《IJBM》利用定点诱变和高分辨率蛋白质晶体学研究揭示地衣芽孢杆菌 GH5 甘露聚糖酶的生化和结构特征

2024年6月，巴西的Lorenzo Briganti等人在International Journal of Biological Macromolecules上发表了一篇题为Unravelling biochemical and structural features of Bacillus licheniformis GH5 mannanase using site-directed mutagenesis and high-resolution protein crystallography studies的研究论文。

甘露聚糖对植物发育至关重要，天然存在于种子、坚果和豆类中，例如Phytelephas macrocarpa（象牙坚果）和Coffea arabica（咖啡）等。此外，甘露聚糖是植物、真菌和海藻细胞壁的重要结构成分。所有甘露聚糖都以D-甘露吡喃糖苷为基本分子单元，但已描述了多种甘露聚糖分子结构。植物生物质中发现的甘露聚糖主要有四种类型：(i)线性甘露聚糖，由通过β-1,4键连接的D-甘露糖单元构成；(ii)半乳甘露聚糖，其主链与线性甘露聚糖相似，但在O-6位有半乳糖取代；（iii）葡甘露聚糖，其主链由β-1,4连接的D-甘露糖和D-葡萄糖单元组成；（iv）半乳葡甘露聚糖，其主链由葡甘露聚糖和半乳糖修饰组成。最近，在双子叶植物初生细胞壁中发现了一种新型的半乳葡甘露聚糖，称为β-半乳葡甘露聚糖（β-GGM），其结构特征与木葡聚糖相似。

半乳甘露聚糖中的甘露糖与半乳糖的比例决定了其溶解度和粘度。装饰的基团越多，半乳甘露聚糖越易溶于水，粘度也越大。由于这种特性，半乳甘露聚糖（通常称为胶质）在食品工业中被广泛用作增稠剂和稳定剂，可用于冰淇淋、牙膏和巧克力中。两种增稠剂的例子是瓜尔胶和刺槐豆胶，其中甘露糖与半乳糖的比例分别为2:1和4:1。由于甘露聚糖在食品中的应用，人们正在研究将甘露聚糖酶用作抗污剂，因为它们能够降解食品污渍中的甘露聚糖，从而促进清洗过程。事实上，有几项研究表明甘露聚糖酶可以提高洗涤效果，因此甘露聚糖酶已被添加于多种洗衣和洗碗剂中。

糖基水解酶(GHs,E.C.3.2.1.x)是已知能够选择性水解寡糖和多糖糖苷键的酶。一类重要的GH是甘露聚糖酶，也称为内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)，其通过随机水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的(1→4)-β-D-甘露糖苷键起作用。甘露聚糖酶分为四个不同的GH家族：GH5、GH26、GH113和GH134。虽然GH26、GH113和GH134主要含有甘露聚糖酶，但GH5家族更加多样化，包括表现出许多其他活性的成员。因此，该家族最近被划分为56个亚家族，具有广泛的序列多样性。

地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，天然存在于土壤、海水以及植物和食品工业残留物中。由于该生物的亚种已从各种环境中分离出来，这些细菌中的几种酶表现出很高的耐热性，而其他酶在碱性条件下高度活跃。这种特性对于生物技术行业来说是理想的，因为该行业通常采用需要在恶劣条件下操作的工艺。因此，地衣芽孢杆菌在工业上被广泛用作有价值的酶的来源。

在这里，我们描述了地衣芽孢杆菌GH5亚家族7甘露聚糖酶BlMan5_7的生化、酶学和结构特性，以及其近乎原子分辨率的定点诱变。我们还利用酶的晶体学结构来解释酶的裂解曲线。此外，我们评估了这种酶作为以甘露聚糖为基础的污渍去除为重点的生物技术应用工具的潜力。

1.BlMan5_7的纯化与鉴定

为了纯化重组蛋白，首先使用Ni-NTA树脂对阳性转化子培养液中的可溶性部分进行亲和层析，然后进行TEV蛋白酶孵育。经过尺寸排阻色谱步骤后，蛋白质产量估计为每升培养物30毫克。该蛋白质的实验分子量估计约为42kDa，与根据其氨基酸序列计算出的蛋白质质量（MW=42.3kDa）非常接近。

2.BlMan5_7生化表征

在所测定的五种甘露聚糖底物中，纯化的酶对角豆半乳甘露聚糖表现出最高的特异性（图1A）。BlMan5_7活性的最适pH值和温度分别为6.0-7.0和70℃（图1B和C）。

BlMan5_7的pH值表明其接近中性，在pH值5.0–8.0范围内保留了约70%的最大活性。该数据与先前关于细菌甘露聚糖酶的发现一致。例如，来自芽孢杆菌SM-1.4的甘露聚糖酶在pH7.0时表现出最佳活性，并在pH6.0至9.0范围内保持稳定。来自GH5_8家族的动物双歧杆菌乳亚种Bl-04甘露聚糖酶在pH6.0时活性最高，在pH5至7之间可保留其最大活性的约75%。一般而言，大多数细菌甘露聚糖酶的最适pH值在中性pH范围内，而真菌甘露聚糖酶通常在酸性pH下活性最佳。

BlMan5_7酶水解的最佳温度为70℃（图1C），高于来自黑曲霉CBS 513.88（45℃）和Cellulosimicrobium sp.菌株HY-13（50℃）的β-甘露聚糖酶的最佳温度，与嗜极芽孢杆菌KW1和真菌木霉UKM1酶（70℃）的最佳温度相似。大多数研究的内切β-甘露聚糖酶在40至65℃的温度范围内具有最大活性。因此，BlMan5_7的高最适温度与较宽的pH活性范围相结合，使该酶在生物技术和工业应用中具有潜在的吸引力，因为这些应用可能涉及苛刻的工艺条件。例如，清洗过程经常需要使用碱性洗涤剂和高温。

盐和还原剂（DTT、β-巯基乙醇和TCEP）的存在影响了BlMan5_7酶活性（图1D）。一般来说，1mM二价离子的存在比单价离子的存在更能提高酶活性。在钴离子存在下可获得最高活性（与没有添加剂时的活性相比高出1.64倍）。此外，还发现浓度为1mM的还原剂（尤其是DTT）可增强酶活性（图1D）。一般而言，浓度为5mM时，添加剂的存在会导致活性低于浓度为1mM时。对于MnCl2、CdCl2、MgCl2和ZnSO4，5mM时观察到酶活性的抑制，而1mM时测量到酶活性的增加。在研究的两种浓度下，添加CuSO4都会降低酶活性，而添加CoCl2和FeSO4则会在1mM和5mM时增加酶活性（图1D）。Kim及其同事在表征Cellulosimicrobium sp.菌株HY-13的GH5甘露聚糖酶时观察到了后两种化合物的类似效果。

据报道，还原剂可以激活Cellulosimicrobium sp.菌株HY-13和Bispora antennata CBS 126.38的内切β-甘露聚糖酶，并且对某些二价金属离子的亲和力在热稳定性中起重要作用。重要的是，先前的一项研究表明，嗜热链霉菌和嗜热裂孢菌内切-β-甘露聚糖酶均具有二价离子结合位点。

此外，我们的研究结果表明，对于BlMan5_7，二硫键对于催化活性可能很重要。由于DTT的存在对BlMan5_7的酶活性有影响，我们决定分析其半胱氨酸残基对BlMan5_7寡聚状态的可能影响，其氨基酸序列显示其一级结构中有两个半胱氨酸残基。

3.天然电泳分析和BlMan5_7构建体

鉴于DTT试剂对BlMan5_7酶活性的影响以及蛋白质氨基酸序列中存在两个半胱氨酸残基，采用PhastSystem设备(GE，美国波士顿)进行非变性电泳实验。野生型酶在天然凝胶电泳中迁移成两条带，表明二聚体和单体的混合物（图2A）。添加DTT导致酶的单体形式显著增加（图2A），表明观察到的二聚化可能是由分子间二硫键形成引起的。为了制备均质蛋白质样品并了解二硫键形成对酶寡聚状态的影响，我们对BlMan5_7进行了定点诱变。产生了两个突变体，BlMan5_7 C295S和BlMan5_7 C391S，每个突变体都有一个独特的Cys残基被Ser取代。这些突变体的表达和纯化遵循与生产野生型酶相同的方案。天然电泳显示，BlMan5_7 C391S突变体迁移为具有单体酶分子量的单一条带，而BlMan5_7 C295S显示单体和二聚体的混合物（图2B）。该实验表明，Cys391残基是造成分子间S-S键形成二聚体的原因（图2B）。

4.热位移测定

考虑到CBM1和CBM4在QCM-D纤维素膜上的吸附行为相似，后续实验中不再讨论CBM1。接下来，我们决定使用ThermoFluor实验比较野生型酶和BlMan5_7 C391S突变体在pH范围和不同缓冲液中的热稳定性。它们在所有测试条件下都表现出非常相似的熔化温度(Tm)，在宽pH范围（pH5.0和8.5之间）具有高热稳定性(Tm为68至71℃)。300 mM NaCl的存在会稍微降低熔化温度。在更极端的条件下（pH值低于4.0和高于9.5），熔化温度明显降低，表明蛋白质稳定性丧失。同样，野生型和突变型酶的行为非常相似。

5.BlMan5_7酶及其C391S突变体的生化测定和动力学参数

BlMan5_7 C391S突变体的生化参数按照野生型酶的描述进行测定，结果显示底物特异性、pH值或温度曲线无显著差异。此外，还观察到了BlMan5_7 C391S突变体的类似比活性（表1）。因此，我们可以得出结论，C391S点突变不会显著影响酶的生化特性，同时阻止分子间二硫键的形成。

在最佳pH和温度条件（pH7.0、70℃）、无添加剂和存在Co+2的情况下，对BlMan5_7和BlMan5_7 C391S突变体进行了动力学测定。BlMan5_7和BlMan5_7 C391S的动力学参数值如表1所示。Co2+的存在显著增加了野生型和突变型酶的kcat值，表明配体结合对酶促反应速率的潜在影响。表2比较了BlMan5_7的生化特性与其他生物技术相关的甘露聚糖酶。

6.水解产物概况

为了鉴定BlMan5_7和BlMan5_7C391S酶水解半乳甘露聚糖和甘露寡糖所释放的产物，以甘露三糖（M3）、甘露四糖（M4）、甘露五糖（M5）、甘露六糖（M6）和角豆半乳甘露聚糖为底物，用HPAECPAD分析了产物谱（图3）。反应2分钟和30分钟后收集样品。

对于所有底物，实验确定的BlMan5_7及其C391S突变体的产品特性几乎相同（图3）。两种酶均能有效水解M5、M6和角豆半乳甘露聚糖，而与M3孵育后未观察到任何产物，使用M4作为底物时只能检测到微量的产物。

M5水解主要生成M2和M3，而M6水解既转化为M3，又转化为M2+M4。此前，来自鹅掌孢荚壳菌的GH5内切甘露聚糖酶也具有类似的产物特性。

该酶没有表现出任何转糖基活性的迹象（图3）。

与进行30分钟孵育时间的其他反应产物相比，M1保留时间处的峰强度低得多，表明甘露糖在BlMan5_7中的释放较差。此外，M4无法水解的事实表明BlMan5_7需要至少五个活性位点被占据，就像GH5甘露聚糖酶通常观察到的那样。通过分子动力学模拟进一步研究了亚位点亲和力，将在第2.7.4节中讨论。

与这些结果一致，角豆半乳甘露聚糖水解主要产生M2、M3和M4，而无法检测到甘露糖（图3E）。此外，在较长的保留时间下检测到了未识别的峰，表明存在无法裂解的修饰高DP MOS，至少在我们实验中使用的反应时间内是这样。

7.BlMan5_7 C391S的晶体结构测定与分析

为了了解BlMan5_7与裂解模式的结构-功能关系，进行了X射线晶体学和分子动力学（MD）计算实验。

7.1.分子置换、细化、模型建立以及与同源结构的比较

使用来自Thermotoga petrophila RKU-1（TpMan，PDB编号3PZ9_A）的GH5内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶作为模板，通过BALBES进行分子置换。使用PHENIX-refine精炼结构，并使用Autobuild放置缺失的侧链。这导致R-free和R-work均下降，并使用Coot和PHENIX执行进一步的模型构建和细化循环。使用MolProbity评估最终结构。收集和细化参数均在补充表2中给出。BlMan5_7C391S的结构已存入蛋白质数据库，PDB代码为8GF3。

BlMan5_7 C391S晶体结构在不对称单元中包含一个单体（图4A）。它具有典型的GH5结构，即TIM桶状折叠，由沿肽主链交替排列的八个α螺旋和八个平行的β链组成。

BlMan5_7 在两个催化残基Glu170和Glu278的帮助下，通过经典的Koshland保留机制进行底物水解。为了将BlMan5_7与GH5家族中的其他酶进行比较，将蛋白质序列提交给BLASTp，并从结果中选择了两个序列，一致性得分最高的序列（以及用于分子置换的模型）TpMan（PDB代码3PZ9）和活性位点中底物最长的序列StMan（PDB代码4Y7E）（补充表3）。

使用Clustal Omega将选定的酶序列与BlMan5_7 C391S氨基酸序列比对，并使用ESPript以图形方式显示BlMan5_7的二级结构元素（图4C）。由于与BlMan5_7相比，StMan的序列含有大量插入物，因此使用PyMOL（PyMOL分子图形系统，2.4.1版，Schrodinger,LLC）中的cealign命令对它们进行了对齐，结果在256个残基上的均方根偏差（RMSD）为4.41Å。

7.2.结构比较

如前所述，BlMan5_7遵循酶水解的保留机制，其中Glu170和Glu278作为两个催化残基。因此，分析活性位点通道中的残基与底物之间的相互作用变得非常重要。为此，我们使用Coot对TpMan（PDB代码3PZO）和BlMan5_7C391S进行了结构叠加，揭示了残基与底物之间的距离（图4D和E），从而推断出酶与底物之间可能存在的相互作用。

正如预期的那样，BlMan5_7的催化位点是保守的，但在亚位点-4中可以观察到几个重要的差异。BlMan5_7结构中的亚位点-4含有Gln64，Glu65，Asp316和Gln315残基，这些残基与TpMan结构中相应位置上的Asp84，Lys85，Ser359和Asp360不同。这些取代在侧链的长度和电荷上有所不同，从而影响子位点的化学环境。为了分析-4亚位点和活性位点的相互作用，将长底物甘露七糖(M7)对接到活性位点。

仔细检查电子密度，我们无法确定能表明BlMan5_7结构中存在二价离子的电子密度。此外，将BlMan5_7与其他在其沉积结构中含有二价离子的甘露聚糖酶进行结构比较，如本研究中用于比较的Streptomyces thermolilacinus酶（PDB代码：4Y7E），我们无法找到Glu286和Asp283残基以及来自loop7的Gly276和Pro284主链的结构等价物，而后者的结构中涉及钙离子结合。此外，使用金属结合位点验证服务器CheckMyMetal程序并没有得到确凿的结果。最后，最接近的结构同源物，来自Thermotoga petrophila RKU-1（PDB编号3PZ9_A）的GH5内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶不含金属离子，也没有任何已鉴定的金属结合位点。因此，不幸的是，BlMan5_7高分辨率结构没有提供任何证据表明该蛋白质中存在任何特定的金属结合位点。

7.3.M7与BlMan5_7 C391S活性位点的分子对接

为了研究BlMan5_7与配体的相互作用，利用GLYCAM碳水化合物构建器工具（https://glycam.org）构建了一个甘露七糖分子，其最小化能量为66.247kcal/mol。然后利用SwissDock程序对该分子进行对接，将配体引导至两个催化残基(Glu170和Glu278)的质心。这导致了对接结构的完整适应度为-1245.76 kcal/mol，估计的delta G为-10.98 kcal/mol（图5）。

通过 M7 在活性位点的正确定位，可以识别与每个亚位点相对应的所有残基，并研究酶和底物之间的相互作用（图5A至G）。该分析表明，与TpMan相比，BlMan5_7以不同的方式与-4亚位点的底物相互作用（图4E）。这可能是BlMan5_7产生M4的一个可能解释，因为只要-4子位点存在足够多的相互作用，M4就有可能通过-4与-1子位点进行无效结合。

7.4.分子动力学模拟

为了更好地理解BlMan5_7与配体的相互作用，进行了短分子动力学(MD)模拟来分析配体残基和相应亚位点之间所涉及的能量。计算出的相互作用能量绘制在图6A中。

毫不奇怪，子位点+2和-2已验证具有最高的相互作用能量。这种模式也出现在GH11木聚糖酶中，其中亚位点-2和+2表现出最高的结合能。这与酶产生M2作为主要产物的事实一致。事实上，根据计算出的能量分布，M4和M5将优先占据子位点（图6B）。然而，我们的分析表明，在子位点-4中酶和底物之间也存在强的相互作用，这种相互作用比子位点-3和+3中的更强。这与图3B中所示的产物概况一致，其中M4不能有效水解，表明M4可以形成非生产性相互作用，例如占据子位点-4至-1。此外，其他可能性也可能导致M4的形成，如图6B所示，这与从进行生化分析获得的实验证据相证实。

8.小角X射线散射(SAXS)分析

进行了SAXS实验以确定溶液中野生型BlMan5_7的四级结构。该酶主要是单体；不过，在SEC分析中观察到了相当一部分二聚体（补充图S3），这与我们的非变性凝胶实验（图2）一致。在还原条件下，二聚体部分大部分解离成单体，在没有DTT的情况下回转半径(Rg)为25.7Å，在存在DTT的情况下回转半径(Rg)为20.6Å（补充表1）。这表明蛋白质接触在还原剂的作用下发生了结构重排。使用SEC-SAXS测量分离二聚体和单体部分，并成功获得它们的散射强度（图7A）。单体的对距分布函数具有典型的形状良好的球状蛋白质形式，最大距离Dmax为64.6Å，Rg为20.7Å（图7B和补充表1）。此外，二聚体的P(r)是具有两个空间上分离良好的子域的蛋白质的特征，显示出两个特征峰。其Rg和Dmax分别为34Å和107Å（图7B和补充表1）。从SAXS批量模式获得的前向散射强度I(0)随着DTT的增加而保持明确的定义，其中单体的I(0)值比通过SEC-SAXS获得的二聚体的I(0)值小2倍。此外，根据实验散射强度计算出的单体分子量为38.7kDa，二聚体分子量为78.7kDa，差异值低于10%（补充表1）。

采用从头计算方法成功获得了BlMan5_7二聚体和单体的低分辨率模型。单体模型在空间上与BlMan5_7C391S的晶体结构一致（图7C），二聚体结构具有与两个单体分子的组装最一致的预期形状（图7D）。使用AlphaFold2和ColabFold预测的BlMan5_7的晶体结构和精确二聚体模型与BlMan5_7的低分辨率SAXS分子包膜叠加，分别用χ2值0.7和0.8进行拟合（图7A和补充表1）。酶的预测四级结构表明Cys391残基位于二聚体界面，彼此非常接近（补充图S4）。SAXS分析证实的单体/二聚体混合物可能解释了结晶天然BlMan5_7的难度。虽然分子间二硫键不会对BlMan5_7的活性造成不利影响，但它会导致样品的多分散性，从而阻碍BlMan5_7结晶，我们尝试使用几种商业结晶试剂盒来实现这一点，涵盖了多种不同的条件。

图7.BlMan5_7的SEC–SAXS分析。(A)将野生型BlMan5_7单体（深青色散射圆）和二聚体（深绿色散射圆）的实验散射曲线与单体（红线，χ2=0.7）和二聚体（鲑鱼色线，χ2=0.9）的理论散射曲线进行了比较。基于AlphaFold2预测的结构，BlMan5_7 C391S的单体晶体结构（黄线，χ2=1.3），以及恢复的BlMan5_7模型的低分辨率结构（单体：红线，χ2=0.7；二聚体：浅青色线，χ2=0.8）。(B)根据单体（青色线）、二聚体（绿线）和混合物（浅红色线）的实验散射数据确定的P(r)函数。(C)BlMan5_7的单体和(D)二聚体从头算模型（显示为透明球体）分别叠加到预测的AlphaFold2衍生结构（显示为卡通和从N端到C端呈彩虹色）上。

9.BlMan5_7在去污中的生物技术应用

食品工业中使用多种胶作为增稠剂，因此，巧克力、冰淇淋和番茄酱等工业化食品在布料上留下的食物污渍很可能含有甘露聚糖。在此背景下，我们着手研究BlMan5_7是否可以充当抗污剂，增强衣物洗涤过程中甘露聚糖污渍的去除效果。

将沾有刺槐豆胶和结晶紫(CV)混合物的布片分别用水、洗涤剂和酶进行清洗(图8A)。尽管经过所有这些处理后颜色强度似乎都降低了，但酶和洗涤剂的作用不同，因为在用洗涤剂处理的样品中污渍的边界仍然清晰可见，而在用酶处理的样品中观察到污渍分散和回染。当使用ImageJ软件检查图像时，可以确认从图8A收集的视觉印象。补充图S5显示了图8A中图片的颜色强度分析的结果，进一步证实了酶在降低污渍颜色强度方面的效率。这表明洗涤剂去除了CV染料，降低了其颜色强度，但并没有去除半乳甘露聚糖。另一方面，酶降解了半乳甘露聚糖，将一部分CV染料分散到洗涤液中，但并没有防止回染。因此，颜色强度会大大降低，污点边界也会模糊不清。

证实的是，当在相同条件下清洗仅用CV（不添加半乳甘露聚糖）染色的样品时，用水和用酶清洗的结果非常相似，而洗涤剂在视觉上降低了污渍的强度（补充图S6）。文献中还报道了其他甘露聚糖酶的类似应用，如肺炎克雷伯氏菌的碱和恒温甘露聚糖酶，以及长叶毛霉RS1的甘露聚糖酶。

为了更深入地了解潜在过程的分子过程，我们使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析了样本，这有助于进一步了解不同清洗策略的影响。在图8B的CLSM图像中，红色颜料表示结晶紫的存在，而布纤维则呈现蓝色。重现宏观感知，与用洗涤剂或酶清洗的样品相比，仅用水清洗的样品保留了最高量的结晶紫。这里很明显地看出，用酶清洗的样品比用洗涤剂清洗的样品保留的CV染料少，并且酶清洗样品中剩余的染料实际上与布纤维结合，这可能是回染的结果。

对污渍的不同作用方式使我们假设酶和洗涤剂的联合处理可以产生更好的整体洗涤效果。为了测试这一点，我们进行了酶和洗涤剂的共同处理，并定量评估了洗涤性能，使用紫外可见光谱法测量了布片的反射光谱。图8C显示，仅用酶和用酶+洗涤剂处理后的样品的反射光谱产生了相似的结果，并且最接近干净布的光谱。仅使用洗涤剂的处理效果明显差于前两种处理方法，但优于使用水的处理方法，后者的光谱与未经处理的布料的光谱几乎相同。

综上所述，我们的结果表明，尽管洗涤剂降低了CV染料的颜色强度，但不能完全去除CV污渍，但可以防止回染。甘露聚糖酶处理作用于半乳甘露聚糖水解成寡糖，对菌株的颜色有非常强烈的影响，但不能防止回染。实际上，一些甘露寡糖和CV染料分子可能已经渗透到布纤维中并与它们结合。根据获得的图像和光谱数据，我们可以确认BlMan5_7确实是一种有效的防污剂，尤其是与洗涤剂溶液结合使用时，这得益于其广泛的pH范围。尽管其他研究已经证实了甘露聚糖酶在洗涤方面的潜在用途，但据我们所知，这是第一次应用微观技术来揭示洗涤过程的有效性。

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结论

DOI:https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.133182