2024 年2 月 15 日，来自中国海洋大学的Yimiao Chen等人在Carbohydrate Polymers上发表了一篇题为Catalytic properties characterization and degradation mode elucidation of a polyG-specific alginate lyase OUC-FaAly7的研究性论文。

褐藻胶主要存在于褐藻细胞壁中，由(1→4)糖苷键连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)组成。这两种单体通过随机排列组合，最终形成polyM、polyG、polyM/G或polyG/M三个结构单元，组成无支链褐藻胶。褐藻胶凭借其丰富的物理性质，在食品、药品、化妆品等领域被用作增稠剂、凝胶剂和稳定剂。然而，由于褐藻胶的高粘度和低吸收率，它在扩大应用方面还存在一些问题。

近年来的研究表明，褐藻胶裂解酶降解衍生的褐藻胶寡糖（AOSs）具有更明显的生理活性，如抗炎、抗氧化、抗菌性能。同时，这些生物活性还受到分子量(MW)、非还原端结构(饱和或不饱和)、单体分布和AOSs的M/G比的影响。因此，制备具有可控结构的AOSs对探索其结构与活性的关系，进一步扩大其应用范围具有重要意义。最近，一些研究者报道富含M的褐藻胶寡糖具有多种显著的营养功能，如抗肿瘤，抗凝血，血糖和血脂的调节。因此，制备高M含量的AOSs是进一步提高藻酸盐衍生物价值的一种很有前途的方法。

目前，主要有物理、化学和酶解三种方法来降解褐藻胶并生产AOSs。HCl和H2O2是化学方法中最常用的化学试剂。然而，化学方法也存在一些问题，如纯化工艺复杂和污染环境。物理方法如紫外、γ辐射、微波、亚临界水水解等也可以实现褐藻胶的降解，但物理方法得到的产物往往分子量较大，通常与化学方法相结合。然而，无论是化学方法还是物理方法都无法可控地制备高M含量的AOSs。褐藻胶裂解酶是褐藻胶降解和综合利用的关键酶。该酶通过β-消除机制催化(1→4)糖苷键的裂解，产生在非还原端具有不饱和糖醛酸残基的典型产物。酶法以其反应条件温和、环境友好等特点，在AOSs制备中越来越受到人们的关注。

因此，大量的褐藻胶裂解酶已经被克隆、表达和表征。例如，根据其底物特异性，褐藻胶裂解酶可分为polyG特异性、polyM特异性和polyMG/polyGM特异性。PolyG特异性褐藻胶裂解酶不破坏M与M之间的糖苷键，而是破坏G与G之间的糖苷键，这可能有助于AOSs中M与M之间糖苷键含量的增加。特别是，由于M和M之间的糖苷键的保留，它将增加特定AOSs产物中的M含量。因此，polyG特异性褐藻胶裂解酶，特别是严格的polyG特异性褐藻胶裂解酶是提高AOSs中M含量的候选工具。到目前为止，已经发现和表征了接近20种内切型polyG特异性褐藻胶裂解酶，而根据最新的综述，对具有较低polyM降解活性（接近0）的严格polyG特异性褐藻胶裂解酶的研究相对较少。例如，来自Flammeovirga sp.菌株MY04的Aly1是典型的polyG特异性褐藻胶裂解酶，其polyM降解活性达到122.0U/mg。AlyPB1是一种严格的polyG特异性褐藻胶裂解酶，因为它的polyM降解活性<1.0U/mg。但其温度适应性有待进一步提高。此外，严格的polyG特异性褐藻胶裂解酶的降解过程还有待于进一步研究。在这项研究中，从海洋细菌Formosa agariphila KMM 3901中克隆了一种新的、严格的polyG特异性褐藻胶裂解酶OUC-FaAly7。随后，对异源表达的OUC-FaAly7的酶学性质和降解模式进行了全面研究和阐明，为通过酶法制备富含M的AOSs奠定了基础。

1.基因和蛋白质序列

OUC-FaAly7基因包括1752个核苷酸，编码583个氨基酸残基的蛋白质，预测的蛋白质理论相对分子质量为66.4 kDa。推测的OUC-FaAly7在N末端有一个由27个氨基酸组成的信号肽(图1A)。此外，OUC-FaAly7含有三个功能结构域，包括alginate_lyase2结构域(Gln40-His273)、细菌Ig样结构域(2组)(Gly280-Val355)和盘状结构域(Pro371-Phe493)(图1A)。Discoidin结构域与Aly5从Ile188到Val305的非催化区域一致。结果表明，Aly5非催化区的缺失会降低其活性和稳定性，但不会改变其M/G偏好。而Aly5截断后的高分子量AOSs组分显著增加。同时，Aly5的非催化区缺失改变了其最小可识别底物。因此，OUC-FaAly7中盘状结构域的存在也可能影响其产物比例和最小底物识别能力。因此，通过截断OUC-FaAly7中的盘状结构域可能获得不同组成的产物。

图 1.polyG-特异性褐藻胶裂解酶OUC-FaAly7的序列分析。(a) OUC-FaAly7的结构域示意图。(b) FaAly7（red star）和其它PL7褐藻胶裂解酶的系统发育分析。

根据系统发育分析(图1b)，OUC-FaAly7属于PL家族7_3亚家族，与来自Persicobacter sp.CCB-QB2的褐藻胶裂解酶AlyQ(WP_053404615.1)的序列一致性最高(42.77%)。基于序列比对和保守结构域分析发现，OUC-FaAly7包含PL7褐藻胶裂解酶的三个典型保守区域，如(R/E)(S/T/N)EL、Q(I/V)H和YFKAG(V/I)YNQ(图2)，这与其他已鉴定的PL7褐藻胶裂解酶，如AlyVI、AlyPI和AlgL的保守区域一致。其中，保守区Q（I/V）H通常与底物特异性有关，QVH的存在通常表明该酶是polyM特异性的褐藻胶裂解酶，而QIH的存在通常意味着该酶是polyG特异性或polyMG特异性的褐藻胶裂解酶。因此，它表明OUC-FaAly7是一种polyG特异性或polyMG特异性褐藻胶裂解酶。同时，对应的关键残基包括Arg53、Gln97、His99和Tyr204位于保守区域。

图 2.OUC-FaAly7(紫色三角形)和其他PL7褐藻胶裂解酶的多序列比对。显示高序列相似性的区域被框起来。蓝框代表保守区(R/E)(S/T/N)EL、Q(I/V)H和YFKAG(V/I)YNQ。

2.重组OUC-FaAly7的纯化

在E. coli BL21(DE3)中成功表达了不含信号肽的OUC-FaAly7，并提取纯化了胞内重组蛋白。SDS-PAGE结果中的最终单带显示纯化的OUC-FaAly7的表观分子量约为61.4 kDa(图3a)，与理论分子量一致。纯化的OUC-FaAly7对褐藻胶的比活性为44.7±0.3U/mg(2743.7±20.3U/μmol)，纯化倍数为11.0倍，回收率为24.1%（表1）。OUC-FaAly7降解褐藻胶的活性高于多糖裂解酶家族7衍生的褐藻胶裂解酶PA1167(27.4U/mg)、AlyM(8.7U/mg)和AlyH1(2.81U/mg)，而低于褐藻胶裂解酶A1-I(73.1U/mg)，Aly5(620.0U/mg)和Aly08(841.1U/mg)。然而褐藻胶裂解酶活性的定义方法多种多样，这导致不同褐藻胶裂解酶的活性差异很大。其中，AlyM的活性定义与OUC-FaAly7一致。

图 3.OUC-FaAly7的纯化和生化表征。(a)纯化OUC-FaAly7的SDS-PAGE测定。泳道M：蛋白Marker。泳道1：OUC-FaAly7粗酶。泳道2：纯化OUC-FaAly7。(b)不同温度下OUC-FaAly7降解褐藻胶的相对活性。最适温度下的相对活性为100%。(c)在不同温度下保存不同时间的OUC-FaAly7褐藻胶降解活性。初始时间(0h)的相对活性为100%。(d)不同pH值下OUC-FaAly7降解褐藻胶的相对活性。最佳pH下的相对活性为100%。(e)在不同pH值下保存不同时间的OUC-FaAly7褐藻胶降解活性。初始时间(0 h)的相对活性为100%。(f)不同离子和化学物质孵育的OUC-FaAly7降解褐藻胶的相对活性。

表1.OUC-FaAly7的纯化分析

3.生化特征

进一步研究了OUC-FaAly7对褐藻胶的酶促性能。25℃、30℃、35℃、40℃时，OUC-FaAly7酶活性非常接近。40℃时，酶活性略高于其他温度(图3b)。同时，褐藻胶在40℃时的溶解度理论上较好。综上所述，最适温度为40℃。一般来说，表征的褐藻胶裂解酶的最适温度范围为30℃至50℃，极少数嗜热性褐藻胶裂解酶具有较高的反应温度，如褐藻胶裂解酶NitAly(70℃)，PsAly(65℃)，AlyRm3(75℃)和AlyRm4(81℃)。与大多数褐藻胶裂解酶一样，OUC-FaAly7具有温和的最适反应温度，其在20℃~40℃之间的相对活性达到最大活性的90%以上。这表明OUC-FaAly7可以在很宽的温度范围内降解褐藻胶。分别在4℃、20℃和30℃保存84h后，OUC-FaAly7保留的褐藻胶降解活性高于初始活性的75%(图3c)，表明其在室温下具有良好的温度稳定性。此外，在40℃下保存12h和48h时，其褐藻胶降解活性分别下降到80%和35%(图3c)。可以得出结论，已经发现并表征了近20种内切型polyG特异性或polyG偏好的褐藻胶裂解酶，相比之下，OUC-FaAly7具有显著的温度稳定性。例如，在40℃下孵育1h，Cellulophaga sp. SY116和褐藻胶中克隆的褐藻胶裂解酶oalC6和来自Thalassomonas sp.LD5的裂解酶TsAly6A分别保持了55%和29%的活性。类似地，在来自Flammeovirga的褐藻胶裂解酶Aly5之后，来源于Furnissii sp. MY04和AlyH1在40℃下分别保存2h和0.5h，最高残留相对活性为80%。以上结果表明，OUC-FaAly7具有良好的温度稳定性和储存稳定性，在一定程度上克服了褐藻胶裂解酶工业化应用温度稳定性差的瓶颈。

OUC-FaAly7在pH为6.0时(磷酸盐缓冲液)降解褐藻胶的活性最高，在pH为5.0-8.0时相对活性>40%(图3d)。然而，当它在强酸和强碱环境下反应时，其相对酶活性较低(图3)。OUC-FaAly7的最适反应pH值与来自Nitratiruptor sp. SB155-2的NitAly、来自Flammeovirga sp. MY04的Aly1和来自Aplysia kurodai的AkAly30等褐藻胶裂解酶相同。大多数报道的褐藻胶裂解酶的最适反应pH值在6.0~8.0之间。纯化后的OUC-FaAly7在pH5.0-8.0下孵育72h，其残留活性超过80%(图3e)。Vibrio. sp.W13褐藻胶裂解酶Alg7A在pH6.0–10.0条件下孵育24小时时可保持50%的活性。在pH6.0-10.0的缓冲液中储存12小时的褐藻胶裂解酶AlgH仍具有70%的活性。重要的是，对于polyG-特异性褐藻胶裂解酶，具有良好pH稳定性的酶，例如AlyH1和TsAly6A，当它们在pH6.6-9.0的条件下孵育12小时，可以保留80%的活性。因此，OUC-FaAly7在所表征的polyG特异性褐藻胶裂解酶中具有良好的pH稳定性。

金属离子和化学试剂的纯化对OUC-FaAly7活性的影响如图3f所示。可以观察到，Fe3+、Cu2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+和Na2EDTA对OUC-FaAly7有明显的抑制作用，而高浓度SDS对OUC-FaAly7有负效应。而Mg2+和Na+均能促进OUC-FaAly7降解褐藻胶的活性。特别是随着浓度的增加，对酶活性的促进作用先增加后降低(图4a和b)。但Na+和Mg2+对OUC-FaAly相对活性的最大促进作用所对应的浓度不同(图4a和b)。8mM Na+和2mM Mg2+促进其相对活性分别高达214.4±7.1%和187.4±5.8%(图4a和b)。因此，Mg2+和Na+均能明显促进OUC-FaAly7的活性，但其最适浓度略有差异，这可能与F. agariphila KMM 3901的咸化海洋环境有关。

图 4.Na+(a)和Mg2+(b)对OUC-FaAly7活性随离子浓度增加的影响。

4.底物特异性和动力学参数

为了说明OUC-FaAly7的底物特异性，在其最适反应条件下分别研究了其对polyG和polyM的特异性活性。其polyG降解活性为128.9±1.2U/mg（8560.2±76.7U/μmol)(表2)，而当活性测定条件与对褐藻胶和polyG的活性测定条件一致时，其对polyM的比活性在10min反应内几乎为0。这表明OUC-FaAly7具有严格的底物特异性，其对polyG的相对活性高达对褐藻胶的312%(表2)。其对褐藻胶的表观Km、Vmax和kcat分别为68.3±1.1mg/mL、2.9±0.2μmol/mg/min和138.5±6.6s−1(表2)。而OUC-FaAly7对polyG的表观参数分别为36.1±0.7mg/mL、4.3±0.4μmol/mg/min和207.7±8.5s−1(表2)，表明OUC-FaAly7对polyG具有更好的亲和力和更高的催化效率。同时，利用1h NMR对褐藻胶衍生产物的结构性质进行了表征。4.70-4.75ppm的强信号表明，产品的还原端为G。结果表明，OUC-FaAly7可以裂解G-G或G-M之间的糖苷键，并与G产生还原端，因此，OUC-FaAly7符合G特异性。实际上，到目前为止，已经发现、表达和表征了一些特定底物的褐藻胶裂解酶。绝大多数是多聚特异性褐藻胶裂解酶，如AlgL，KS-408-2和NitAly。然而，对polyG具有严格特异性的褐藻胶裂解酶的报道相对较少。一些报道的polyG特异性褐藻胶裂解酶也对polyM具有活性，如AlyA5和AlyPB1。综上所述，OUC-FaAly7是一种新型的polyG-特异性褐藻胶裂解酶。

表2.褐藻胶裂解酶OUC-FaAly7的活性特性

图 5.分子对接示意图。(a)催化腔中G4的分布。(b)M4在催化腔中的分布。(c)OUC-FaAly7中催化酸/碱与G4中作用位点之间的相互作用和距离。(d)OUC-FaAly7中催化酸/碱与M4中作用位点之间的相互作用和距离。

图 6.降解过程和最终产物分析。（a）HPLC分析OUC-FaAly7对褐藻胶的降解过程。（b）HPLC分析OUC-FaAly7对polyG降解的过程。（c）HPLC分析OUC-FaAly7对polyM降解的过程。（d）ESI-MS分析OUC-FaAly7降解褐藻胶的最终产物。（e）ESI-MS分析OUC-FaAly7降解polyG的最终产物。（f）ESI-MS分析OUC-FaAly7降解polyM的最终产物。

图 7.OUC-FaAly7对古洛糖醛酸寡糖(40℃)的产物分析及其推测的作用模式。(a)OUC-FaAly7降解产物G2和G3的HPLC分析。(b)OUC-FaAly7对G4降解过程的HPLC分析。(c)OUC-FaAly7对G5降解过程的HPLC分析。(d)HPLC分析OUC-FaAly7对G6的降解过程。(e)HPLC分析OUC-FaAly7对G7的降解过程。(f)OUC-FaAly7对(饱和)古洛糖醛酸寡糖的作用模式。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.121929