《Carbohydrate Polymers》海参硫酸化岩藻多糖的综合研究：前景与展望
文摘
科学
2024-08-02 19:19
江苏
2024年7月，来自中国海洋大学的Guangning Chen等人在Carbohydrate Polymers上发表了一篇题为A comprehensive review of sulfated fucan from sea cucumber: Antecedent and prospect的综述性文章。
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通讯单位：College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266404, ChinaAbstract
海参硫酸化岩藻多糖主要由L-岩藻糖和硫酸基团组成。最近的研究证实，硫酸化岩藻多糖的结构主要由重复单元组成，通常是四糖。然而，越来越多的证据表明存在不规则的结构域和尚未被广泛探索的异质单元。此外，作为海参营养价值的关键贡献者，硫酸化岩藻多糖具有一系列生物活性，如抗炎、抗癌、降血脂、抗高血糖、抗氧化和抗凝血等特性。这些生物活性硫酸化岩藻多糖的结构特征（包括分子量和硫酸基团的分布模式）对生物活性的提高有着重大影响。最新研究表明，硫酸化岩藻多糖分散在海参体壁细胞外基质中。本文旨在综述硫酸化岩藻多糖的原位分布、结构、结构解析策略、功能和构效关系的研究进展，尤其是近十年来的研究进展。本文还对硫酸化岩藻多糖研究和开发中面临的主要挑战和潜在解决方案进行了探讨。此外，岩藻多糖酶和碳水化合物结合模块有望在该领域的发展中发挥关键作用。
海参属于棘皮动物门、海参纲，被认为是具有显著经济价值的传统营养食品。全球已鉴定的海参种类约有1700种，印度洋和西太平洋是海参种类最丰富、最多的地区。海参产业已经建立了一个完整的产业链，包括养殖，加工和销售。由于东亚地区对海参的需求不断增长，全球海参产量不断增长，2018年全球海参产量达3.93万吨，产值达161.3亿美元。硫酸化岩藻多糖，又称褐藻糖胶，是海参体壁中的主要多糖，占海参干重的 3–8% ，硫酸化岩藻多糖不仅存在于海参中，也存在于海胆中。需要说明的是，本文仅对海参中的硫酸化岩藻多糖进行了综述。目前已报道的海参硫酸化岩藻多糖大多是由L-岩藻糖通过α-1,3-糖苷键连接而成的线性多糖，并在O-2和（或）O-4位带有硫酸基团。此外，硫酸化岩藻多糖因其作为功能性成分的潜力而备受关注。硫酸化岩藻多糖已被揭示出广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化剂、抗癌、降血脂、抗高血糖、免疫刺激和抗凝作用，以及其结构-活性关系。先前的研究还表明，带负电荷的硫酸化岩藻多糖具有良好的流变性质，使其适合构建稳定的食品输送系统，例如纳米颗粒和多层乳液。自1960 年日本研究人员首次提取并研究海参中的硫酸化岩藻多糖以来，对其的研究已有 60 多年的历史，尽管如此，目前尚无关于海参硫酸化岩藻多糖的全面综述。本文旨在综述海参硫酸化岩藻多糖的研究进展，包括其在海参体内的分布、结构、功能和构效关系，并探讨硫酸化岩藻多糖研究和开发中面临的主要挑战和可能有效的解决方案。
1960年，日本研究人员在海参C. japonica的体壁中发现了一种高分子量的酸性多糖。（海参种属的拉丁学名和缩写列于表S1）。这种多糖由摩尔比约为1：1的岩藻糖和硫酸酯基团组成，称为硫酸化岩藻多糖。美国、日本、俄罗斯和中国的研究人员相继证实海参中存在硫酸化脱氧半乳聚糖。然而，这种具有独特组成的酸性多糖由于缺乏精细结构信息，几十年来一直没有引起人们的重视。直到1994年巴西研究人员从海参中分离纯化出硫酸化脱氧半乳聚糖，这种情况才有所改变。并使用核磁共振（NMR）成功地阐明了其主要结构。首次对硫酸化岩藻多糖的精细结构进行了全面的研究。硫酸化岩藻多糖成为多糖研究者关注的焦点，在过去的几十年里，它在生物活性研究、精细结构分析和特定研究工具的发现等方面都有了快速的发展。硫酸化岩藻多糖研究领域的历史如图1所示。![]()
图1.硫酸化岩藻多糖研究领域发展历程。
硫酸化岩藻多糖的抗凝特性是最早研究的活性，在接下来的二十年里，硫酸化岩藻多糖的活性，包括促进神经干细胞/祖细胞迁移（NSPCs）、胃保护、降血脂、抗氧化剂、抗高血糖、抗炎、免疫增强剂、肠道菌群的调节和抗癌作用等效应陆续被证实，并初步建立了构效关系。随着对硫酸化岩藻多糖结构理解的不断深入，硫酸根分布和分子量(Mw)已被证明是影响活性的关键结构特征。2013年至2022年，本课题组利用野生型岩藻多糖酶作为降解工具，揭示了A. japonicus、H. tubulosa、A. molpadioides、T. ananas、H. hilla等藻类中硫酸化岩藻多糖的一级结构，硫酸化岩藻多糖的链状构象首次被解析。到目前为止，已有 20 余种海参硫酸化岩藻多糖的一级结构被阐明。已确定了 7 种海参硫酸化岩藻多糖的链构象。随着基因组测序技术的快速发展，针对硫酸化岩藻多糖的分析研究工具也随之出现。2010年，从海洋环境中筛选出第一株硫酸化岩藻多糖降解菌Wenningzhuangia fucanilytica CZ1127 T 。从该细菌中获得野生型岩藻多糖酶，并用于硫酸化岩藻多糖的结构分析。2020年，通过基因组学和比较转录组学，在W. fucanilytica CZ1127 T中发现了第一个内切-1,3-岩藻多糖酶基因，并在大肠杆菌中异源过表达。异源过表达的岩藻多糖酶Fun168A被证明可以水解各种硫酸化岩藻多糖中的α-1,3-糖苷键。Fun168A的发现导致了糖苷水解酶家族GH168的建立。陈等人利用过表达的Fun168A建立了一种高效的硫酸化岩藻多糖结构解析策略，大大降低了原料消耗和时间成本。随后，从多糖利用位点发现了内切-1,3-岩藻多糖酶Fun174A和Fun187A，并由此建立了GH174和GH187。岩藻多糖酶在家族内和家族间表现出多种裂解位点。在2022 年，第一个识别硫酸化岩藻多糖的碳水化合物结合模块(CBM) WfCBM47 被发现并进行了表征。WfCBM47 表现出与硫酸化岩藻多糖的特异性结合能力。利用基于 WfCBM47 的荧光探针成功揭示了硫酸化岩藻多糖在海参中的原位分布。一年后，第二个硫酸化岩藻多糖特异性 CBM (Fun174A-CBM) 被报道。目前，硫酸化岩藻多糖领域已发展近70年，近十余年来处于快速成长期，这种结构独特的海洋多糖受到越来越多的关注，在其原位分布、结构、功能、构效关系以及特定的研究手段等方面均取得了多项突破。2.1硫酸化岩藻多糖作为海参馅料
作为海参的结构大分子，硫酸化岩藻多糖的原位分布对海参的生理结构、营养品质及加工特性影响巨大。然而，由于缺乏针对硫酸化岩藻多糖的特异性探针，限制了对其在海参体壁内原位分布的阐明。最近，碳水化合物结合结构域 WfCBM47 被发现，其表现出与硫酸化岩藻多糖的特异性结合能力。此外，利用融合表达技术，构建了特异性荧光探针EmGFP-WfCBM47，可在微米尺度上对海参体壁中的硫酸化岩藻多糖进行特异性原位染色观察。研究表明，硫酸化岩藻多糖主要分散在海参体壁细胞外基质中，这解释了海参在煮沸加工过程中硫酸化岩藻多糖流失的现象。硫酸化岩藻多糖具有强的保水能力，可能与其富含硫酸基团、分子量较大（高于2000kDa）有关，因此推测硫酸化岩藻多糖在海参中起着基质填充剂和保水剂的作用。涉及硫酸化岩藻多糖提取的综述文章很容易找到。因此，本文没有深入探讨这一主题。简而言之，硫酸化岩藻多糖可以通过煮沸从海参体壁中释放出来，因为它主要作为细胞间基质中的填充物存在。通常使用蛋白酶消化来分解胶原蛋白和其他蛋白质，从而促进硫酸化岩藻多糖的提取，而胶原蛋白和其他蛋白质主要构成海参的细胞间基质。随后，通常使用乙醇或十六烷基氯化吡啶来沉淀含有硫酸化岩藻多糖的粗多糖。此外，通常使用阴离子交换色谱法来纯化均质硫酸化岩藻多糖。应该注意的是，岩藻糖基化硫酸软骨素结构相似的物质 fCS 可能会干扰硫酸化岩藻多糖的提取。阴离子交换色谱法可能无法保证fCS和硫酸化岩藻多糖的有效分离，因为来自一些海参物种的这两种多糖具有相似的电荷特性.此外，高分子量硫酸化岩藻多糖与树脂的结合可能具有挑战性这是因为大多数树脂都是多孔珠，高分子量的硫酸化岩藻多糖很难穿透树脂内部并被吸附。与分散在细胞外基质中的硫酸化岩藻多糖不同，fCS 链以共价键形式连接到胶原纤维上，形成“珍珠手镯”结构，突显了这两种多糖在原位分布上的显著差异，有可能根据两种多糖分布的差异设计出一种分离方法，但还有待进一步的验证和开发。大多数已报道的海参硫酸化岩藻多糖为线性多糖，由L-岩藻糖通过α-1,3-糖苷键连接而成，并在O-2和（或）O-2,4位上带有硫酸基团硫酸基团沿主链呈特定模式分布，因此硫酸化岩藻多糖的主要结构通常由重复的寡糖单元组成。![]()
图2.线性硫酸化岩藻多糖的主要结构定义。
大部分海参属海参的硫酸化岩藻多糖的主要结构都是由 Fuc 4 S 4重复单元组成（“Fuc”代表岩藻糖残基；“S”代表硫酸基团；数字代表岩藻糖残基和硫酸基团的数量）。例如，H. grisea（别名Ludwigothurea grisea）、H. lentiginosa、H. polii和H. tubulosa的硫酸化岩藻多糖的主要结构都是 [→3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1 → 3-α-L-Fuc p 2,4(OSO 3 −)-1 → 3-α-L-Fuc p -1 → 3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1→] n. H. hilla硫酸化岩藻多糖的主要结构为 [→3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1 → 3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1 → 3-α-L-Fuc p -1 → 3-α-L-Fuc p 2,4(OSO 3 − )-1→] n 。此外，I. badionotus的硫酸化岩藻多糖与H. hilla的硫酸化岩藻多糖具有相同的结构，表明不同属的硫酸化岩藻多糖可能具有相似的主要结构。一些硫酸化岩藻多糖由 Fuc 4 S 3重复单元组成，例如来自P. graeffei、A. molpadioides和T. ananas的硫酸化岩藻多糖。来自Stichopus属的硫酸化岩藻多糖由单糖重复单元组成。例如，来自S. herrmanni、S. chloronotus和S. horrens的硫酸化岩藻多糖的主要结构为 [→3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-)-1→] n 值得注意的是，从H. albiventer中提取的硫酸化岩藻多糖具有独特的结构组成，由罕见的重复六糖单元组成。除了α-1,3-键外，某些物种的硫酸化岩藻多糖还可能含有其他类型的糖苷键。马等人采用离子交换层析和凝胶排阻层析从P. mollis中分离纯化了5种硫酸化岩藻多糖FSI、FSII、FSIII、FSIV和FSV 。其中FSI和FSII为α-1,3-连接岩藻多糖，FSIII、FSIV和FSV为α-1,4-连接岩藻多糖。在T. ananas和H. fuscopunctata中也发现了α-1,4-连接岩藻多糖. S. variegatus的硫酸化岩藻多糖由交替的 α-1,3-键和 α-1,2-键组成. 从H. fuscopunctata中分离出一种具有交替 α-1,3-键和 α-1,4-键的硫酸化岩藻多糖。有研究表明硫酸化岩藻多糖中的硫酸基团可能在除O-2和（或）O-2,4位以外的其他位置发生取代。例如，来自B. argus的硫酸化岩藻多糖由O-4硫酸化岩藻糖残基组成.可以从H. fuscopunctata中提取[→4-α-L-Fuc p 3(OSO 3 − )-1→] n组成的硫酸化岩藻多糖，并且 O-3硫酸化在硫酸化岩藻多糖中极为罕见，因为大多数糖苷键发生在O-3。虽然大多数硫酸化岩藻多糖都是线性多糖，但某些物种的硫酸化岩藻多糖具有岩藻糖分支（图 3）。例如，于等人从A. japonicus中纯化了硫酸化岩藻多糖，其由支链五糖重复单元 [→3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1 → 3,(α-L-Fuc p -1 → 4-α-L-Fuc p -1→)4-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1 → 3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1→] n组成。此外，还从H. coluber和H. edulis中分离纯化了含有岩藻糖分支的硫酸化岩藻多糖.有趣的是，从海参中提取的硫酸化岩藻多糖由岩藻糖和半乳糖组成，这是目前报道的唯一一种由岩藻糖以外的单糖组成的海参硫酸化岩藻多糖。![]()
图3.支链硫酸化岩藻多糖的主要结构定义。
先前的研究表明硫酸化岩藻多糖除了常规的主要结构仅由重复单元组成外，还表现出少量复杂的异质结构。例如，来自S. herrmanni 的硫酸化岩藻多糖的主要结构为 [→3-α-L-Fuc p 2(OSO 3 − )-1→] n 。然而，对来自S. herrmanni的硫酸化岩藻多糖中从单糖到七糖的寡糖进行 NMR 分析发现存在少量随机排列的 Fuc p 2,4(OSO 3 − ) 单元。这表明在大多数均质的链中存在异质片段。此外，虽然H. lentiginosa和H. polii的硫酸化岩藻多糖的主要结构相同，但在 NMR 光谱中可以观察到细微的差异。H . lentiginosa硫酸化岩藻多糖的1 H NMR 光谱在异头质子区域显示出两个独特的信号，分别位于 5.1 ppm 和 4.8 ppm 左右，而H. polii硫酸化岩藻多糖中不存在该信号，这表明异质片段的结构存在差异. H. hilla硫酸化岩藻多糖的主要结构由 Fuc 4 S 4重复单元组成。尽管如此，在酶解产物中仍可检测到8个次要寡糖，占质谱上总丰度的 32.1 %。除了从主要结构域与其他海参品种的硫酸化岩藻多糖相比，日本海参的硫酸化岩藻多糖的结构规律性较差。尽管成功从日本A. japonicus中制备出低分子量的硫酸化岩藻多糖，但结构分析仍然带来重大挑战。卡里亚等人采用非常规萃取方法，以有机试剂（氯仿-甲醇）从刺参体壁中提取出两种分子量较低的硫酸化岩藻多糖（9kDa 和 32kDa），但光谱分辨率仍然不足以阐明它们的精细结构。于等人利用野生型岩藻多糖酶从日本海参中制备了硫酸化岩藻多糖的酶解产物。核磁共振结果表明，酶解产物的主要结构为五糖重复单元，3-键、4-键和3,4-键的摩尔比为2:2:1。而甲基化分析表明摩尔比为4:2:1。这种不一致可能是由于硫酸化岩藻多糖的异质性对NMR的阻碍。所有这些证据表明硫酸化岩藻多糖表现出异质性。在最近的一项研究中，证实硫酸化岩藻多糖可作为海参物种标记，这是因为异质性片段之间存在种间差异。然而，由于异质性片段的复杂性，通过常规的基于 NMR 的策略很难解析其结构。高效且灵敏的结构解析策略值得开发。由于多糖分子量较大，其结构解析仍较为困难，而寡糖（尤其是分子量小于1000 Da的寡糖）则可以得到明确的NMR谱图，可以直接通过质谱进行解析。因此，硫酸化岩藻多糖的结构解析一般采用“自下而上”的策略，即通过确定寡糖的结构，再对多糖的整体结构进行组装。目前，物理和化学降解法（如酸降解、氧化降解）仍是生产硫酸化岩藻多糖寡糖的主要方法。然而，必须承认的是，这些降解方法通常会生成复杂的寡糖混合物，并导致硫酸化岩藻多糖脱硫酸盐化。因此，后续的寡糖纯化很困难，并且存在丢失所提出的结构模型中某些硫酸基团的风险。最近，出现了针对硫酸化岩藻多糖的结构分析策略，即酶水解和糖组学相结合。岩藻多糖酶是一种内切水解酶，专门水解硫酸化岩藻多糖中的键。与物理或化学降解方法相比，酶促降解获得的寡糖产物更规则，因此更容易纯化。此外，酶促水解不会导致硫酸化岩藻多糖的非预期脱硫酸化。来自W. fucanilytica CZ1127 T的野生型岩藻多糖酶已用于多种硫酸化岩藻多糖的结构分析，但野生型岩藻多糖酶制备困难、活性低、稳定性差，而异源过表达岩藻多糖酶易于获得且活性较高(图4)。与野生型相比，该策略在成本和效率方面具有优势。由于酶的高效获取和寡糖的优异转化率，10 mg 硫酸化岩藻多糖（约为野生型酶策略的 1/25）足以进行结构鉴定，提示岩藻多糖酶，特别是异源过表达的高活性岩藻多糖酶将对硫酸化岩藻多糖的结构解析具有重要的意义，具有广泛的应用前景。![]()
图 4.基于异源过表达岩藻多糖酶的结构分析流程。
2.5硫酸
化岩藻多糖
的
链构象受分子量和硫酸基团的影响近年来，硫酸化岩藻多糖的链构象因其对生物活性有重大影响而受到广泛研究。多糖的链构象主要有球形、无规卷曲和刚性棒状等，构象参数αs和Mark-Houwink-KuhnSakurada指数αη和αh与链构象形状有关，可通过Mw、特性粘度[ η ]、z均回转半径(Rg)、流体动力学半径(Rh)来估算( 一般而言，α η和α h值为 ∼0.22 对应于球体，0.5–0.8 对应于随机卷曲，最高 1.8 对应于刚性棒αs值为∼0.333 时对应于球体，0.5–0.6 时对应于随机卷曲，0.6–1.0时对应于刚性棒，大量研究表明硫酸化岩藻多糖在溶液中通常呈无规卷曲形式，如H. hilla、T. ananas、I. badionotus、P. graeffei和H. tubulosa等植物的硫酸化岩藻多糖。与其他多糖一样，分子量是影响硫酸化岩藻多糖链构象的关键因素。一般而言，硫酸化岩藻多糖的分子量降低，Rg和Rh值降低，链构象更加紧密。通过酶促降解，以不同分子量的T. ananas为原料，制备了硫酸化岩藻多糖Ta-FUC（1380.0±8.1 kDa，αs = 0.6，αη = 0.92），Ta-LMF1（828.7±2.9 kDa，αs = 0.58，αη = 0.77），Ta-LMF2（483.0±1.5 kDa，αs = 0.35，αη = 0.63）和Ta-LMF3（215.0±0.8 kDa）。其中，Ta-FUC，Ta-LMF1和Ta-LMF2在磷酸盐缓冲溶液中呈无规卷曲。分子量最低的Ta-LMF3采用球形链构象。此外，当H. tubulosa硫酸化岩藻多糖的分子量从 1567.6 ± 34.1 kDa 降至 498.2 ± 8.1 kDa 时，其链构象由无规卷曲变为球形. I. badionotus硫酸化岩藻多糖的分子量为 1386.6 kDa，链构象为无规卷曲，而 63.8 kDa 的则为球形因此，通过降低硫酸化岩藻多糖的分子量，可以使其链构象由无规卷曲变为球形。硫酸基团是影响硫酸化岩藻多糖链构象的另一个关键因素。从P. graeffei和I. badionotus中提取了两种硫酸化岩藻多糖，它们的分子量相似（前者为 65.5 kDa，后者为 63.8 kDa）。两种硫酸化岩藻多糖的主要结构都是四糖重复单元。不同的是，来自I. badionotus的硫酸化岩藻多糖在每个重复单元上带有四个硫酸基团，而来自P. graeffei的硫酸化岩藻多糖在每个重复单元上仅带有三个硫酸基团（图2）。研究表明，P. graeffei的硫酸化岩藻多糖在溶液中呈现随机卷曲构象，而I. badionotus的硫酸化岩藻多糖形成球形构象并表现出更高的 [η]。从理论上讲，带负电荷的硫酸基团预计会增强分子内的排斥力，并阻止链采用紧凑构象。本研究中，硫酸基团含量较高的I. badionotus硫酸化岩藻多糖的链构象反而更紧凑。这表明，除了硫酸基团的含量外，硫酸基团的分布模式也影响链构象。有必要比较不同一级结构的硫酸化岩藻多糖的链构象，以阐明硫酸基团模式对链构象的影响。这将深化对硫酸化岩藻多糖一级结构和高级结构之间关系的理解。
3.硫
酸
化岩
藻
多
糖有
什
么作用？
3.1硫酸
化
岩
藻
多糖
对海
参
生物活性
有重要贡献
海参自古以来就因其可食用和药用价值而受到重视。作为海参的一种成分，硫酸化岩藻多糖因其作为功能性成分的潜力而备受关注，为海参的营养做出了重大贡献。研究表明，硫酸化岩藻多糖具有多种生物活性，包括抗凝、降血脂、抗高血糖、调节肠道菌群、抗炎、抗氧化、抗癌、免疫刺激、促进NSPC迁移和保护胃的作用（图 5)，综述了不同生物体来源的硫酸化岩藻多糖的生物活性及构效关系(表格1；如果在活性研究中确定了硫酸化岩藻多糖的结构，也会显示出来。）![]()
图5.硫酸化岩藻多糖的生物活性。
表1.硫酸化岩藻多糖的生物活性总结。
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大多数血栓栓塞过程需要抗凝治疗，肝素用于治疗已有 80 多年历史。但肝素会引起血小板减少、出血和抗凝缺陷等副作用。此外，肝素主要从猪肠或牛肺中获得，这些地方的肝素浓度相对较低。这强调了探索抗凝和抗血栓化合物替代来源的必要性。硫酸化岩藻多糖已被证明具有显着的抗凝作用，被认为是肝素的潜在替代品。例如，来自S. horrens的硫酸化岩藻多糖在浓度为 3.92 ± 0.15 μg/mL 时可以使活化部分凝血活酶时间 (APTT) 加倍，几乎相当于肝素的抗凝作用（3.21 ± 0.14 μg/mL）. A. leucoprocta中的硫酸化岩藻多糖与肝素辅因子 II (HCII)结合时表现出强效的凝血酶抑制活性，IC50 为 2.4 μg/mL。此外，来自H. edulis和 L. grisea的硫酸化岩藻多糖可通过凝血级联的内在途径有效抑制人体血液凝固。硫酸化岩藻多糖主要通过增强天然血浆蛋白酶抑制剂的抑制作用发挥其抗凝活性，类似于哺乳动物肝素。抑制作用主要通过两种途径实现：1）诱导蛋白酶抑制剂的构象变化；2）充当“桥梁”促进蛋白酶与抑制剂的结合。此外，硫酸化岩藻多糖已被证明具有显著的降血脂活性。李等人发现P. graeffei的硫酸化岩藻多糖能减缓高脂饮食（HFD）小鼠的体重增加，缓解高脂血症，保护肝脏免于脂肪变性。A . molpadioides的硫酸化岩藻多糖还具有显著的抗脂肪生成作用。与喂食 HFD 的小鼠相比，用硫酸化岩藻多糖 (200 μg/mL) 处理的小鼠的皮下、肾周、附睾脂肪含量和细胞内甘油三酯含量 (34.07 %) 显著降低。研究发现，来自T. ananas的硫酸化岩藻多糖对重要的脂肪细胞转录因子（包括 SREBP-1c、PPARγ 和 C/EBPα）具有下调作用。它可以激活与 Wnt/β-catenin 通路相关的基因，例如 β-catenin、 LRP5和 FrZ，并增加脂肪酸 β-氧化中必需基因的表达，例如 PPARα、CPT-1α 和 ACOX。硫酸化岩藻多糖具有显著的抗高血糖特性。来自C. frondosa的硫酸化岩藻多糖可通过激活骨骼肌和脂肪组织中的PI3K/PKB 通路和GLUT4显著降低胰岛素抵抗小鼠的空腹血糖和胰岛素水平。还有研究表明，灰树花中的硫酸化岩藻多糖可通过抑制线粒体途径来抑制胰腺细胞凋亡。此外，A. molpadioides中的硫酸化岩藻多糖可以通过调节肠道微生物群（如拟杆菌门和厚壁菌门）的丰度来改善胰岛素抵抗。硫酸化岩藻多糖对肠道菌群有积极调节作用，增强微生物群落的多样性。日本刺参含有硫酸化岩藻多糖的多糖可促进产生短链脂肪酸 (SCFA) 的细菌和硫化物降解细菌的生长，并减少有害细菌的丰度。T . ananas中的硫酸化岩藻多糖可被肠道菌群降解，产生各种 SCFA，从而促进拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度，同时降低变形菌门的比例。P . graeffei中的硫酸化岩藻多糖可以缓解 HFD 引起的肠道菌群失调，增加拟杆菌门和放线菌的丰度，同时减少厚壁菌门和变形菌的丰度。就抗炎作用而言，尹等人证明日本参中的硫酸化岩藻多糖通过下调脂多糖攻击小鼠肝脏中 MAPK/NF-κB 和 AKT/mTOR 通路以及 iNOS 的表达表现出抗炎作用。研究发现，从H. tubulosa中提取的硫酸化岩藻多糖能够通过激活PPARγ，减弱炎症细胞因子的产生，并诱导共培养巨噬细胞中M2极化。体内实验表明，H. tubulosa硫酸化岩藻多糖可显著降低血清炎症水平，减弱肝脏库普弗细胞的M1/M2极化，减轻附睾脂肪组织的炎症浸润。P-选择素被认为是治疗炎症的一个有希望的靶点，B. argus硫酸化岩藻多糖可以有效抑制P-选择素，其IC50值为0.024 μM，比阳性对照肝素（0.70 μM）强近30倍。超氧化物自由基是由生物反应产生的，是最普遍和最危险的自由基之一，与许多人类疾病的发展有关。来自T. ananas的硫酸化岩藻多糖已显示出显着的超氧化物自由基抑制作用，其IC50 为 17.46 ± 0.14 μg/mL。该值明显低于维生素 C（132.64 ± 2.73 μg/mL）的 IC50，维生素 C 是一种广泛认可的自由基清除剂.H . fuscopunctata的硫酸化岩藻多糖及其4.60 kDa解聚产物表现出强的超氧自由基清除活性，其IC50值分别为65.71和83.72 μg/mL。硫酸化岩藻多糖在抗癌领域具有潜力。研究表明，来自C. frondosa的硫酸化岩藻多糖可阻止人类骨肉瘤上皮细胞 (U2OS) 粘附于纤连蛋白并抑制其迁移。此外，这种硫酸化岩藻多糖可能通过抑制粘着斑激酶和paxillin的磷酸化以及 Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin 信号轴的激活来损害细胞骨架的动态重塑 。日本大头鱼中的硫酸化岩藻多糖可能通过X连锁凋亡抑制剂 蛋白泛素化和内质网应激，使结直肠癌细胞对TNF相关的凋亡诱导配体诱导的凋亡敏感。硫酸化岩藻多糖已被证实具有良好的免疫调节作用。来自A. leucoprocta的硫酸化岩藻多糖在体外对小鼠巨噬细胞 (RAW264.7) 表现出增强的免疫刺激作用。在体内，它表现出抵消环磷酰胺诱导的免疫抑制的能力。此外，它还刺激巨噬细胞增殖和吞噬作用，以及 NO、iNOS、ROS、IL-1β、IL-6、IL-12 和 TNF-α 等各种分子的分泌。日本参硫酸化岩藻多糖可能通过促进 IFN-γ、活化受体 (NKp30)、裂解蛋白 (穿孔素和颗粒酶-B) 以及死亡配体 (FasL) 的分泌，增加自然杀伤细胞的增殖，并增强对 HeLa、HepG2 和 HT-29 细胞的细胞毒性 。此外，含有硫酸化岩藻多糖的日本刺参粗多糖和纯化级分F2和F3对RAW264.7细胞具有有效的刺激作用，能够诱导一氧化氮和细胞因子的产生。NSPCs具有多分化潜能和自我更新能力，在治疗神经系统疾病方面表现出良好的疗效。日本参硫酸化岩藻多糖可增强 NSPC 的迁移和增殖。此外，它对基质细胞衍生因子 1 α 诱导的 NSPC 迁移具有浓度依赖性影响。此外，研究表明硫酸化岩藻多糖通过与成纤维细胞生长因子 2协同作用促进 NSPC 增殖此外，NSPC 的增殖还会导致神经球的形成。3.2.1硫酸基团是影响硫酸化岩藻
多
糖生物活性的关键特征
硫酸化岩藻多糖的主要结构规则，硫酸化模式多样，为建立结构-活性关系提供了天然便利。大量证据表明，硫酸化岩藻多糖中硫酸基团的存在对于增强生物活性至关重要。此外，硫酸基团分布的变化可产生不同的功能结果和潜在的不同机制途径。表 2总结了硫酸化岩藻多糖的硫酸化分布模式与生物活性之间的关系。在抗凝活性方面，O-4硫酸化是增强HCII对凝血酶抑制作用的结构特征。与未经O-4硫酸化的L. grisea硫酸化岩藻多糖相比，O-4硫酸化率为25%的L. variegatus硫酸化岩藻多糖的APTT增加了四倍。由简单的O-4硫酸化岩藻糖组成的硫酸化岩藻多糖在HCII存在下可以达到抑制作用。同样，当N-乙酰半乳糖胺发生O-4硫酸化时，硫酸皮肤素的抗凝活性几乎完全丧失转化为O-6硫酸化.随着2,4-二硫酸化岩藻糖前体部分的增加,其抗凝血酶介导的凝血酶抑制作用明显增强, L. variegatus硫酸化岩藻糖(含25% 2,4-二硫酸化岩藻糖)、S. purpuratus硫酸化岩藻糖Ⅱ (含33% 2,4-二硫酸化岩藻糖)、S. purpuratus硫酸化岩藻糖Ⅰ(含80% 2,4-二硫酸化岩藻糖)在抗凝血酶介导下的IC50值分别为>500 μg/mL、0.9 μg/mL、0.3 μg/mL,而由简单的O-2硫酸化岩藻糖组成的硫酸化岩藻糖几乎不显示抗凝活性。表2.硫酸化分布模式与硫酸化岩藻多糖生物活性关系总结。
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O-4 硫酸化增强了硫酸化岩藻多糖的降血脂作用。P . graeffei的硫酸化岩藻多糖主要在 O-4 位硫酸化，具有强效的减肥、调节脂质紊乱（TC、TG、HLD 单键C 和 LDL-C 水平）、改善肝功能（肝重、GOP、GPT和TBA 浓度）和抑制HFD 引起的脂蛋白水平升高的活性。定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 和蛋白质印迹分析表明， P. graeffei的硫酸化岩藻多糖可以抑制 CD 36 表达、增加PPAR水平并降低CYP7A1水平，从而降低脂肪酸向肝脏组织的转运和脂质代谢。相比之下，缺乏 O-4 硫酸化的I. badionotus硫酸化岩藻多糖的作用有限。寡糖具有更明确的结构，比多糖更容易推断出清晰的构效关系。硫酸化岩藻多糖寡糖对肠道菌群的调节也受到硫酸基团分布的影响。P . graeffei和I. badionotus的硫酸化岩藻多糖寡糖都可以通过减少厚壁菌门细菌的丰度和增加拟杆菌门细菌的丰度来逆转肠道菌群失调，尤其是在结肠菌群失衡的情况下。然而，来自I. badionotus的硫酸化岩藻多糖寡糖主要在 O-2 位硫酸化，可增加变形菌的丰度。来自P. graeffei的硫酸化岩藻多糖寡糖主要在 O-4 位硫酸化，有助于维持肠道微生物平衡。多糖的空间结构决定了其功能性。硫酸基团对这些功能性的影响可能不是直接的。硫酸基团最初可能影响硫酸化岩藻多糖的链构象，随后影响其生物活性。例如，来自P. graeffei和I. badionotus的硫酸化岩藻多糖具有相似的 Mw，但硫酸化分布模式不同。这种差异导致来自P. graeffei的硫酸化岩藻多糖采用线性构象，而来自I. badionotus的硫酸化岩藻多糖采用球形构象。因此，来自P. graeffei的硫酸化岩藻多糖在减少体重增加、逆转脂质谱方面表现出强大的效果并促进肝功能。相反，来自I. badionotus的硫酸化岩藻多糖在减少体重增加方面显示出有限的效果。硫酸化岩藻多糖的球形构象可能导致其大部分硫酸基团被包裹在链内，从而阻碍了硫酸基团与脂质调节相关蛋白质之间的相互作用，导致降血脂活性受限。相反，具有线性链构象的硫酸化岩藻多糖可能在硫酸基团和蛋白质之间建立更多的接触。上述证据表明O-4硫酸化是硫酸化岩藻多糖的关键活性部分，但在天然未修饰的硫酸化岩藻多糖中O-4硫酸化并不普遍，这意味着硫酸化岩藻多糖的修饰可能是未来应用的必要条件。此外，在研究硫酸化模式对活性的影响时，必须考虑硫酸化岩藻糖残基的特定序列。例如，来自I. badionotus和L. grisea的硫酸化岩藻多糖均由两个O-4硫酸化岩藻糖残基、一个O-2硫酸化岩藻糖残基和一个O-2,4二硫酸化岩藻糖残基组成。然而，残基的排列顺序不同，导致其抗凝作用不同。最后，在探索硫酸基团与硫酸化岩藻多糖生物活性之间的关系时，其他结构特征如Mw应该是一致的。作为生物大分子，完整的硫酸化岩藻多糖的分子量往往超过1000kDa。通过酶水解、酸水解、超声波降解、氧化降解等方法可以获得具有相同一级结构特征但分子量较低的硫酸化岩藻多糖。硫酸化岩藻多糖的分子量通常采用高效尺寸排阻色谱结合示差折光检测器（HPSEC-RID）测定，并使用葡聚糖建立标准曲线标准具有精确的 Mw。此外，HPSEC-RID 耦合多角度激光光散射检测器 (HPSEC-RID) 也已用于测定硫酸化岩藻多糖的 Mw。MALLS 检测器可直接测定分子量，无需标准曲线。生物活性研究中的 Mw 测定方法总结在表 S2 中。近年来，硫酸化岩藻多糖 Mw 对其活性的影响已被广泛探索。表3总结了硫酸化岩藻多糖分子量与生物活性的关系。分子量较低（<200 kDa）的硫酸化岩藻多糖往往具有更好的生物活性。与分子量为 247.3 kDa 的S. chloronotus硫酸化岩藻多糖相比，分子量为 113.1 kDa 的酸水解产物表现出更高的 RAW264.7 活性。与分子量为 790.8 kDa 的S. herrmanni硫酸化岩藻多糖相比，分子量为 15–16 kDa 的降解产物通过抑制 HCII 介导的凝血酶活性表现出最佳的抗凝活性与分子量 >670 kDa 的硫酸化岩藻多糖粗多糖相比，分子量为 14.3 kDa 的降解产物表现出更有效的抑制脂质积累的效果。表3.硫酸化岩藻多糖的分子量与生物活性之间的关系总结。
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硫酸化岩藻多糖分子量的降低并不一定导致活性的提高，硫酸化岩藻多糖的活性水平往往随着分子量的降低呈现先升高后降低的趋势，表明存在一个最佳分子量。郭等研究发现，在超声波降解的第一阶段， I. badionotus硫酸化岩藻多糖的抗氧化活性迅速提高，随后随着降解的进行呈现降低的趋势第一阶段抗氧化活性的先上升可能是由于低分子量的硫酸化岩藻多糖在相同质量浓度下含有更多的游离羟基；第二阶段，分子量下降较慢以及硫酸基团的丢失导致抗氧化活性下降。Zhu, Tian等人研究了不同分子量（Ht1：1567.6±34.1kDa，Ht2：498.2±8.1kDa，Ht3：195.7±12.5kDa，Ht4：98.2±5.2kDa）的H. tubulosa硫酸化岩藻多糖改善代谢性炎症的作用，抗炎作用呈现先升高后降低的趋势，其中Ht3的作用最好，可能更有利于代谢性疾病的干预。H . tubulosa硫酸化岩藻多糖对HFD诱导的雄性C57BL/6J小鼠β细胞凋亡的促进作用随分子量的降低先升高后降低，在196kDa时作用最优。刘，王，等人采用酶法制备了分子量为1380.3、524.0、182.4、110.3 kDa的T. ananas硫酸化岩藻多糖。抗脂肪生成活性随分子量的降低先升高后降低，182.4 kDa样品的活性最佳。T. ananas硫酸化岩藻多糖呈无规卷曲构象，其胃保护活性随分子量的降低而降低，但随着分子量进一步降低，链构象由卷曲变为球形，活性恢复。特别地，硫酸化岩藻多糖的降解会导致其抗凝活性降低甚至丧失。来自H. floridana的 Mw 为 443.4 kDa 的硫酸化岩藻多糖表现出强效的 APTT 延长活性。相反，Mw <11.5 kDa 的降解产物没有显示出明显的抗凝作用. 25.79 μg/mL 浓度的H. albiventer硫酸化岩藻多糖可使 APTT 加倍，而其 4.33 kDa 解聚产物在测试浓度（1–128 μg/mL）下未显示 APTT 延长。类似地， H. coluber、H. fuscopunctata和T. ananas的硫酸化岩藻多糖的抗凝活性由于分子量的降低而迅速减弱。以上证据表明硫酸化岩藻多糖的分子量与其生物活性之间并不是简单的线性关系，多数情况下，随着分子量的降低，硫酸化岩藻多糖的生物活性先逐渐升高，达到一个峰值，然后逐渐降低。说明可控地降低硫酸化岩藻多糖的分子量有利于其发挥生物活性，因为某种生物活性存在一个最佳分子量。说明制备具有特定分子量的硫酸化岩藻多糖是一个很有前景的研究方向。多层乳状液具有良好的稳定性和可控的消化吸收特性，带负电荷的多糖常作为聚电解质用于构建多层乳状液，而硫酸化岩藻多糖带强阴离子电荷，已被证实具有构建多层乳状液的潜力。研究表明，硫酸化岩藻多糖可在pH 2至6范围内吸附到酪蛋白酸钠包覆的单层乳状液上，从而提高蛋白质基单层乳状液的pH稳定性。多层乳液的稳定性和消化率受硫酸化岩藻多糖的分子量和构象影响。分子量较高的硫酸化岩藻多糖在较低浓度下即可饱和液滴表面。此外，由 2000 kDa 硫酸化岩藻多糖制成的乳液更耐 NaCl 添加，并表现出更好的长期稳定性。分子量较高的硫酸化岩藻多糖可显著提高包封脂质的初始消化率，与其他海洋多糖（如ι-卡拉胶、κ-卡拉胶和海藻酸盐）相比，以硫酸化岩藻多糖为基础构建的多层乳液在胃液阶段聚集性较低，可为酸敏感活性物质提供更好的包封效果（。用硫酸化岩藻多糖构建的多层乳液在食品基质中表现出良好的稳定性。在阿拉伯胶存在下，硫酸化岩藻多糖竞争性地吸附到单层乳液上，构建的多层乳液不会被阿拉伯胶取代。明确硫酸化岩藻多糖的结构是建立构效关系的前提条件。需要注意的是，在功能研究中直接引用以前的硫酸化岩藻多糖结构模型并不总是可行的，因为不同结构的硫酸化岩藻多糖可能存在于同一种海参中。因此，强烈建议在生物活性研究之前确定所研究物质的结构。此外，硫酸化岩藻多糖中异质片段的结构也需要进一步明确。开发灵敏、高效的硫酸化岩藻多糖结构分析策略势在必行。近年来，核酸在线测序技术和蛋白质已经成熟，形成了完善的商业市场相比之下，目前的策略严重依赖于离线且耗时的分析技术，例如NMR技术。大量硫酸基团的存在为硫酸化岩藻多糖的结构解析增加了额外的复杂性。糖组学有助于建立硫酸化岩藻多糖高效的结构分析流程。近年来，基于蛋白酶降解、LC-MS/MS分析和生物信息学分析的蛋白质组学分析流程已被证明是蛋白质定性分析的，并已实现商业化。同样，以糖苷酶降解结合LC-MS/MS和糖信息学分析为基础的糖组学分析流程在多糖领域的应用也逐渐增多。然而，由于缺乏岩藻多糖酶，难以实现对结构复杂的硫酸化岩藻多糖的彻底酶水解。岩藻多糖酶的丰度有限，与针对其他藻类多糖的糖苷水解酶（如海藻酸裂解酶、卡拉胶酶和琼脂酶）形成鲜明对比，而这些酶通常在公共数据库中非常丰富。此外，通过质谱法解析寡糖的结构也具有挑战性 为了克服硫酸化岩藻多糖结构解析，未来的研究工作应集中在三个方向。1)应发现具有新作用模式的岩藻多糖酶，并通过学术界共享或商业化使其可用；2)应建立岩藻多糖寡糖质谱数据库，应明确寡糖在质谱中的碎裂规律，并构建LC-MS/MS定性方法；3)人工智能（AI）方法已经并正在越来越多地融入糖信息学预测软件中应利用人工智能辅助糖信息学实现质谱的自动解释。硫酸化岩藻多糖作为功能性食品成分的潜力已得到充分展示，以海参多糖（硫酸化岩藻多糖和fCS的混合物）为有效成分的产品已进入市场，但高纯度、结构明确的硫酸化岩藻多糖产品或明确标注硫酸化岩藻多糖的产品尚未实现商业化，要充分发挥硫酸化岩藻多糖对消费者的营养价值，开发商业化产品是必由之路。降低成本是硫酸化岩藻多糖商业化的主要挑战之一。从高价值海参（如日本海参）中提取硫酸化岩藻多糖的成本对于制造商来说过高。相比之下，低价值海参是硫酸化岩藻多糖提取的更合适来源，代表了对低价值海参进行高值化利用的可行方法。此外，由于硫酸化岩藻多糖分布在细胞外基质中，因此在煮沸过程中容易损失。因此，从海参加工过程中产生的煮沸液中提取硫酸化岩藻多糖是一种可行的副产品利用策略。此外，这种方法还具有一定的生态效益。建立硫酸化岩藻多糖的特异性定量方法也是促进硫酸化岩藻多糖商业化的必要条件。目前，硫酸化岩藻多糖尚无准确、特异性的定量方法，给产品质量控制带来困难，阻碍了质量标准的建立。糖苷水解酶和CBM已被证明在多糖定量中发挥着良好的作用，以岩藻多糖酶和CBM为基础，建立硫酸化岩藻多糖的定量分析方法，有助于硫酸化岩藻多糖产品的质量控制。明确具有市场竞争力的硫酸化岩藻多糖的生物活性，有利于明确其产品定位，推动其商业化。虽然硫酸化岩藻多糖已被证实具有多种生物活性，但目前尚不清楚哪种生物活性最为突出，即明显优于具有该活性的典型功能成分。这导致硫酸化岩藻多糖与市场上的典型功能成分相比缺乏竞争力。有必要与其他功能成分进行比较研究，从而确定特定结构的硫酸化岩藻多糖的最佳应用场景。
近十余年来，硫酸化岩藻多糖的原位分布、结构、生物活性及构效关系研究取得了重要进展。结构方面，应从常规大分子结构域转向异质结构域，糖组学是硫酸化岩藻多糖结构分析的有效解决方案。对于大多数活性而言，适当降低硫酸化岩藻多糖的分子量有利于活性的发挥，且存在最强的Mw。硫酸基团的分布模式深刻影响着硫酸化岩藻多糖的生理活性，在比较不同硫酸基团分布的硫酸化岩藻多糖的生理活性时，需保证Mw的一致性。需要努力推动硫酸化岩藻多糖的商业化发展，重点是降低成本，建立具体的定量方法，探索竞争性生物活性。此外，岩藻多糖酶和CBMs的利用对促进硫酸化岩藻多糖的研究和开发具有重要意义。
原文：A comprehensive review of sulfated fucan from sea cucumber: Antecedent and prospectDOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122345
