2024年6月，来自中国海洋大学的Guangning Chen等人在International Journal of Biological Macromolecules上发表了一篇题为Structural investigation of Fun168A unraveling the recognition mechanism of endo-1,3-fucanase towards sulfated fucan的研究性文章。
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通讯作者： Yingang Feng;Yaoguang Chang通讯单位：CAS Key Laboratory of Biofuels, Shandong Provincial Key Laboratory of Synthetic Biology, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, PR China；College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266404, PR China背景：硫酸化岩藻多糖由于其多种生理活性而引起人们的关注.内切-1，3-岩藻多糖酶是研究硫酸化岩藻多糖结构和建立其构效关系的重要工具。然而，内切-1，3-岩藻多糖酶对硫酸化岩藻多糖的底物识别机制尚不清楚，限制了内切-1，3-岩藻多糖酶在硫酸化岩藻多糖研究中的应用。范围和方法：利用X射线衍射技术，首次获得了内切-1，3-岩藻多糖酶(Fun 168 A)及其与四糖产物的复合物的晶体结构。通过糖组学和核磁共振(NMR)鉴定了Fun 168 A的新的亚位点特异性。关键发现和结论：Fun 168 A的结构确定在1.92 Å处。残基D206和E264分别作为亲核试剂和一般酸/碱。值得注意的是，Fun 168 A策略性地将一系列极性残基定位在-2至+3的亚位点，使得能够通过盐桥或氢键与硫酸化岩藻多糖的硫酸基相互作用。基于Fun 168 A的结构和底物识别机制，我们鉴定了Fun 168 A的−2和+2亚位点的新的亚位点特异性。本研究首次揭示了内切-1，3-岩藻多糖酶的结构和底物识别机制，为进一步研究和开发硫酸化岩藻多糖提供了有价值的工具。
硫酸化岩藻多糖是在褐藻和棘皮动物中发现的硫酸化多糖。棘皮动物岩藻多糖硫酸酯主要由α-1，3糖苷键连接的L-岩藻糖组成，其O-2和(或)O-4位带有硫酸酯基。大多数来自棘皮动物的硫酸化岩藻多糖由重复的寡糖单元组成。α-1，3连接的硫酸化岩藻多糖具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗癌、降血脂、抗高血糖、免疫刺激和抗凝血作用。同时，硫酸化岩藻多糖具有良好的流变性，并已用于构建新型食品输送系统。因此，从商业和应用的角度来看，硫酸化岩藻多糖具有重要的前景。
内切-1，3-岩藻多糖酶是特异性水解硫酸化岩藻多糖中α-1，3键的内切作用水解酶，是研究硫酸化岩藻多糖结构和建立其构效关系的有利工具。内切-1，3-岩藻多糖酶已成功用于测定各种海参物种的硫酸化岩藻多糖的结构。根据CAZy分类，三个糖苷水解酶家族GH168、GH174和GH187被指定为内切-1，3-岩藻多糖酶(截至2024年2月)。据我们所知，已经报道了来自GH168的7种酶，来自GH 174的4种酶和来自GH 187的1种酶。这三个家族在识别具有不同硫酸化模式的硫酸化岩藻多糖方面表现出复杂的差异。来自GH168家族的Fun 168 A切割Fucp 2(OSO 3-)(F2 S)和Fucp(F0 S)之间的糖苷键，而来自GH 174家族的Fun 174 A切割相同的键。来自GH 168家族的Fun 168 D切割F2 S和Fucp 2，4(OSO3 −)(F2，4S)之间的糖苷键。此外，来自GH 187家族的Fun 187 A切割F0S和F2 S之间的糖苷键。
然而，来自这些家族的内-1，3-岩藻多糖酶的三维结构及其底物识别机制仍然未知。这阻碍了内切-1，3-岩藻多糖酶在硫酸化岩藻多糖的研究和开发中的应用。GH 168是第一个内切-1，3-岩藻多糖酶家族，在发现它后对其进行了结构研究，特别是集中在其创始成员Fun 168 A。本研究以Fun 168 A为代表，旨在揭示内切1，3-岩藻多糖酶对硫酸化岩藻多糖的底物识别机制。利用X-射线衍射技术解析了Fun 168 A及其与四糖产物的复合物的晶体结构。对Fun 168 A的催化残基和底物识别机制进行了研究。此外，利用识别机制分析、糖组学和核磁共振(NMR)等方法，对Fun 168 A进行了新的亚位点特异性鉴定。据我们所知，这是第一次报道内切1，3-岩藻多糖酶对硫酸化岩藻多糖的识别机制。
1.Fun 168 A的晶体结构为典型的(β/α)8桶形折叠在1.92 nm处测定Fun 168 A的晶体结构(表S1，PDB代码8 YA 6)。不对称单元包含一个拷贝的蛋白质，覆盖从D39到K407的残基。Fun 168 A总体上采用典型的(β/α)8磷酸丙糖异构酶(TIM)桶折叠(残基从D39至A369)，其包含8个α-螺旋和8个平行β-链，所述β-链沿肽主链沿着交替(图1A)。大部分α-螺旋由10个以上的氨基酸残基组成，除了α5和α8仅由3个残基组成。此外，从P370到K407的基序显示出反平行的β折叠，包括3条β链和通过疏水界面与TIM桶的α7紧密结合的β9。![]()
图 1.Fun 168 A的结构和催化残基。A)Fun 168 A的总体结构。从N-末端到C-末端，该结构以从蓝色到红色的彩虹着色。指示了二级结构元素的编号。B)预测的Fun 168 A的表面电势。C)催化残基在Fun 168 A中的位置。D)催化残基的保守程度。
使用DALI服务器进行的结构相似性搜索显示，与Fun 168 A最相似的蛋白质是来源于Geobacillus thermoleovorans的GH 13 α-淀粉酶(称为GTA，PDB代码4 E2 O)。r.m.s.d.两个结构之间的值被确定为4.73μm。尽管采用了相似的折叠，这两种酶表现出显着的结构差异。GTA含有两个钙结合位点，而在Fun 168 A中没有观察到对应于钙离子的密度。此外，在GTA中观察到一个独特的结构域，该结构域采用由两个反向平行的β-折叠组成的β-三明治折叠。Fun 168 A与四糖产物的复合晶体(PDB代码8 YA 7)。与Fun 168 A-apo结构类似，Fun 168 A-holo结构也在不对称单元中包含一个分子(表S1)的情况下。Fun 168 A的底物结合口袋位于桶体中心的高电位凹槽中(图1B)。该沟由8个环组成，分别连接β1-α1(F68-T76)、β2-α2(E93-A104)、β3-α3(N129-P181)、β4-α4(D206-K219)、β5-β5(N246-F255)、β6-α6(F263-S272)、β7-α7(G298 K311)和β8-α8(G347-P361)。正电势口袋促进酶与带负电荷的底物的结合。我们之前的研究表明，D206和E264是Fun 168 A的关键残基，因为突变体D206 E和E264 Q对Ib FUC无活性。这两个残基在GH 168家族中是严格保守的(图1D)，并且位于沟底的中心区域。D206位于β4和α4之间的环，E264位于β6和α6之间的环。已经确定，利用经典保留机制的糖苷水解酶普遍表现出转糖基化活性。Fun 168 A的转β-糖基化活性已经过实验验证，因此证实了其对保留机制的粘附性。保留机制涉及由两个基本残基促进的两步反应：亲核试剂和一般酸/碱。亲核试剂攻击异头碳并形成共价糖基-酶中间体。一般的酸/碱残基使水分子去质子化，其攻击异头碳以产生最终产物。D206和岩藻糖基-1亚位点的C1原子之间的距离为3.0 nm，表明D206是亲核试剂。此外，E264和原子O 1之间的距离为2.7 nm，表明E264作为一般的酸/碱保留物起作用(图1C)。
3. Fun 168 A通过几个极性残基识别硫酸化岩藻多糖，这些残基跨越-2到+3个亚位点通过Fun 168 A的复合体结构鉴定了负亚位点区域中参与底物识别的关键残基。结构为α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp 2，4(OSO 3-)-1 3-α-L-Fucp 2(OSO 3-)-1 3-α-L-Fucp 2(OSO 3-)的配体是从Isostichopus badionotus(IbFUC)的硫酸化岩藻多糖水解产物中获得的。2Fo-Fc的密度差异明确显示了一个四糖跨越底物结合口袋的亚位点从-4到-1，配体可以很容易地构建到密度中(图2B)。与底物的相互作用主要在−1和−2亚位点观察到，而−3和−4亚位点的岩藻糖基残基位于凹槽外部，未观察到相互作用(图2A)。结果表明，-1和-2亚位点是Fun 168 A底物特异性的关键亚位点，而-3和-4亚位点的影响有限。![]()
图2.Fun 168 A的负亚位点区域中提出的识别机制。A)具有四糖的Fun 168 A的表面表示。B)四糖配体的2Fo-Fc电子密度图(在1.0 σ处绘制轮廓，蓝色网格)。C)与四糖相互作用的关键氨基酸残基。黄色棒和青色棒分别代表四糖配体和氨基酸残基。D)E93和K94在底物结合于+1亚位点之前(粉红色)和之后(青色)的构象变化。虚线表示在底物结合之前(红色)和之后(蓝色)氨基酸和配体之间的距离。
在-1亚位点上存在一个被碱性和极性残基包围的空腔，它容纳并补充了F2 S的酸性硫酸酯基团的电荷(图2C)。在这个亚位点，K94在底物结合过程中经历了构象变化。K94侧链氨基与岩藻糖基2-O-硫酸酯基之间的距离由6.9 bp(apo)缩短为5.0 bp(holo)，形成盐桥。同时，氨基和4-羟基之间的距离从5.4 π(apo)缩短到2.8 π(holo)，并伴随着氢键的建立(图2D)。类似地，在底物结合期间在E93中也观察到构象变化。其侧链羧基与4-羟基之间的距离从5.0 π(apo)缩短到2.7 π(holo)，导致氢键的产生。此外，R170与2-O-硫酸根基团建立盐桥，而N129和W134与2-O-硫酸根基团形成氢键。W350与5-甲基之间发生疏水相互作用。Y127和N246分别与4-羟基和6-氧原子通过氢键相互作用。因此，Fun 168 A在-1亚位点部署了一系列极性残基，导致F2 S被严格识别。
Fun 168 A的−2亚位点被F2 S占据。该亚位点的岩藻糖残基的2-O-硫酸基团向沟的底部延伸，并且是与酶相互作用的唯一基团(图2C)。残基K94与2-O-亚硫酸盐基团形成盐桥。此外，W350和R351通过水分子与2-Osulfate基团形成水桥。4-羟基基团指向凹槽外部，并且不与任何氨基酸残基相互作用。
为了研究Fun 168 A在阳性亚位点区域的识别机制，尝试了失活突变体与底物的共结晶。然而，没有观察到对应于基板的电子密度。因此，进行了Fun 168 A与四糖配体的分子对接。结果显示，+1、+2和+3亚位点与底物具有显著的相互作用，是底物特异性的关键决定因素(图3A)。在+1亚位点，F0 S被R170、Q207和Y266包围。这三个残基导致+1亚位点处的小腔体积，允许F0 S的严格调节。为了验证对+1亚位点的F0 S的严格耐受性，测定了Fun 168 A对管花海参硫酸化岩藻多糖(Ht-FUC)的水解活性。其主要结构为[α-L-Fucp 2(OSO 3-)-1，3-α-L-Fucp 2，4(OSO 3-)1 → 3-α-L-Fucp 1 → 3-α-L-Fucp 2(OSO 3-)]n 。预期在酶解产物中未检测到寡糖。与Ib-FUC相比，Ht-FUC在岩藻糖残基上具有额外的2-O-硫酸酯基团。这表明2-O-硫酸酯基团阻止岩藻糖残基进入+1亚位点，并阻碍水解(图3B)。在+2亚位点，F2，4S通过与硫酸基的极性相互作用与Fun 168 A结合。残基R170和Y132分别与O-2-硫酸根形成盐桥和氢键。残基N267通过氢键与O-4-硫酸根基团相互作用。此外，残基H209和Y266将O-2硫酸根锚定在+3亚位点。![]()
图3.A)在Fun 168 A的正亚位点区域中提出的识别机制。黄色条和青色条分别代表配体和氨基酸残基。B)Fun 168 A对Ib-FUC、Ht-FUC和Ta-FUC的亚位点特异性。红色三角形和直线分别代表岩藻糖和α-1，3-键。
4.鉴定了Fun168A对硫酸化岩藻多糖的新亚位点特异性有趣的是，岩藻糖残基的4-羟基在−2亚甲基位点指向沟外，不与任何残基相互作用。这表明硫酸根基团代替4-羟基基团的存在可能不会阻碍底物进入凹槽。因此，可以假设Fun 168 A的−2亚位点可以同时容纳F2 S和F2，4S。为了证实这一假设，从 T. ananas(Ta-FUC)中提取的硫酸化岩藻糖被选作由 Fun168A 进行酶水解。已证实Ta-FUC中存在结构单元α-L-Fucp-1 → 3-α-LFucp-1 → 3-α-L-Fucp 2，4(OSO 3 −)-1 → 3-α-L-Fucp 2(OSO 3 −)。Fun 168 A对Ta-FUC有水解作用，酶活为4.28 U/ mL。此外，Fun 168 A的酶解产物中的寡糖组成确定的糖组学策略。在产物中观察到m/z为420.0485([M-2 H]2-)的主要寡糖。寡糖的化学组成确认为Fuc 4S 3(“Fuc”代表岩藻糖残基;“S”代表硫酸根基团)。
从酶促产物中分离Fuc 4S 3并进行NMR分析。在1H NMR光谱中观察到约1.2 ppm的高强度信号，这是L-岩藻糖甲基质子的特征。在1H NMR(5.49 ppm、5.38 ppm、5.34 ppm和5.10 ppm)和COSY光谱中观察到α-构型吡喃糖残基的四个信号，并将其指定为A、B、C和D(图4A)。结合COSY和TOCSY光谱进行四糖其他质子化学位移的归属(表1)。因此，残基A被推断为F2 S，因为残基A的H-2信号明显向低场移动。残基B鉴定为F2，4S。残基C和D被鉴定为F0 S。在NOESY光谱中可观察到残基D的H-1至残基C的H-3、残基B的H-1至残基A的H-3和残基C的H-1至残基B的H3的相关信号(图4 B)。Fuc 4S 4的氨基酸序列为D1 → 3C 1 → 3B 1 → 3A。因此，Fuc 4S 3的结构被鉴定为α-LFucp-1→3-α-L-Fucp-1 → 3-α-L-Fucp 2，4(OSO 3 −)-1 → 3-α-L-Fucp 2(OSO 3 −)。
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图4.Fun 168 A对Ta-FUC的亚位点特异性的图示。(A)Fuc 4S 3的1H NMR谱图。(B)Fuc 4S 3的COSY光谱图。NOESY光谱的关键信息如插图所示。
表1.酶促产物中Fuc4S3的1H化学位移。
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结果证实了在-1和+1亚位点分别对F2 S和F0 S具有严格的特异性。此外，−2亚位点表现出更广泛的耐受性，可以容纳F2 S和F2，4S，表明该亚位点具有多样的底物结合能力。同时，我们惊奇地发现，+2亚位点可以容纳F0 S(图3B)。需要注意的是，与−2、−1和+1亚位点相比，+2亚位点在GH 168成员的底物识别中的重要性可能相对较低。关于Fun 168 D的前期研究(Fun 168 A的同源物，同一性为26.6%)显示，Fun 168 D可以裂解寡糖中两个F2 S之间的糖苷键，其结构为α-L-Fucp 2，4(OSO 3 −)-1 3-α-LFucp 1 3-α-L-Fucp 2(OSO 3 −)1 3-α-L-Fucp 2(OSO 3 −)，表明海洋来源的多糖，例如卡拉胶、海萝胶和卟啉。与硫酸基相互作用以识别底物代表了硫酸化多糖水解酶所利用的常见识别机制。这可以归因于硫酸根基团的大尺寸和负电荷，这有利于它们被酶识别。例如，PcCgkA(一种来自GH 16的κ-卡拉胶酶)通过−1亚位点的两个严格保守的精氨酸(R196和R260)与D-半乳糖4-硫酸酯单位的硫酸酯基团结合。这两个残基的突变将导致活性丧失。在Fun 168 A的-2 ~+3亚位点上与底物相互作用的残基中，76.9%的残基参与了对硫酸根基团的识别，表明Fun 168 A也主要通过与硫酸根基团的相互作用来识别底物。应注意的是，硫酸基的空间定位取决于糖苷键类型和硫酸基沿着糖链的分布模式。这两个特征共同决定了硫酸化脱氧半乳聚糖的结构。因此，对硫酸化脱氧半乳聚糖结构的特异性识别可以通过与硫酸基团的相互作用来实现。此外，值得注意的是，GH 168成员的底物结合口袋由8个柔性环组成。这表明GH 168家族内可能存在多种特异性，我们的研究小组目前正在研究这一点。本研究首次报道了内切-1，3-岩藻多糖酶Fun 168 A的晶体结构，并与四糖产物形成复合物。Fun 168 A的催化结构域具有典型的(β/α)8 TIM桶形折叠和反平行β折叠。残基D206充当亲核试剂，E264充当一般酸/碱。为了识别硫酸化岩藻多糖，Fun 168 A战略性地将一系列极性残基定位在-2至+3的亚位点上，并主要通过盐桥和氢键与硫酸根基团相互作用。-1和+1子位点分别严格识别F2 S和F0 S。此外，-2亚位点识别F2 S或F2，4S。+2亚位点识别F0 S或F2，4S。本研究为深入了解内切-1，3-岩藻多糖酶的底物识别机制提供了理论依据，为岩藻多糖硫酸酯的研究和开发提供了有力的工具。
原文：Structural investigation of Fun168A unraveling the recognition mechanism of endo-1,3-fucanase towards sulfated fucanDOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.132622
