《Food Chemistry》海洋来源的海藻黄杆菌中一种新型α-L-岩藻糖苷酶的发现、鉴定及其在2′-岩藻糖乳糖生产中的应用
文摘
科学
2024-08-24 16:24
江苏
2021年8月22日，来自中国海洋大学的Wenting Zhou等人在Food Chemistry上发表了一篇题为Discovery and characterization of a novel α-L-fucosidase from the marine-derived Flavobacterium algicola and its application in 2′-fucosyllactose production的研究性论文。
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通讯单位：College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China2′-岩藻糖乳糖(2′-FL)是母乳中的营养成分之一，具有多种有益健康的作用。α-L-岩藻糖苷酶是制备2′-FL的生物技术工具。本研究从海藻黄杆菌中提取了一种新型高效α-L-岩藻糖苷酶OUC-Jdch16，并将其应用于体外生产2′-FL。OUC-Jdch16属于糖苷水解酶(GH)家族29，在25 ℃和pH 6.0条件下具有最高的4-硝基苯-α- l-岩藻皮苷水解活性。OUC-Jdch16通过将pNP-α-岩藻糖的岩藻糖基残基转移到乳糖上，催化合成2′-FL。在最优的转岩藻糖基化条件下，pNP-α-岩藻糖在48 h和120 h的转岩藻糖基化产物得率分别达到84.82 %和92.15 % (mol/mol)。此外，OUC-Jdch16能够将岩藻糖基残基转移到其他糖基受体上，产生新的岩藻糖基化化合物。本研究表明，OUC-Jdch16可作为制备2′-FL及其他新型糖苷类化合物的有效工具。![]()
人乳寡糖(HMOs)是一种异质性碳水化合物寡聚物，是人乳中第三丰富的固体成分，已被证明对婴儿健康、免疫调节作用和双歧杆菌菌株的选择性刺激至关重要。HMOs由多种不同的寡糖组成，已有100多种HMOs结构得到了很好的研究。2′-FL是最丰富的岩藻糖基化寡糖，占总HMOs的30 %以上，因其具有多种有益的健康效应，已被欧盟批准作为婴儿配方食品和膳食补充剂的食品添加剂。迄今为止，已经建立了几种用于生产2′- FL的策略，包括提取、化学合成、酶法合成和工程菌生产。然而，提取的来源有限，化学合成涉及有毒试剂的添加。与全细胞合成相比，酶促合成具有反应周期短、易于分离纯化等优点，如无需去除细胞和复杂的培养基成分等。酶法合成2′-FL是一种高效、方便分离高纯度2′-FL的先进方法。
在过去的十年中，各种α-L-岩藻糖苷酶被应用于2′-FL的合成并引起了广泛的关注. α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)是一种水解岩藻糖苷的酶，根据其序列同源性，α-L-岩藻糖苷酶被分为GH29，GH95，GH141和GH151家族。通常情况下，能够合成2′-FL的α-L-岩藻糖苷酶主要分布在GH29家族和GH95家族，可以将4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷(pNP-α-fucose)或其他糖基供体的岩藻糖基残基转移到乳糖中，形成2′-FL。转岩藻糖基化活性与水解活性的比值是α-L-岩藻糖苷酶参与2′-FL合成的重要参数。因此，有必要控制有助于降低水解活性的反应条件，并使平衡偏向于2′-FL和其他HMOs。岩藻糖苷酶是GH95家族岩藻糖苷酶的突变体，通过直接突变亲核位点来消除其水解活性，已被用于合成2′-FL (HMOs)。其他应用于2′-FL合成的酶为α -1,2-岩藻糖基转移酶。然而，高成本的岩藻糖基残基供体(鸟苷酸二磷酸岩藻糖)限制了α-1,2-岩藻糖基转移酶在2′-FL体外制备中的应用。由于岩藻糖基残基供体pNP-α-岩藻糖的商业可得性和广泛的识别性，目前研究较多的2′-FL体外合成酶为α-L-岩藻糖苷酶。然而，作为一种糖苷水解酶，α-L-岩藻糖苷酶在合成HMOs的转岩藻糖基化反应中通常获得较低的产率。例如，Lezyk等报道了一种GH29家族的岩藻糖苷酶Mfuc5，能够以pNP-α-岩藻糖为底物合成2′-FL，产率为6.4 %(mol/mol)。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) GG来源的GH29家族岩藻糖苷酶可将pNP-α-岩藻糖和乳糖转化为岩藻糖乳糖，以乳糖为底物的产率为25 % (mol/mol)。为了进一步提高2′- FL的产率，需要寻找具有高转岩藻糖基化效率和优良性质的α-L-岩藻糖苷酶的新来源。
据文献报道，黄杆菌科家族的一些成员是多种糖苷水解酶的重要来源。例如，Formosa agariphila KMM 3901T具有较高的碳水化合物酶类密度，其基因组中含有多达88个GH家族。黄杆菌科家族包括黄杆菌属algicola在内的部分菌株能够消化岩藻聚糖，在以岩藻聚糖为碳源的培养基中生长良好。因此，黄杆菌科是具有高活性的α-L-岩藻糖苷酶的潜在生产者。近年来，从广泛的生境中分离到大量的黄杆菌科菌株。然而，据我们所知，对黄杆菌科中的α-L-岩藻糖苷酶知之甚少。
本研究从对pNP-α-岩藻糖具有水解活性的岩藻聚糖酶海洋菌株F. algicola 12076中克隆得到1个具有高转岩藻糖基化效率的新型α-L-岩藻糖苷酶OUC-Jdch16。对重组OUC-Jdch16的生化特性进行了研究。随后，对高转糖基效率的OUC-Jdch16在制备2′-FL和其他新型糖苷类化合物中的潜在应用进行了研究。
1.α-L-岩藻糖苷酶OUC-Jdch16的挖掘与序列分析对F. algicola 12076发酵上清液的pNP-α-focal-水解活性进行了测试，发现其水解活性为0.8 U/mg粗蛋白，结果如图1A所示，随着反应时间的延长，pNP-α-focal的释放量逐渐增加，84 h内pNP-α-focal的释放量高达2.2 mM(图1A)。说明褐藻F. algicola 12076分泌的α-L-focusidase降解了85%以上的pNP-α-focus。![]()
图1. α-L-岩藻糖苷酶OUC-Jdch16的挖掘及序列分析。(A)在F. algicola 12076发酵液催化作用下pNP释放量的时间历程。(B) OUC-Jdch16与其他α-L-岩藻糖苷酶的系统发育分析。使用MEGA version 7.0软件得到邻接树。红色星表明本研究的OUC-Jdch16。(C) OUC-Jdch16 (MW767957)与T. forsythia (AEW21393.1)、B. thetaiotaomicron(AAO78076.1)、L. casei (CAQ67984.1)、T. maritima(AAD35394.1)的α-L-岩藻糖苷酶蛋白序列比对。两个催化残基Asp226和Glu283被红星标记。
为了发现F. algicola 12076基因组DNA中编码α-L-岩藻糖苷酶的基因，根据材料和方法设计了一对简并引物，扩增了一个编码α-L-岩藻糖苷酶OUC-Jdch16 (MW767957)的单产物。α-L-岩藻糖苷酶基因的开放阅读框(ORF)长度为1371 bp，编码456个氨基酸残基的蛋白，预测分子量为54.3 kDa。系统发育分析表明，OUC-Jdch16属于GH29家族的一个独立分支(图1B)，其与副干酪乳杆菌α-L-岩藻糖苷酶AlfC (CAQ67984.1)的相似性为33.91%。这些结果表明，OUC-Jdch16是GH29 α-L-岩藻糖苷酶的新成员。OUCJdch16和其他参与pNP-α-聚焦水解和2'-FL合成的α-L-岩藻糖苷酶的蛋白序列比对显示，有两个保守的活性位点，包括Asp226和Glu283(图1C)。在α-L-岩藻糖苷酶的催化过程中，Asp和Glu分别扮演催化亲核试剂和酸碱残基的角色。然而，酸/碱残基Glu并非在所有GH29 α-L岩藻糖苷酶中都是保守的。以8个α-L-岩藻糖苷酶为模板，用Easy Modeller 4.0构建OUC-Jdch16的同源模型，与OUC-Jdch16的一致性至少为32.78 %。例如，OUC-Jdch16与类芽胞杆菌属的α-L-岩藻糖苷酶(PDB：6gn6)和多形拟杆菌的α-L-岩藻糖苷酶(PDB：2wvt)具有37.78 %和36.95 %的结构一致性。OUC-Jdch16的3D结构如图1D所示，催化亲核试剂(Asp226)和酸/碱催化剂(Glu283)都位于底物结合和催化口袋中。F. algicola 12076的OUC-Jdch16以pET-28a(+)表达载体在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功表达，其活性蛋白含有N端和C端His标签。Coomassie Brilliant Blue R-250染色后，SDS-PAGE上可见一条清晰的条带，分子量约为54 kDa(图2)，与推导出的氨基酸序列预测的分子质量大小相匹配。重组的OUC-Jdch16的分子量与来自Thermotoga maritima的α-L-岩藻糖苷酶(50.7 kDa)、来自Tannerella的TfFuc1(50.8 kDa)，以及来自小儿杆菌 CAU209(50kDa)的分子量相似，但比硫氨酸解脲酵母(76.8 kDa)的α-L-岩藻糖苷酶同工酶2轻。纯化后的OUC-Jdch16的pNP-α-岩藻糖水解活性为17.11 U/mg，纯化倍数为1.88，回收率为31.31%![]()
图2 .对纯化后的OUC-Jdch16进行SDS-PAGE分析。Lane M，蛋白分子量Marker。Lane 1，粗酶提取液。Lane 2，OUC-Jdch16经Ni-亲和层析纯化。
我们之前的研究表明，WT和N253A突变体的结构几乎相同，唯一显著的区别是Glu324侧链的旋转取向。在N253A突变体中，破坏Asn253和Glu324之间的相互作用导致Glu324侧链的位置移动。这种转变创造了一个开口，使溶剂分子能够进入酶的活性部位在这项研究中，我们发现Asn253和Glu324直接与VAA相互作用。这表明Asn253和Glu324的功能作用对异构酶活性至关重要。以pNP-α-岩藻糖为底物，对纯化的OUC-Jdch16的水解活性进行了表征。其水解pNP-α-岩藻糖的最适反应温度为25℃，低于海栖热袍菌的α-L-岩藻糖苷酶Tm α fuc(60℃以上)和土地杆菌属sp. CAU209的α -L-岩藻糖苷酶Pb Fuc(35℃)。揭示了OUC-Jdch16是一个冷适应的α-L-岩藻糖苷酶，这可能与其来源于海洋环境有关。该最佳反应温度可以缓解其工业应用中的能源成本。随着贮藏温度的升高，OUC-Jdch16的贮藏稳定性下降。OUC-Jdch16在20 °C下保存12 h后，仍保留89.66 %的酶活(图3A)。但在其最适反应温度下，OUC-Jdch16并不稳定，酶活保留不足70 %。值得注意的是，当贮藏温度超过35℃时，几乎检测不到残余酶活(图3A)。提示在今后的研究中，OUC-Jdch16的热稳定性有待进一步提高。![]()
图3 .纯化的具有pNP-α-岩藻糖水解酶活性的OUC-Jdch16的生化特性。(A)不同温度对纯化的OUC-Jdch16水解pNP-α-岩藻糖活性及稳定性的影响。不同p H对纯化的OUC-Jdch16的pNP-α-岩藻糖水解活性(B)和稳定性(C)的影响。(D)一系列浓度为1 mM和10 mM的金属离子和化学物质对纯化的OUC-Jdch16的pNP-α-岩藻糖水解活性的影响。所有数据均为至少3次重复实验的平均值。
纯化的OUC-Jdch16在pH 6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中表现出最高的pNP-α-岩藻糖水解活性(图3B)。OUC-Jdch16对强酸性和弱碱性反应条件敏感，当反应pH低于4.0和高于7.0时，其活性明显下降。所有这些数据表明，OUC-Jdch16在弱酸性环境中表现出最高的水解活性，这与大多数研究的α-L-岩藻糖苷酶相似，如禾谷镰孢菌中的FgFCO1 (pH 4.6)和Xanthomonas campestris pv. campestris中的NixE (pH 5.0)。图3C结果表明，OUC-Jdch16在pH 4.0~7.0范围内稳定。在pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液中孵育12 h后仍保留79.71 %的初始活性(图3C)，比其他α-L-岩藻糖苷酶表现出较低的贮藏稳定性。因此，其pH稳定性，特别是在最适pH下优异的贮藏稳定性将有利于其应用。采用上述最佳反应条件进行动力学测定。纯化的OUC-Jdch16对pNP-α-岩藻糖的表观Km和Vmax参数分别为1.043 mM和18.06 μmol/mg/min。OUC-Jdch16的Km显著低于干酪乳杆菌Afl B (2.9 mM)、干酪乳杆菌Afl C (5.2 mM)和多形芽孢杆菌α-L-岩藻糖苷酶(1.5 mM)，但高于α-L-岩藻糖苷酶Pbfuc (0.72 mM)、α-L-岩藻糖苷酶Tm α Fuc (0.034 mM)和α-L-岩藻糖苷酶Mfuc5 (0.13 mM )。Ca2+、Cu2+、K+、Na2EDTA和SDS对OUC-Jdch16水解pNP-α-岩藻糖的活性均有抑制作用，且表现出金属离子和化学物质的浓度依赖性(图3D)。其中，Cu2+的抑制效果最为明显，1 mM和10 mM Cu2+分别仅保留了75.55 %和6.06 %的酶活。此外，OUC-Jdch16受低浓度Na (1 mM)的轻微激活，这与其他海洋来源的酶一致。其他金属离子和化学物质对OUC-Jdch16的酶活影响较小(图3D)。4.通过OUC-Jdch16生产高水平的2′-FL为了验证应用OUC-Jdch16合成2′-FL的可行性，首先在pNP-α-岩藻糖水解(25 °C和pH6.0)的最佳条件下进行转糖基化反应，以确保存在过量的岩藻糖残基。同时，加入500mM 乳糖作为岩藻糖基残基受体。实施 ESI-MS以验证 OUC-Jdch16的转岩藻糖基化产物，ESI-MS 谱图显示[M+Na]+离子在m/z值为511.1611(图4B) ，这与标准2′-FL及其异构体3′-FL(488.44)的分子量一致。事实上，几种具有转岩藻糖基化活性的α-L-岩藻糖苷酶，如从海洋毛滴虫中分离的Thma，宏基因组衍生的Mfu2和来自Pedobacter sp.的PbFuc，可以催化2′-FL的合成。而PbFuc的转糖基化产物主要由2′-FL和3′-FL组成。HPLC分析表明，在14.37 min时，OUC-Jdch16的岩藻糖基化产物为2′- FL (图4A )。反式岩藻糖基化产物的一维1H NMR谱见图4C，与2′-FL标准品一致。结合HPLC、ESI - MS和1H NMR结果，纯化后的OUC-Jdch16可将pNP-α-岩藻糖中的岩藻糖基残基转移至乳糖中，积累2′-FL。![]()
图4. (A)岩藻糖基化产物、2′-FL标准品和3-FL标准品的HPLC图谱。(B)反式岩藻糖基化产物的ESI - MS图谱。(C)反式岩藻糖基化产物和2′-FL标准品的一维1H NMR谱图。(D) OUC-Jdch16转岩藻糖基化反应的最适pH。(E) OUC-Jdch16转岩藻糖基化反应的最适温度。
如上所述，α-L-岩藻糖苷酶OUC-Jdch16同时催化聚焦化和水解反应。因此，在乳糖作为受体过量的前提下，优化反式聚焦化条件，包括温度、pH、酶投加量和反应时间，以减轻2′-FL的水解，提高2′-FL的产率是必不可少的。纯化的OUC-Jdch16在pH 5.0柠檬酸缓冲液中25◦C下的2′-FL产率最高(图4D和4E)。在最佳温度和pH下考察了酶用量与反应时间的关系，发现反式聚焦化产物的产率与酶用量和反应时间呈正相关，当酶用量为14.24 u时，pNP-α-岩藻糖在120 h内的产率最高，达到92.15% (mol/mol)。之后，随着OUC-Jdch16用量的增加，转化率不显著提高。此外，在最优OUC-Jdch16用量(14.24 U)下，84 h和48 h反式聚焦反应的产率分别达到89.27% (mol/mol)和84.82% (mol/mol)(图5)。虽然随着反应时间延长至120 h，产率有所提高，但48 h后的合成速率明显减慢。当OUC-Jdch16在最佳反式聚焦化条件(pH 5.0和25◦C)下孵育48小时、84小时和120小时时，酶活性仍保持6.14%。因此，随着时间的延长，反式聚焦化产物的产率增长越来越慢(图5)。48 h、84 h和120 h的产率分别达到176.71 μmol/h、106.27 μmol/h和76.79 μmol/h。因此，综合考虑反应时间和产率，在实际应用中可确定最佳反应时间为48 h。当酶的用量低于3u时，24 h后产量基本保持不变，说明酶几乎完全失活，该用量不足。通常，通过α-L-岩藻糖苷酶转化的2′-FL产率较低，因为产物可以同时水解。例如，F. graminearum的α-L-岩藻糖苷酶FgFCO1以柑橘木葡聚糖为岩藻糖基供体催化2′-FL积累，而24 h内的摩尔产量仅为14% (mol/mol)。α-L-岩藻糖苷酶Thma和α-L-岩藻糖苷酶Mfuc5都可以从100 mM乳糖和25 mM pNP-α-岩藻糖的底物中制备含2′-FL的岩藻糖乳糖。而Thma的2′-FL产率最高，为6.4% (mol/mol)。最近，来自Pedobacter sp. CAU209的α-L-focusidase PbFuc可将高达85%的pNP-α-focus转化为2′-FL和3′-FL，2′-FL 产率为14.5% (mol/mol)。此外，α-L-focusynthase AfcA的突变体1,2-α-L-focusynthase N423H可以从乳糖和β-L-focusylfluoride中稳定地产生2′-FL，转化率最高为88% (mol/mol)。相比之下，OUC-Jdch16较低的2′-FL水解活性(0.97 U/mg蛋白)可能是其2′-FL产率较高的原因。与Mfuc5和FgFCO1相比，2′-FL-水解活性非常低，后者也具有合成2′-FL的转糖基活性。因此，OUC-Jdch16可以有效地将pNP-α-岩藻糖和乳糖转化为2′-FL，且具有较高的产率，在2′-FL的制备中具有潜在的应用价值。然而，与微生物生产相比，利用pNP-α-岩藻糖酶法合成2′-FL存在诸多不足。一般而言，微生物生产2′-FL的最短周期为48 h。在本研究中，最佳反应时间与微生物生产的发酵时间相当。另一方面，酶促合成2'-FL具有操作简单，便于分离高纯度2'-FL的优点。然而，作为一种人工合成的岩藻糖基供体，pNP-α-岩藻糖存在一些难以避免的缺点，如在水中溶解度低、成本高等。因此，发现一些低成本的天然底物，如岩藻糖基化寡糖和木葡聚糖，是降低酶法合成2′-FL成本的一种有前景的策略。遗憾的是，OUC-Jdch16对木葡聚糖和一些藻源岩藻糖供体(数据未显示)没有表现出转糖基活性。因此，合理改造OUC-Jdch16以提高其底物选择性或挖掘对这些低成本天然底物具有高活性的酶是未来的主要研究重点之一。![]()
图5. 酶用量和反应时间对转岩藻糖基化产物积累的影响。
众所周知，一些具有转糖酶活性的碳水化合物水解酶可以催化合成一片新的糖苷类化合物。据此，本研究选择了包括糖类、醇类和Boc-L-Ser-Ome在内的岩藻糖基化残基受体，探索OUC-Jdch16合成新型岩藻糖苷的可行性。同时，在上述所有的转岩藻糖基化反应中，pNP-α-岩藻糖是岩藻糖基残基的供体。正离子ESI - MS结果表明，在受体D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和甘露醇的存在下检测到了转岩藻糖基化产物(图6)。而OUC-Jdch16几乎不具备从麦芽糖、葡萄糖醛酸、昆布二糖、新琼二糖、几丁二糖、1-丙醇、2-丙醇、乙醇和Boc-L-Ser-Ome(数据未显示)受体合成岩藻糖苷的能力。事实上，除了HMOs，α-L-岩藻糖苷酶还表现出合成其他糖苷的潜力。一个典型的例子是，通过α-L-岩藻糖苷酶PbFuc的转化制备了新的岩藻糖基化寡糖，包括岩藻糖基化葡萄糖、岩藻糖基化半乳糖、岩藻糖基化阿拉伯糖、岩藻糖基化核糖、岩藻糖基化木糖和岩藻糖基化麦芽糖。相比之下，OUC-Jdch16首次合成了岩藻糖基化甘油。然而，这些岩藻糖基化糖苷的详细结构和生物活性有待解决和研究。目前，各种岩藻糖基化糖苷，尤其是岩藻糖基化寡糖，具有多种营养和功能活性而备受关注。因此，OUC-Jdch16可以直接作为一种生物技术工具，用于开发具有健康有益作用和潜在应用的新型糖苷。 ![]()
图6. 不同受体形成的转岩藻糖基化产物的ESI-MS谱包括D -木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和甘露醇。
综上所述，本研究发现并表征了一种具有转岩藻糖基活性和优异pH稳定性的新型低温α-L-岩澡糖苷酶OUC-Jdch16，并将其应用于制备2′-FL及其他糖苷类化合物。在最优条件下，供体2′-FL在120 h、84 h和48 h内的产率分别达到92.15 %、89.27 %和84.82 %。此外，OUC-Jdch16具有合成其他新型岩藻糖基化糖苷的潜力。OUC-Jdch16有望成为一种高效生产2′-FL和新型糖苷的生物技术工具。
原文：Discovery and characterization of a novel α-L-fucosidase from the marine-derived Flavobacterium algicola and its application in 2′-fucosyllactose production.DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.130942
