《TCR》固定化酶生物催化剂设计中的化学修饰：缺点与机遇

2016年5月来自Universidad Industrial de Santander的Nazzoly Rueda等人在TCR发表了一篇题为Chemical Modification in the Design of Immobilized Enzyme Biocatalysts: Drawbacks and Opportunities的综述。

酶是一种生物催化剂，能够在生物体内执行多种多样的反应。在环境友好的条件下，它们表现出高活性、选择性和特异性。自然界提供了种类繁多、特征迥异的酶，它们可以催化大多数已知的有机化学反应。它们甚至可以催化与自然反应截然不同的体外反应，例如，许多研究人员将水解酶用作合成酶或转移酶。此外，还发现了一些所谓的杂化反应，在这些反应中，酶的催化活性与其自身功能完全无关；在某些情况下，甚至不涉及实际的活性中心（例如，水解酶用作氧化酶）。因此，酶有可能成为理想的绿色化学催化剂，能够在非常温和的条件下生产最复杂的化合物，并具有尽可能高的原子经济性。

然而，酶在工业中的成功率并没有预期的那么高。这是因为酶具有生物起源；它们是大自然经过数百万年的进化筛选出来的，以满足某些生理需求。因此，酶受到严格控制，以应对环境条件的变化，这种变化不会在工业反应器中发生，在工业反应器中，研究人员引入恒定浓度的定义明确的底物，目的是实现向定义明确的产品的完全转化。因此，酶的稳定性通常在几小时到几天之间，而在工业中，稳定性应以几个月（至少）来衡量。酶会受到酶所在代谢途径的中间产物（有时与起始底物结构关系不大的化合物）和/或产物的抑制，也会受到底物或反应中其他成分的抑制。大多数酶是水溶性的，这意味着酶的回收和再利用可能并不简单。目标酶将与许多其他酶一起产生；这可能会降低最终的体积活性，或者如果一些杂质酶识别底物或产物，可能会降低工艺的选择性或特异性。高特异性是指在工艺过程中，将底物换成非常相似的底物可能需要寻找另一种能识别新底物的新酶。高选择性意味着只能获得一种产品，但如果研究人员希望获得另一种产品，则在大多数情况下需要开发一种新的酶生物催化剂。酶的高活性是利用天然底物发现的，但有时有趣的化合物不同，观察到的活性就低得多。因此，即使酶具有巨大的潜力，但在工业中的影响仍然有限。

幸运的是，如今有许多不同的工具可以改善酶的特性。微生物学工具（如元基因组学）提供了大量新酶，其中一些来源不明，但具有新的有趣特征。基因工具定点诱变和定向进化大大改善了酶的特性，以解决特定问题（在特定介质中的稳定性或活性，相对于底物的活性）。因此，化学修饰或固定化等旧技术在制备工业生物催化剂方面显然已失去了意义。

然而，大多数酶需要以最终固定化的形式使用，以解决酶在水中的溶解问题。这意味着，固定化并非生物催化设计的额外步骤，而是必要步骤。在这一前提下，许多研究人员把重点放在将固定化与解决酶的其他限制结合起来。因此，如果根据特定的酶特征进行固定，就可以实现酶的纯化，有时还可以将固定和定向诱变结合起来。如果能产生多点、多亚基或有利的环境，固定化还可以提高酶的稳定性。虽然不那么容易预测，但也有一些相关的例子，固定化可能会提高酶对特定底物的活性，更有趣的是，由于酶构象的稳定性提高或变形，可能会提高酶的特异性或选择性。最近的研究表明，有些酶可能会因添加剂而变得稳定，但只是在按照特定方案进行固定后才会稳定，而相同酶的其他固定制剂在该试剂存在的情况下仍保持稳定。在许多情况下，这些结果并不容易解释，而且由于在确定固定化酶的结构方面存在的问题，对不赞成基因工具的解释是经验性的，但这并不排除在许多情况下，固定化可能带来令人印象深刻的稳定因素、酶的特异性反转等，重要的是，它与所有其他稳定化策略是兼容的。另一方面，化学修饰在确定某些基团在酶催化过程中的相关性方面应用已久。不过，化学修饰也被用于改善酶的特性，一些实例可在文献中找到。与基因修饰相比，化学修饰有两个主要问题：一是很难实现完全可控的修饰（除非与定点突变相结合），二是需要在每一批生物催化剂中进行。作为一个主要优点，可以说它是在已经折叠的酶中进行的，因此克服了修饰可能对蛋白质折叠产生的问题。此外，即使酶的结构未知，也能保证只修饰外部基团。此外，基团的类型并不局限于氨基酸；引入基团的性质和类型仅受研究人员想象力的限制。

使用游离酶时，由于酶与化学修饰剂难以分离，化学修饰可能难以控制；存在共价酶聚集（使用双功能试剂）或蛋白质表面性质变化导致蛋白质沉淀的风险。使用先前固定的酶可大大简化这一过程。如果酶不能再沉淀，则可通过改变载体的负载量和/或固定速率来控制共价蛋白质聚集的可能性。反应的控制更容易，反应速度更快；过滤足以停止反应。此外，在某些情况下，使用由不同因素稳定的固定化酶可以提供更耐化学修饰的酶，保持更高水平的活性。

在此，我们重点讨论化学修饰与固定化的耦合问题（对酶进行修饰以提高酶的固定性，或对固定化酶进行修饰以提高酶的特性）。这一主题在以前已有综述。在此，我们打算对这篇综述进行更新，并对固定化生物催化剂设计中化学修饰的。

1.酶的化学修饰的目的

对酶进行化学修饰以提高生物催化剂的最终性能所追求的目标可归纳为三大类：促进交联、全面改变酶表面的物理特征或修饰关键官能团。

1.1.促进交联

交联的第一个目的是通过促进蛋白质不同官能团之间的化学键来提高酶的稳定性。交联可以是分子内的、亚基间的（对于多聚酶或多酶系统），也可以是分子间的（例如，将其用作固定方法，如交联酶、交联酶晶体或交联酶聚集体（CLEAs），或先前固定的酶的交联层；图1）。

图1.促进蛋白质不同官能团之间的化学键：分子内、亚基间和分子间交联。

1.1.1.分子内的交联

在分子内交联的情况下，参与该反应的基团在暴露于任何使酶变形的条件（热、溶剂、促溶剂等）时应保持其相对位置（它们的相对流动性只是间隔臂的长度）。聚合物也可以包覆在酶表面，这涉及到蛋白质表面的大量基团，但由于它们的柔韧性，引入到蛋白质结构中的刚性可能并不十分显著。事实上，在某些情况下，修饰酶的最终稳定性低于未修饰酶。然而，聚合物可能会产生其他积极影响（例如，调整酶的微环境以促进失活化合物（如有机溶剂或过氧化氢）的分离），而不会产生严重的扩散限制（图2）。

图2.用聚合物涂覆酶表面以适应酶的微环境。

图3.交联剂的长度与促进酶表面的单点修饰或分子内交联的相关性。

1.1.2.亚基间交联

图4.通过亚基解离或未完全附着在固定载体上的固定化多聚酶的亚基释放使多聚酶失活。

如果酶的所有亚基都在一个平面上，那么使用载体作为交联剂可以解决亚基解离的问题；有一些策略可以强制固定涉及最大数量酶亚基的酶（图5）。如果酶不是平面的（如四面体），由于几何原因，这显然行不通。如果可以使用这种策略，进一步加强酶的共价多点连接可能会大大提高酶的整体稳定性。

图5.固定多亚基以解决酶解离问题。

目前还没有关于使用小型纳米颗粒的报道，但这种方法应该可行，因为它可能涉及整个酶结构，而与酶的几何结构无关（图6）。聚合物已被用于以物理或共价方式避免酶亚基解离；事实证明，它们的大尺寸对于稳定多聚酶非常有用，尽管它们可能不会导致酶的刚性化（图7）。醛葡聚糖能够稳定粗蛋白溶液中的任何多聚体结构。此外，用聚合物（醛葡聚糖、聚乙烯亚胺（PEI））处理的酶在与疏水作用（如气泡）的相互作用中也会得到稳定；这样，处理就会产生双重积极效果。

图6.通过在表面涂覆活性纳米颗粒稳定多聚酶。

图7.通过在多聚酶表面涂覆多功能聚合物稳定多聚酶。

小型双功能试剂要完全稳定多聚酶比通过交联稳定单体酶更加困难，因为基团在合适的距离上需要在不同的亚基上，并且每个酶亚基必须至少引入一个交联才能真正稳定整个多聚酶结构。不过，文献中也有一些成功的例子。

图8.获得低赖氨酸含量的CLEAs。

用交联剂处理吸附的蛋白质是通过吸附提高固定化酶稳定性的常用方法，因为它还能防止酶解吸。最典型的例子是用戊二醛处理吸附在带有伯氨基基团载体上的酶。标准方案涉及酶和载体的活化，可能同时产生分子内和分子间交联，以及酶和载体之间的反应。使用戊二醛活性载体的主要目的是使多个酶分子发生交联，从而使酶从载体中的解吸过程变得更加复杂（整个酶集合体需要同时从载体中释放出来）。要获得良好的效果，蛋白质分子必须足够接近，以便发生交联。使用聚合物可能很容易做到这一点。使用小试剂时，则需要将酶包装在一起，而这只有在固定化非常快，快到酶在固定化之前无法在支撑孔内扩散的情况下才能实现。使用辛基琼脂糖脂肪酶和戊二醛的研究清楚地表明，分子间的交联可以根据固定速度来控制；如果固定速度非常快，就会产生大量的聚集体，而如果固定速度很慢，共价聚集体的数量就会大大减少。

1.2.酶表面物理和化学性质的整体修饰

图9.通过对酶表面进行化学修饰，提高酶的性能。

在某些情况下，修饰只是为了改善酶的固定化，例如，增加活性基团的数量可增加酶-支持键的数量（图10），或改变阳离子或阴离子基团可允许在某些载体上进行离子交换。在其他例子中，全局化学修饰被用来获得与小型双功能试剂或载体更容易的交联，或引入一个可能比蛋白质上的天然基团更具反应性的基团，以进一步引入有趣的修饰，例如，用适体修饰蛋白质以提高抗体，同时也用第二个分子修饰酶表面。

图10.对酶表面进行化学修饰以改善酶的固定化。

要使酶表面的性质发生这种急剧变化，最简单的方法是使用聚合物，这些聚合物可以只吸附在酶表面，也可以共价连接。如果是物理吸附，聚合物不会影响酶的化学结构。它能够与酶建立许多相互作用，从而将酶牢固地固定在蛋白质表面，并使酶的整体物理特性发生巨大变化。这种聚合物可能会对酶链的运动造成一定的立体阻碍，例如，PEI被用来维持洗涤剂诱导的磷脂酶的开放形态。通常使用聚乙二醇进行化学修饰，使酶表面疏水，从而提高酶在有机介质中的溶解度，也可用于调整酶的特性。

小试剂的使用使酶的共价修饰成为必要，因为物理吸附力很弱，无法在操作条件下保持酶-化合物复合物。这就导致了酶的化学修饰，而且可能具有更高的复杂性，我们确实改变了酶表面的特性，并可能通过离子排斥改变许多离子桥。对修饰的控制可能会提高这种策略的调整可能性；不过，只有同质的修饰才会是完全的修饰或非修饰，如果酶具有一些特殊的活性基团（如酶可能天然具有的或可通过基因工程引入的氨基末端或独特的Cys），那么一点也可能是同质的。

1.3.酶表面关键基团的修饰

有些蛋白质可能具有与酶的稳定性、活性或选择性密切相关的关键基团。在某些情况下，对其中一些关键基团进行特定修饰可能会极大地影响酶的性能。使用标准方案，只有在特定基团的反应性远高于其他基团的情况下才有可能对其进行修饰，但研究人员可以对蛋白质进行全局修饰，并以这种方式修饰所需的基团。这样一来，其他基团的修饰可能会掩盖效果，但可能很难获得完全的定点修饰。另一方面，也有可能通过蛋白质工程学，对含有关键基团的特定氨基酸进行突变，从而实现对关键基团的修饰。

将定点突变和化学修饰结合起来，可以在蛋白质的特定区域引入基团、肽或聚合物，避免对蛋白质的其他基团进行修饰。这种耦合可能允许采用非常有趣的方法，允许对酶的特性进行微调。例如，可以通过巯基二硫键，使用Cys基团将肽结合到脂肪酶的特定区域。

2.固定化蛋白的修饰

图11.可逆固定化酶的化学修饰。

2011年之前对固定化酶进行化学修饰的例子已经回顾过了。现在，我们将重点介绍最近的例子。

先前通过界面活化与醛葡聚糖固定的来自Rhizomucor miehei的脂肪酶的分子间交联，可将这种酶用于在50%（v/v）2-丙醇存在下水解沙丁鱼油，生成二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，防止酶从载体上解吸。戊二醛是一种非常有趣的化合物，在生物催化中用途广泛，近年来对其进行了综述。将其应用于游离酶的风险之一是会促进分子间反应，产生不想要的酶聚集。如果事先在酶表面涂上一层聚乙二醇（PEG），防止酶与酶之间的相互作用，这个问题就可以解决，但使用固定化酶可能是实现这一目标的最简单方法。我们的研究小组能够控制辛基琼脂糖上Candida antarctica的脂肪酶B的固定化速度，通过添加30%(v/v)的乙醇来减缓反应速度。

因此，分子间交联和分子内交联的效果可以分开，同时在洗涤剂或溶剂中具有不同的稳定性和抗解吸性。对酶进行全局修饰以改善酶的某些特性的例子还有很多。例如，将头孢菌素C酰化酶吸附在氨基化的载体上，并用戊二醛处理，以获得酶和载体的交联（很可能引入分子间和分子内交联）。用戊二醛对酶进行化学活化后，可进一步用PEI和壳聚糖对酶进行修饰。与游离酶相比，用PEI修饰的制剂的热稳定因子为20倍，其KM（14.3 mM）低于未修饰的制剂（33.4 mM）。新制剂的半衰期为28个周期，而戊二醛固定化酶的半衰期为21个周期。这些良好的酶特性可能有几个真正的原因，如促进有利的环境、酶亚基的交联以及对蛋白质链的运动产生立体阻碍。

在其他例子中，用离子聚合物对固定化酶进行物理包覆已被证明可调整酶的特性。例如，固定在溴化氰琼脂糖上（通过共价附着）和辛基琼脂糖上（通过界面活化在疏水性载体上的物理吸附）的磷脂酶被硫酸葡聚糖或PEI涂覆。一般来说，PEI涂层能显著提高酶活性（某些底物甚至提高了30倍）和稳定性（在30%乙腈中提高了30倍）。另一方面，硫酸葡聚糖涂层通常会对酶活性产生一些负面影响。这项工作的主要结论是，离子聚合物涂层的效果在很大程度上取决于所采用的底物、实验条件和固定化技术。后来，通过在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下处理共价制剂，PEI被用来稳定这种由洗涤剂诱导的开放形式的酶。与对硝基苯丁酸（pNBP）相比，在水缓冲液中用PEI包覆固定化酶可使酶活性提高三倍。然而，在存在0.1% SDS（v/v）的情况下，这种涂层使酶活性提高了50倍，而且在去除洗涤剂后酶活性仍然保持不变。在另一篇论文中，来自C. antarctica（组分B）、Thermomyces lanuginosus和R. miehei的脂肪酶被固定在与上述相同的载体中。这些固定化酶的表面经过了化学或物理修饰（酶的羧基用乙二胺修饰，氨基用琥珀酸酐修饰，或用PEI涂层修饰）。这些处理方法可以改变酶水解沙丁鱼油生产二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的活性和选择性。不过，修饰的效果取决于固定化方案和反应介质的pH值。

在其他情况下，引入的聚合物只与酶有一种共价作用，然后可能与酶产生一些其他作用（疏水作用、离子作用等）。PEG是实现这一目标最广泛使用的分子之一，主要是因为它有助于提高酶在有机介质中的溶解度（以可溶性形式）。这种修饰的目的可能是全面改变酶的表面，在这种情况下，在酶表面引入许多聚合物分子是很方便的。这些方法已发展到更为复杂的策略，即事先对固定化酶进行化学修饰，以提高蛋白质表面的反应活性。因此，在对改性后的酶表面进行胺化处理后，通过碳二亚胺途径使用琥珀酸聚乙二醇对来自C. antarctica的脂肪酶B（CALB）进行了修饰。对固定的（辛基琼脂糖和Eupergit C上的）CALB原生氨基进行修饰不会显著改变CALB中的氨基，而在初步化学胺化之后，每个酶分子可引入约14-15个PEG分子。同样，修饰对功能特性的影响取决于固定化方案和底物。化学修饰的目的可能是使载体蛋白表面包被感兴趣的分子，例如，诱导免疫原性反应或制备嵌合蛋白。最近，有人建议将脂肪酶固定在疏水性纳米粒子上，以实现这一功能。固定化脂肪酶经过修饰，具有环氧化物功能，可用于与其他分子发生反应。

有许多对酶表面进行整体修饰的例子，从而在某种程度上提高了酶的性能。利用碳二亚胺途径，用乙二胺对固定在辛基琼脂糖上的T. lanuginosus脂肪酶的羧基进行了修饰。通过控制碳二亚胺的浓度，对羧基进行了不同程度的修饰。对固定化酶进行化学修饰后，其活性的提高与胺化程度成正比。这种酶的热稳定性高于未修饰的酶，主要是在pH值为5时（几乎提高了30倍）。在另一篇文章中，将C. antarctica的脂肪酶B吸附在辛基琼脂糖上或共价固定在溴化氰琼脂糖上，然后用乙二胺或2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）进一步修饰，只用一次反应或连续使用几种修饰方法。共价固定的酶经过化学修饰后活性降低了40-60%，而吸附的酶经过乙二胺修饰后对pNPB的活性提高了（甚至提高了两倍）。化学修饰对酶特性的影响在很大程度上取决于所使用的固定化方案、使用催化剂的实验条件以及底物。在另一个例子中，通过温和共价连接固定在溴化氰琼脂糖珠上和界面活化固定在辛基琼脂糖珠上的磷脂酶被进行了不同的单独或级联化学修饰（胺化、戊二醛或TNBS修饰）。虽然大多数修饰在某些条件下对酶的某些特性有积极影响，但在另一些情况下，这种修饰在其他条件下会产生消极影响。

采用共价或物理吸附方法将来自Ralstonia eutrophaH16的氢化酶固定在阴离子树脂AmberliteTM FPA54上。通过用甲氧基聚乙二醇对共价结合的SH进行修饰，进一步提高了固定化酶的稳定性。

研究人员采用了一种非常温和的方法，将基因修饰（在蛋白质的理想位置引入一个Cys，并利用它来选择性地固定聚合物）和固定酶的化学修饰同时结合起来。这一时期报道的所有研究都是以Bacillus thermocatenolatus的脂肪酶2（一种具有复杂双盖的酶）为参照物，使用了这种技术。在第一种方法中，通过用吡啶二硫聚酰胺右旋糖酐或单羧基聚乙二醇（PEG）对单个外部原生Cys64进行定向化学修饰，大大提高了固定在CNBr琼脂糖或乙二醛琼脂糖上的这种脂肪酶的活性。当脂肪酶表现出开放和活跃的形式时，这种残基被放置在盖子所在区域的附近。修饰的最终效果在很大程度上取决于固定制剂、所用聚合物和底物。与未修饰的固定化酶相比，这些制剂对反应介质变化的反应不同。后来，研究人员开始追求一个更困难的目标：在没有Triton X-100等外部物质的情况下实现脂肪酶的界面活化。为了实现这一目标，我们在酶表面的三个不同位置连接了各种烷烃链，以产生脂肪酶的界面活化，并将定点突变纳入方案中，既消除了原生的Cys残基，又在所需位置引入了新的Cys残基。在320位引入十二烷后，在水溶液条件下的活性比未经修饰的野生型变体高出2.5倍。新生物催化剂在选择性合成丁酸环氧乙烷-2-基酯时的效率提高了12倍，生成的S-对映体具有更高的对映特异性（ee592%）。在另一篇论文中，其他研究人员利用定向引入Cys与固定化酶的化学修饰相结合的方法，在脂肪酶盖点上引入了不同的定制肽。这些方案在不同的生物转化过程中提高了酶的特异性和区域或对映体选择性。最近，研究人员制备了不同的定制硫醇离子聚合物，并用2,2-二硫二吡啶激活了引入所需位置的Cys。其中一些修饰大大提高了酶在生产有趣药物时的性能。

有时，酶的修饰是最终生物催化剂物理形成的关键。在一篇有趣的论文中，作者展示了使用多离子聚合物在层状钛酸酯中固定具有不同等电点的蛋白质；聚合物是钛酸酯薄片逐步分层的关键点。这些复合材料可重复使用，经过10个循环步骤后，固定化的溶菌酶和脂肪酶的残余活性分别为68%和61%。

在最近的一篇论文中，固定化酶被用来包裹载体和恢复固定化脂肪酶的活性。将Yarrowia lipolytica Lip2的脂肪酶(YLIP2)固定在环氧树脂(甲基丙烯酸甘油酯-三烯丙异氰酸酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)上，研究人员发现，在载体上涂上正丁胺或明胶可提高酶的性能。明胶的胺化使脂肪酶的表达活性比裸载体上是提高了五倍。

本节要介绍的最后一篇文章是一个例子，说明化学新知识可能给酶的修饰带来巨大潜力。它的基础是在紫外线辐射诱导下改变其性质的化合物。利用这种策略，作者将偶氮苯和螺吡喃基团的几种组合与固定在透明琼脂糖珠上的B. thermocatenolatus的脂肪酶活性中心附近不同位置的半胱氨酸相连接。通过这种方法，作者能够控制脂肪酶的催化特性，而这种调节取决于光致变色化合物的性质和锚定位置。最显著的结果是，在紫外线下，偶氮苯附着在295残基上会使脂肪酶偏好S异构体，而可见光则会使脂肪酶偏好R异构体。这种利用光改变脂肪酶催化特性的可能性是一个令人印象深刻的进步，因为根据实验条件的不同，同一种脂肪酶可以产生两种异构体2011年之前对固定化酶进行化学修饰的例子已经回顾过了。现在，我们将重点介绍最近的例子。

3.修饰蛋白质以提高酶的固定化

在本节中，我们将讨论一些例子，在这些例子中，化学修饰并不是为了改善酶的特性，而是为了改变酶的固定方式。研究人员追求的不是更好的酶，而是更好的固定化生物催化剂。

与制备无载体固定化酶有关的一个例子是CLEAs技术。该技术由Sheldon开发，酶沉淀后，酶分子之间相互交联。有时，由于蛋白质上的赖氨酸残基数量较少，无法实现这种交联，但可以使用进料蛋白质或聚合物来解决。这就降低了装载能力，因为最终固体的一部分将不是目标蛋白质。来自C. antarctica的脂肪酶B就属于这种情况，其交联步骤效率很低，最终的CLEA可能会将酶释放到上清液中。以前使用乙二胺和碳化二亚胺途径对酶进行胺化时，这种情况得以解决，即使在有SDS存在的情况下煮沸，也能得到不释放酶的稳定固体。

有些例子旨在对酶进行化学修饰，使其在固定化载体上进行更好的离子交换。一般来说，这意味着蛋白质富含与载体上的离子性质相反的离子。据我们所知，目前还没有新的报道，但2011年之前的一些报道在以前的综述中讨论过。

在对蛋白质进行化学修饰以促进多点共价连接方面有一些新的实例。通常的做法是增加活性基团（伯胺基团）的数量，以增加多点共价连接。商用葡萄糖淀粉酶不能固定在乙二醛琼脂糖上，但经过化学胺化后（游离酶保留了80%的原始活性），它可以迅速固定在这种载体上，保留50%的活性，稳定性提高了500倍。由于酶的稳定性较低，在pH值为10时无法将Rhizopus oryzae的脂肪酶多点共价固定在环氧树脂功能化的二氧化硅和纳米二氧化硅颗粒（MCM-41和SBA-15）上。用乙二胺和碳二亚胺（pK59.2）对酶进行胺化处理，可以在较低的pH值下进行固定，从而提高了酶的稳定性和酶在水解鱼油过程中的选择性。生物催化剂水解顺式-5,8,11,14,17和顺式-4,7,10,13,16-二十碳五烯酸的效果优于19二碳二十六烯酸。对来自Trametes versicolor的漆酶进行胺化处理，并将其固定在乙二醛载体上（活性恢复率为60%），从而将活性提高了280倍。该生物催化剂可重复使用10个反应循环，活性损失可以忽略不计。将Hypocrea pseudokoningii的脂肪酶胺化并固定在乙二醛琼脂糖上，使酶的稳定性提高了45倍。这种生物催化剂被用于水解沙丁鱼油以及Theobroma grandiflorum、Latonia insignis和Astrocaryum murumuru植物油。与对照组相比，多点固定过程使油的水解率提高了15倍。

最近，有人提出了酰基乙醛载体，认为它是提高酰基载体性能的有效工具。这些新型载体将酰基载体的良好特性与共价键的存在结合起来，即使在最苛刻的条件下也能防止酶解吸，从而以开放形式特异性地固定脂肪酶。不过，这种策略需要在pH值为10的条件下孵育酶（与某些酶的稳定性不符），而且某些脂肪酶的赖氨酸残基位置不合适，无法与载体发生反应。虽然使用一些添加剂可以提高稳定性，但吸附酶的非绝对共价固定化降低了人们对这一策略的兴趣。在辛基乙二醛上进行界面活化后，对酶进行氨基化处理，可以解决这两个问题（脂肪酶在pH值为9时可能会共价固定），同时还能提高稳定性。与在pH值为10时使用未氨基化的酶相比，在pH值为9时实现这一目标的速度更快。

在一个有趣的例子中，定点突变被用于定向固定，酶的化学胺化允许强烈的多点共价连接。该示例使用了来自B. thermocatenulatus的化学胺化脂肪酶2；该脂肪酶通过Cys344或Cys40定点固定在乙醛巯基载体上并使其刚性化。

在某些情况下，作者引入了一些基团，使蛋白质得以固定在它们无法通过这种机制自然固定的地方。例如，在一个例子中，用甲基烯丙基硅烷基团化学修饰的葡萄糖氧化酶被固定在未经处理的二氧化硅载体上。另一篇论文显示，青霉素酰化酶经醛基褐藻胶修饰后固定在氨基化的载体（Sepabeads EC-HA）上，从而提高了酶的稳定性。在另一项研究中，通过对糖酶链进行化学胺化并使用氧化褐藻胶，实现了辣根过氧化物酶在褐藻胶微球中的固定化。在80%(v/v)的二氧六烷中培养2天后，固定化酶保留了75%的原始活性，与原生酶相比，在碱性溶液中的活性也有所提高。这种固定化过氧化物酶可催化焦酚氧化，并在多次重复使用后保留了75%的原始活性。最后，用邻苯二酚对过氧化氢酶进行了修饰，从而提高了其在二氧化钛亚微球上的固定性。通过邻苯二酚基团与二氧化钛之间的螯合反应，过氧化氢酶得以实现共价固定。固定化的过氧化氢酶保留了60%的催化活性，并提高了稳定性。在重复使用19次后，它仍能保持5%的初始活性。

不过，在一个例子中，研究人员试图降低相互作用的强度。使用碳化二亚胺将乳糖酶固定在表面有羧酸的纳米粒子上，结果发现活性下降较多。用氨基葡萄糖对酶进行修饰可减少酶活性的降低，并通过减少酶与载体之间的相互作用来改善结果。

最后一个例子显示了使用戊二醛化学方法将PEG化的Aspergillus flavipes l-甲硫氨酸酶与谷氨酸脱氢酶共同固定在胺化载体上。虽然活性降低了，但PEG化提高了对磷酸吡哆醛（PLP）酶抑制剂（丙炔甘氨酸和羟胺）的稳定性。此外，固定化酶在体外对蛋白水解的稳定性也有所提高。

4.修饰蛋白质以获得固定化酶生物催化剂的理想策略

在此，我们展示了用于制备固定化生物催化剂的化学修饰趋势和主要实例（图12）。显然，结合使用定点诱变和化学修饰可以完全控制修饰；这为更可控地定制酶的特征提供了新的机会。此外，由于修饰是完全可控的，因此可以很容易地将结果与模型相匹配，并产生如何进一步改进酶特征的信息。甚至有可能制造出这些改性酶的晶体，以确定这种特定位点的独特修饰所产生的确切变化。

图12.由特定制剂引导的化学修饰。

图13.对固定化酶表面进行可控和连续修饰。

图15.使用二环氧化物或二乙烯基砜基团对固定化酶进行化学修饰。

另一种应该进一步探索的可能性是使用通过紫外线辐射诱导而改变其特性的化合物。一篇很好的论文报道了利用这种策略通过辐照来调整脂肪酶的特性。研究结果很有前景，证实了通过化学修饰来调整脂肪酶。不过，这也可用于开发开关固定化方案，例如，在某些条件下产生离子交换，而改变实验条件则可轻松地将酶从载体中释放出来（图16）。这种方法可用于必须以游离形式使用为了重复使用的酶，以实现真正经济可行的工艺（如水解纤维素、蛋白质）。

图16.用光致变色化合物对酶进行化学修饰，以及紫外线照射对修饰固定化酶的影响。

DOI: https://doi.org/10.1002/tcr.201600007