型 G6 形成淀粉酶 AmyEs 的生化特性和水解模式，属于GH13家族的一个新亚家族，具有特殊的底物水解模式。基于AmyEs对高支链淀粉的选择性外切，构建了一种结合分支酶AqGBE和AmyEs的异步转化策略，并通过调节淀粉的分子结构来确定提高G6产量和纯度。
7.1 .海洋粘细菌中 G6 形成淀粉酶 AmyEs 属于 GH13 亚家族的新成员
新型 G6 形成淀粉酶 AmyEs 是来自海洋粘细菌的 GH13 淀粉酶的第一个成员。AmyEs 表现出 GH13 α-淀粉酶的典型特征，具有三个保守的催化残基(Asp402、Glu434、Asp508)、七个保守序列区域、催化(β/α)8桶结构域和 C 末端结构域，但与已报道的 α-淀粉酶的序列同一性较低(<32%)。GH13 家族被认为是主要的 α-淀粉酶来源，其中已知 GH13_1、5、6、7、15、19、24、27、28、32、36、37、41、42、43、45 和 46 含有 α-淀粉酶成员。进化分析表明，来自海洋粘细菌的AmyEs及其同源蛋白在系统发育树中形成一个独立的簇，与所有剩余的GH13亚家族完全分离，表明建立了一个由海洋粘细菌α-淀粉酶组组成的新的GH13亚家族。
粘细菌是一种很有前途的淀粉分解酶来源，目前已从土壤粘细菌Myxococcus sp.、Corallococcus sp.、Cystobacter sp. 和Archangium sp.中鉴定出一系列能形成 MOS 的 α-淀粉酶。海洋粘细菌是一类尚未被探索的生物，为新酶的发现提供了巨大的宝藏。到目前为止，G6-淀粉酶主要存在于芽孢杆菌属和气杆菌中发现的几种和珊瑚球菌属 结果显示，AmyEs是第一个来源于海洋粘细菌的能形成MOS的α-淀粉酶，其序列相似度与已报道的G6-淀粉酶和从土壤粘细菌中鉴定出的淀粉酶(<15%)极低，且在特定的生境中具有潜在的淀粉转化能力。
7.2 . G6-淀粉酶AmyEs对具有不同结构特征的淀粉表现出特异性的内切和外切选择性裂解
淀粉酶在底物特异性方面的差异通常与两个主要方面有关：底物性质和酶催化特性。AmyEs 切割的 MOS 的最低 DP 为 G7，水解效率低，因此在 AmyEs 水解物中观察到 G6 和 G7 的显著积累。MFAses 通常通过将外切型和内切型活性相结合来显示多重攻击模式。与大多数内切型MFAses相比，AmyEs的水解过程根据碘结合和TLC方法也具有两个相似的阶段。第一阶段涉及长内链和线性淀粉通过内切淀粉水解模式水解为高DP寡糖。第二阶段显示出由内切淀粉水解模式转变为外切淀粉水解模式的趋势，导致淀粉转化为MOS，积累率为19％G1-G5，53％G6和28％G7-G8。
通常，分支点为 MFAses 的逐步酶促裂解提供了屏障，并且对酶促水解具有抵抗作用。AmyEs 似乎主要在糖原水解过程中修剪分子的外围部分，导致分子量下降幅度较小，且均匀性更好(图4)。另一方面，由于α-1,6键之间的跨度较短，AmyEs无法通过多次攻击模式水解淀粉的内链，而较高的支链密度迫使AmyEs通过外切选择性裂解模式特异性地将糖原和CS4水解成纯度更高的G6(71–82％)。同时，与玉米淀粉和CS4相比，支链DP <6，DP 6–12和DP 13–24的转化更稳定(表 1) 是从牡蛎糖原的支链长度分布中鉴定出来的。这种外切淀粉酶模式的转变赋予 AmyEs 出色的产品特异性，从而在淀粉水解过程中产生更高的 MOS 纯度。因此，我们推测具有高密度 α-1,6 糖苷键和低长内链含量的特异性底物有利于产生高纯度的特异性 MOS，这可以通过特异性 MFAses(如 AmyEs)通过结构修饰促进特异性的外切选择性裂解来实现。
7.3 . AmyEs 和分支酶通过侧链修饰异步转化玉米淀粉为 MOS
除了酶的发现和定向结构改造外，还设计了多酶协同作用来提高特定 MOS的产量和纯度，如 CGTase 和 CD 水解酶协同作用、MFAse与脱支酶协同作用。然而，大多数CD水解酶的多次水解总会生成不良的副产物, 而脱支酶作用下释放的线性淀粉链也通过形成有序结构来抵抗 MFAses 的酶水解。本研究考虑到AmyEs对高支链淀粉的特定底物选择性，提出了一种通过MFAses和脱支酶协同作用的异步转化策略，旨在通过淀粉侧链修饰来提高特定MOS的纯度和产量(图 7)。AqGBE处理提高了淀粉的支链密度，降低了淀粉的外链长度，通过结构修饰提高了AmyEs特异性MOS形成效率。与单一AmyEs处理相比，改性玉米淀粉水解G6的纯度和产率分别提高了9.5%和5%。此外，特异性MFAses和分支酶异步转化淀粉不仅可以生产出高纯度的特异性MOS，还可以作为一种酶修饰方法来制备具有短外链、高α-1,6糖苷键密度和特定分子量的葡聚糖。
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图7.特异性MFAses与葡聚糖分支酶结合生产特异性MOS和葡聚糖的异步转化策略示意图。建立的提高具有特定DP(特定MOS)的线性寡糖的纯度和产量的异步转化策略分为以下两个步骤。第一步是通过葡聚糖分支酶对淀粉进行改性，这会增加淀粉短外链的含量，并减少其具有高α-1,6-糖苷键密度的长内链长度。淀粉的改性显著增加了淀粉中的特异性外切点，而不是随机的内切点，这有利于产品特异性。因此，在第二步中，特异性MFAses，例如G5-、G6-或G7-淀粉酶，将改性淀粉转化为不同DP(如G5、G6或G7)的高纯度MOS和具有特殊分子结构的葡聚糖。示意图并不旨在表示淀粉的天然构象。
