PULDB用于褐藻胶利用，在Bacteroides eggerthii DSM 20967（以后称为B. eggerthii）中确定了预测的PUL(图2)，该PUL编码参与多糖利用的蛋白质，即 PL6和PL17家族的多糖裂解酶——据推测作用于褐藻胶，推定是SusC(SusCH)和SusD(SusDH)的同源物，一个主要促进子超家族(MFS)转运蛋白、一个GntR转录调节因子、一个20家族(CE20)的碳水化合物酯酶和四个标记为功能未知的基因Unk1−Unk4。Unk3基因编码来自小肠结肠炎耶尔森菌和盐单胞菌的KdgF样酶的同源物，催化果胶和褐藻胶多糖裂解酶释放Δ的线性化。与UniProt 数据库最接近的BLAST命中B. eggerthii PUL中的基因列在表1.如上所述，该PUL的较短版本之前被描述为编码图2中的10种蛋白质的六个（KdgF、PL17_2、SusCH，SusDH、Unk4/CE20和PL6_1)，据报道，PL17成员具有polyM特异性和外作用。两种预测的褐藻胶裂解酶分别属于PL6和PL17最常见的亚家族1和2。正如BLAST搜索家族所告知的那样，PL6含有少量软骨素裂解酶，首先在该家族中被发现，但根据CAZy数据库绝大多数表征的PL6成员是褐藻胶裂解酶根据SignalP，BePL6和BePL17以及SusCH、SusDH和CE20都含有信号肽，并被认为是分泌到质周间隙或外膜。三个预测蛋白MFS、SusCH和Unk4含有跨膜片段。虽然Unk3被鉴定为BeKdgF，但Unk1、Unk2和Unk4蛋白的同源物在PULDB中没有被赋予假定的功能，但与CE20家族的两种还原酶和碳水化合物酯酶显示出> 40%的序列相似性(表1)。最近报道了一种来自植物致病性细菌的CE20酯酶催化木葡聚糖的去乙酰化，木葡聚糖被认为是一种膳食纤维。![]()
图2.蛋拟杆菌DSM 20697和卵形拟杆菌CP926的多糖利用位点。B. eggerthii PUL(上)似乎参与褐藻胶的代谢。它跨越10个基因(位点标记BACEGG_03245-03254)，预计编码一个用于碳水化合物结合和运输的特征SusCH/SusDH复合物，两个PL6亚家族1 (PL6_1)和PL17亚家族2 (PL17_2)的褐藻胶裂解酶，以及PULDB中的一个KdgF样酶(注释为Unk3)。根据PULDB(另见表1)，每个基因上面都有卵形双球菌的PUL位点标签。蛋白质下面显示了与卵形双球菌CP926(底部)同源蛋白的序列一致性，每个基因下面列出了GenBank登录号。同源基因由灰色条连接。
表1卵形拟杆菌DSM 20697中PUL编码的基因。利用BLAST显示了B. eggerthii中海褐藻胶降解PUL编码的10个蛋白的推测功能。
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其他几种PULs也含有编码PL6、PL17和KdgF的基因；然而，目前在PULDB中没有明确注释KdgF酶。最近发现的新分离物卵泡B. ovatus CP926，目前不在PULDB中，包含这样一个PUL(图2)。已知的PULs标志是存在于卵泡B. egggerthii和卵泡B. ovatus CP926 PULs中的SusCH和SusDH转运体复合体，此外还有GntR，一种FadR家族转录调节因子。SusCH和SusDH在PULs中共定位，序列一致性分别为36.12%和31.81%(图2)，而GntR调控子序列一致性为40.85%。KdgF、MFS和Unk2在两种细菌中共定位，序列同源性分别为62.83%、76.12%和78.00%。这两种细菌编码的多糖裂解酶在PL6_1亚科和PL17_2亚科分别具有49.24%和48.85%的同源性。然而，这些PL基因仅在卵形芽孢杆CP926中共定位。值得注意的是，B. ovatus CP926的PUL比B. eggerthii的PUL多编码两种蛋白质，即多特异性的PL38褐藻胶裂解酶和一种功能未知的蛋白，未发现同源物。2.B.eggerthii生长在由海洋内作用褐藻胶裂解酶原位产生的AOS上B. eggerthii既不以褐藻胶作为唯一碳源生长，也不将其自身重组产生的两种褐藻胶裂解酶BePL6和BePL17添加到培养基中(图3A)。某些细菌编码一种假定分泌的内作用褐藻胶裂解酶，释放通过SusCH/SusDH复合物运输到质周空间的AOS。然而，B. eggerthii DSM 20697似乎缺乏胞外内切褐藻胶裂解酶，可能依赖于HGM中初级褐藻胶降解菌产生的AOSs。事实上，添加来自海洋细菌鞘胺醇单胞菌菌株A1中非常有效的内切酶A1-I，主要产生DP2-4的AOSs (图S1)，使B. eggerthii在以褐藻胶为唯一碳源的培养基上生长良好(图3B)。值得注意的是，这种培养，尽管延滞期比葡萄糖长，但在9小时后产生了相当的OD600值(图3B)，并充分利用了底物。![]()
图3.埃氏拟杆菌DSM 20697的增长。a )将(37℃, O/N为1)接种于0.5%褐藻胶或0.5 %葡萄糖培养基上，不添加和添加100 nM BePL6和BePL17，单独或联合添加。B )在不添加和添加100 n M鞘氨醇单胞菌A1-I的0.5%褐藻胶培养基上生长。A1-I。以0.5%葡萄糖和无碳源培养分别作为阳性和阴性对照。在600 nm处测量的生长( 3次重复)被绘制为具有标准偏差(对几种测量的误差条和平均重叠度)的平均值。
3.BePL6和BePL17褐藻胶裂解酶的重组制备及生化特性研究大约50 %的PL6家族成员具有两个平行的右手β-螺旋结构域，其中N端对应于其余约50 %的单结构域PL6成员，并携带活性位点。BePL6是一个双结构域酶。C-末端结构域的作用尚不清楚，但它被认为对底物的可及性和与活性位点的结合很重要。PL17酶具有(α/α)6环+反平行β折叠，其中(α/α)6环结构域包含活性位点。重组生产的BePL6 (21 mg · L-1)和BePL17 (19 mg · L-1)均获得了较好的产量。Be PL6和Be PL17在SDS-PAGE中分别以约80和75 k Da的单一条带迁移。经HiLoad Superdex 200 pg 16/600凝胶体积排阻层析洗脱表明，在溶液(数据未显示)中，BePL6为单体，BePL17为二聚体。其他PL17酶在溶液中也显示为二聚体。然而，PL6酶不同，因此BcAlyPL6是一个单体，而另外两个双结构域PL6酶，AlyGC和Patl3640是二聚体。BePL6对褐藻胶的最适pH为7-9，在pH 8.0时有最大活性(图4A)，并且不需要NaCl的存在(图4B)。在pH 4时活性完全丧失，在0.4 M NaCl中仅剩4 % (图4B)。Be PL17具有较窄的pH-活性谱，在pH 6.8 (图4A)和0.1 M NaCl (图4B)时达到最大值。在pH 4.0时没有活性，在pH 5-6时仅剩8 %的活性(图4A)。不加NaCl和0.4 M NaCl分别保留3 %和6 %的活性(图4B)。BePL6和BePL17的熔点(Tm)分别为48.5℃和51.0℃。![]()
图4.BePL6和BePL17活性的pH和NaCl依赖性。在37℃下，200 nM BePL6和100 nM BePL17对2 mg mL-1褐藻胶的相对活性。A)在20 mM UB4缓冲液(90)中pH为4.0 ~ 9.0;B)在20 mM HEPES中，pH为0.0~0.4 M NaCl，pH分别为8.0和6.8,BePL6(圆形)和BePL17(三角形)。样本一式三份，以平均值±SD表示。
BePL6催化降解褐藻胶和polyG，对polyG有明显的偏好性，对polyM没有活性(图5A)。该反应符合Michaelis-Menten动力学，polyG的kcat = 12.3 ± 0.1 s-1是褐藻胶的5倍，而polyG和褐藻胶的Km值分别为2.2 ± 0.05 mg m L-1和2.8 ± 0.2 mg m L-1 (表2)。根据Michaelis-Menten动力学模型，BePL17降解褐藻胶、polyG和polyM，其中polyM的kcat = 50.9 ± 0.8 s-1，Km = 1.1 ± 0.07 mg m L-1，催化效率( kcat / Km)分别是褐藻胶和polyG的8倍和17倍。观察到的polyG低活性可能源于底物中7 % M残基的反应，而不是polyG部分的降解。Be PL6降解polyG的时间进程首先表现为235 nm处吸光度的增加，监测4,5-不饱和单醛酸产物的形成，随后从10 min左右开始下降(图5A )。235 nm处吸光度的损失是由于释放的Δ自发开环和收缩引起的，LC-ESI-MS证实其形成为DP1(图5B)。大约50分钟后，235 nm处的吸光度(图5A)保持至少4小时(数据未显示)。这一行为表明同时形成了Δ和不饱和AOS，LC-ESI-MS鉴定了DP2-9的AOS，在60 min时，DP5和DP6占主导地位且未下降(图5B)。在1 h的反应过程中，polyG对DP2-9不饱和AOS的降解强度没有降低，因此BePL6似乎没有降解这些AOS。因此，我们怀疑少量的DP1是由比DP9更长的低聚糖或多糖产生的。从褐藻胶中，BePL6释放出越来越多的DP1和DP2-9的AOS(图S5A)，表明可达G块的降解。因此，BePL6表现出一定的外作用释放Δ，而AOS可能通过外作用和/或内作用释放。LC-ESI-MS证实了分光光度法测定表明BePL6不降解polyM(数据未显示)。![]()
图5.BePL6和BePL17的特异性和作用方式。A) 0.38 mg mL-1褐藻胶、polyG和polyM与100 nm BePL6孵育在235 nm处的吸光度进展。B) LC-ESI-MS测定5 mg mL-1 polyG 100 nM BePL6产物形成。C)用100 nm BePL17孵育0.38 mg mL-1褐藻胶、polyG和polyM在235 nm处的吸光度进展。D) LC-ESI-MS测定5 mg mL-1 polyM的100 nM BePL17产物形成。实验条件：50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.7。样品作为单个样品运行，没有技术复制。
表2 BePL6和BePL17在褐藻胶、polyM和polyG上的动力学参数
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BePL17将polyM降解为Δ，从最初的增加中可以看出，随后大约10分钟在235 nm处吸光度下降，这被认为是由于Δ的环打开和收缩造成的(图5C)。60分钟后在235 nm处的极低吸光度表明，LC-ESI-MS证实，只有微量的不饱和AOS持续存在(图5D)。不饱和DP2略有增加，但DP3-9被消耗。因此，BePL17将DP3和更长的AOS降解为Δ。值得注意的是，DP2似乎没有退化。BePL17对聚g和褐藻胶的活性很低。由于polyG是由海藻酸酯外聚酶催化polyM转化而成的，因此在polyG末端发现了残留的M残基，这可能导致BePL17在该底物上的活性明显较低。同样，对褐藻胶的低活性可能源于多糖末端M-块的降解(图5C)。因此，对AOS产品的LC-ESI-MS分析显示，polyG和褐藻胶的DP1含量有非常轻微的增加。4.KdgF样酶BeKdgF的重组生产及生化特性研究编码KdgF样酶的基因广泛分布于细菌和古细菌的不同门。因此，从NCBI聚类数据库(MM2Seq聚类率为90%)中检索到3509个序列(2022年7月5日)，e值低于10-5。BeKdgF与HaKdgF和YeKdgF分别具有41.23%和45.95%的序列同源性，而HaKdgF和YeKdgF是仅有的两种已知的KdgF样酶。这激发了目前BeKdgF的重组生产和表征，BeKdgF获得了良好的产量(59 mg L-1)，并在SDS-PAGE上以10到15 kDa的单带迁移，与理论分子质量14137 Da一致。SEC-MALS分析表明，BeKdgF在溶液中寡聚为两种分子质量分别为57.5±0.5和26.3±0.3 kDa，对应于由6.5%四聚体和93.5%二聚体代表的平衡。通过X-射线晶体学鉴定了BeKdgF的这两种寡聚状态，并通过NMR谱的蛋白质动力学证实了二聚体的存在(见下文)。BePL6和BePL17释放的4,5-不饱和脲酸盐Δ作用于polyG、polyM和褐藻胶(图5A,C)，自发开环，这似乎是碱催化的，从pH>5时反应速率的显著增加可以证明(图6)。因此，Δ(化合物1，图7)向DEH开环类似于碱催化的突变。DEH中间体是短寿命的，没有被NMR检测到，并立即发生烯醇-酮异构化和水合成DEH醛水合(化合物2)和酮醛水合(化合物5)。无法监测到异构化和水合发生的顺序，因为只观察到这两个反应的产物(化合物2)，以及化合物3、4和5，其中化合物2处于平衡状态。化合物3和4占主导地位，它们是由OH-2攻击化合物2的5-酮基团形成的环化(收缩)形成的，导致形成两个呋喃苷，(5S)-DHF水合物和(5R)-DHF水合物(化合物3和4)(图7)。注意，在这个自发反应中，第一步是限制速率的，因此在235 nm处吸光度的损失可以直接与化合物1的转化有关。此外，请注意，在酸性条件下，发生另一种机制，导致形成不饱和的5-甲酰基-2-呋喃酸。![]()
图6.pH值对Δ自发转化率的影响。Δ的开环、互变异构、水化和收缩(见图7)在pH值低于5时大大减缓，在pH > 7时显著增加。样本一式三份，并以平均值±SD表示(对于几个测量误差条和平均值重叠)。
在pH 4时Δ的自发转化率<0.005 min-1，在pH 8时为0.13 min-1(图6)。因此，在BePL17从polyM中释放Δ后调整到pH 3，由于Δ的自发转化率降低，确保了已知的Δ浓度。以该Δ为底物，在p H 7.7条件下，0-200 μM BeKdgF催化约250 μM Δ的转化率呈剂量依赖性增加(图8A)。通过比较235nm处吸光度下降的半衰期和速率常数，我们观察到BeKdgF催化的反应伴随着235nm处吸光度的下降，这里与开环和化合物2的变异构化有关(图7)。酶催化的反应发生的速率比相应的自发反应高8倍(图8B)，其速率确定为0.05 min-1，如图[BeKdgF] = 0(图8B)所示。BeKdgF的活性随后被确定为作为[BeKdgF]函数的速率斜率，这解释了自发转化Δ引起的背景反应的贡献。![]()
图7.碱催化的开环收缩Δ。反应方案显示了Δ(化合物1)自发发生的预期反应。O2用红色表示。所显示的结构与Arntzen等人和Hobbs等人的核磁共振光谱所描述的自发线性化、互变异构化、水化和缩合的机制一致。DEH中间体寿命很短，没有被核磁共振检测到，但水合形成DEH(4-脱氧-L-赤-5-己糖脲酸酯)的酮醛水合(化合物5)和醛水合(化合物2)，后者缩合成化合物3和4。
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图8.BeKdgF催化Δ的转化。A)从0到200 nM，将BeKdgF直接添加到底物Δ中，估计浓度为250µM，在50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.7中，由100 nM BePL17形成0.5 mg mL-1 polyM(在235 nM处吸光度变化达到平台的时间点)。B)对a中得到的数据拟合一相衰变模型计算的半衰期和速率常数。
BeKdgF似乎具有相当广泛的pH活性依赖性，在pH 7左右最大(图9A)。与BeKdgF(图9A)相似，不同缓冲成分的广泛活性最优值和不同的效果，已经报道了cupin超家族的其他酶。![]()
图9.BeKdgF pH优化及动力学研究。A)在三种酶浓度(0、10和30 nM BeKdgF)下测定比活性，如实验程序所述，在pH 5.5-7.0、50 mM MES、150 mM NaCl(圆形)和pH 6.5-8.0、50 mM HEPES、150 mM NaCl(方形)条件下测定比活性。B)Δ上20 nM BeKdgF在50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0条件下的Michaelis-Menten图。C)反应速率与低Δ浓度的线性拟合，产生kcat/Km = 0.08µM-1 s-1。样本一式三份，以平均值±SD表示。
对于BeKdgF而言，尽管Δ在相关测定条件下缺乏稳健的稳定性，无法进行非常准确的分析，但通过降低pH来控制Δ的可用性，使得估计动力学参数成为可能(图9B)。虽然未达到BeKdgF的底物饱和，但通过实验数据( R2 = 0.96)与Michaelis-Menten方程拟合得到参数kcat = 121.2 ± 42.1 s-1，Km = 1.14 ± 0.56 mM，kcat/Km = 0.11μM-1 s-1，与低底物浓度下由线性关系确定的二级表观常数= 0.08μM-1 s-1吻合较好(图9C)。用50 mM EDTA预处理BeKdgF (BeKdgF-EDTA)导致其对Δ的活性降低约50%(图10A)，不同于经EDTA处理后失去所有活性的果胶溶性YeKdgF。值得注意的是，在BeKdgF检测混合物中添加0.1-1 mM EDTA，使重组酶的活性降低到10-25%(图10A)。目前尚不清楚BeKdgF的活性丧失是否仅仅源于原位阳离子的消除，还是由于EDTA与活性位点的结合而抑制了BeKdgF。此外，在0.1-1 mM EDTA存在下，Δ的自发转化率被抑制了50-95%(图10A)。Zn2+和Co2+分别使经EDTA预处理的BeKdgF活性提高了2.6倍和3.0倍，而所有其他测试金属的活性都提高了1.5-1.9倍(图10B)。金属离子同样增加了YeKdgF和HaKdgF的活性，尽管略有不同。值得注意的是，BeKdgF表现出良好的稳定性，在edta处理后，加入Ni2+、Co2+或Zn2+，将Tm分别从56.2℃显著提高到73.9℃、67.4℃和66.8℃，Ni2+的提高幅度达到17.6℃(图10C)。虽然Zn2+和Co2+对BeKdgF活性的刺激最大(图10B)，但我们研究了用Zn2+滴定BeKdgF的方法，因为锌具有更强的生物学相关性，并且存在于相似的蛋白质中，例如cupin家族的不同酶。值得注意的是，增加Zn2+至1 mM导致BeKdgFEDTA活性提高5倍(图10D)。![]()
图10.BeKdgF、EDTA处理和添加二价金属离子的活性和稳定性。A) 100 nM BeKdgF在498µM Δ上的背景校正活性(BeKdgF)前，用50 mM EDTA (BeKdgF-EDTA)预处理后，随后在分析混合物中加入0.1-1 mM EDTA(红色)。无酶反应498µM Δ添加和不添加0.1−1 mM EDTA(蓝色)。B) 100 nM BeKdgF在348µM Δ上经50 mM EDTA (BeKdgF-EDTA)预处理并随后加入1 mM二价金属离子前后的活性。C)添加1 mM二价金属离子前后，BeKdgF和BeKdgF- EDTA的Tm为130µM。D) 0 ~ 1 mM Zn2+下的活性(BeKdgF-EDTA归一化)。E) 0~1 mM Zn2+下BeKdgF的Tm。所有实验均在20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0条件下进行。样本一式三份，以平均值±SD表示。
我们认为EDTA的相互作用是复杂的，数据代表了i)EDTA在活性位点结合的综合效应，类似于在YeKdgF，HaKdgF和BeKdgF三种不同的KdgF晶体结构中发现的丙二酸盐，柠檬酸盐或甘油，EDTA以这种方式作为抑制剂，ii)通过EDTA螯合去除金属，iii) EDTA抑制Δ的自发转化。由于与底物生产、稳定性和酶活性测定相关的固有并发症，我们没有继续研究这些个体效应。结晶条件的筛选分别得到了衍射良好的重组BeKdgF (Be Kdg F-Ca) (PDB：7ZYB)和加入Zn Cl2 (BeKdgF-Zn) (PDB：7ZYC)重组的EDTA去除的BeKdgF (BeKdgF-Zn) (PDB：7ZYC)的1.5 Å和2.0 Å分辨率的数据集。以最近的同源物YeKdgF (PDB : 5FPX ,与BeKdgF有46 %的序列一致性)中的一个单体为搜索模型，通过分子置换的方法进行结构解析，得到BeKdgF-Ca和BeKdgF-Zn两个相似模型，Rfree分别为20.08 % 和25.97 %。两个结构在不对称单元中都有一个原体，BeKdgF-Ca的马修斯系数为1.89，BeKdgF-Zn的马修斯系数为1.84。这些结构表现出典型的β桶装结构Cupin折叠，与YeKdgF和HaKdgF的结构非常相似。PISA服务器预测的BeKdgF的二聚体组装(图11A)与YeKdgF和HaKdgF (PDB: 5FQ0)具有相同的二聚体界面。在BeKdgF的活性位点，电子密度很好地模拟了甘油分子(图11A,B)，它比YeKdgF中观察到的丙二酸盐分子稍微深入活性位点。YeKdgF中的残基(Asp100、Phe102和Arg106)被认为对催化作用很重要，在BeKdgF中与Asp102、Phe104和Arg108一样保守，并且结构取向与同源物非常相似(图11D)。在这两种BeKdgF结构中，在YeKdgF活性位点模拟Ni2+的位置大致相同的位置观察到金属离子对应的电子密度(图11D)。![]()
图11.BeKdgF晶体结构。A) BeKdgF-Zn二聚体的整体结构，突出显示甘油分子和金属结合残基。B)活性位点残基(绿色和鲑鱼棒)。C)金属诱导四聚体的组织。D)比较YeKdgF(灰色)和BeKdgF(鲑鱼)活性所需的保守催化重要残基，以及保守的金属配位残基(BeKdgF His50, His52, Glu56和His90)。甘油以黑色实心棒表示。
我们进一步研究了BeKdgF的金属结合位点，因为生化数据表明其活性不像YeKdgF那样严格依赖金属离子(图10A)。在BeKdgF结构中，金属离子被建模为Ca2+，这是存在于结晶条件下的，与适当的细化统计相一致，而对于BeKdgF-Zn的结构，金属被建模为Zn2+，也揭示了更明确的电子密度。优化占用率后，Ca2+和Zn2+的占用率分别为50%和80%，而同源YeKdgF中的Ni2+的占用率为100%。配位金属的残基是保守的，包含三个组氨酸和一个谷氨酰胺，形成与所测二价阳离子兼容的八面体结合几何结构(图11D)。与YeKdgF和HaKdgF这两种同源物相比，BeKdgF的金属占比较低，这可能也是BeKdgF的一个显著特征，生化数据表明，与YeKdgF和HaKdgF相比，BeKdgF中金属配体的B因子较高。BeKdgF的另一个发现是电子密度的存在，表明在结构的外部有一个金属离子，由Glu33协调，引发了四聚体(二聚体的二聚体)的形成(图11C)，这在两个同源物中没有报道。用核磁共振波谱法研究了BeKdgF在水溶液中的结构。二级结构主要为β-片，与晶体结构一致。通过测量该蛋白的15N T1和15N T2松弛时间以及{1H}15N NOEs对BeKdgF进行动态分析表明，该蛋白在C和N端具有更大的柔韧性。根据T1和T2计算BeKdgF的旋转相关时间τc，τc = 15.3 ns±0.7 ns。球状蛋白具有质量分布，其旋转相关时间τc约为其分子量的0.6倍。对于BeKdgF，这表明溶液中的二聚体状态，因为翻滚适合25±1.2 kDa的蛋白质。在pH 4.15-8.02范围内进行pH滴定，在15步滴定的每个点记录15N HSQC光谱(图12)。在这里，通过将化学位移变化作为pH的函数拟合到Henderson-Hasselbalch方程，确定活性位点残基Asp102的pKa为5.9±0.1。这与Asp102被认为是催化底物有很好的相关性。在pH范围内滴定的其他6个残基也可以测量pKa值，但这些残基并不位于活性位点。在pH 8.0以上和pH 4.2以下不可能进行此滴定。![]()
图12.BeKdgF活性位点残基Asp102的pH滴定。利用NH化学位移(15N)作为pH的函数，对Asp102进行滴定。利用Henderson-Hasselbalch方程，计算出pKa为5.9±0.1。
9.BePL6、BePL17和BeKdgF协同降解褐藻胶关于B. eggerthii对褐藻胶的利用，研究了BePL6、BePL17和BeKdgF在三种酶各100 nM的协同作用(图13A)。此外，为了与模拟交叉饲养的应用培养条件相关联，还测定了添加100 nM Sphingomonas sp. A1的A1- i内作用褐藻胶裂解酶的效果，该酶产生的AOS主要为DP2−4(图13B和S1)。在50 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.7条件下，测定0.5 mg mL-1褐藻胶在235 nm处的吸光度变化。单独使用BePL6在235 nm处吸光度小幅增加后缓慢下降，而BePL17则表现出较高的初始增加后快速下降的趋势。正如预期的那样，单独的BeKdgF对褐藻胶没有活性。这两种酶结合在一起导致了最高的协同降解，因为这超过了BePL6和BePL17单独作用的加性效应(图13A)。值得注意的是，将这两种裂解酶与BeKdgF联合使用大大降低了BePL17单独产生的235 nm处的初始吸光度，而BeKdgF与BePL6联合使用的效果与单独使用BePL6的效果几乎没有区别(图13A)，这反映出BePL6形成的是AOSs，而不是由BePL17产生的4,5不饱和单酸盐Δ，后者是BeKdgF的底物。这和所有三种酶的联合反应表明，与单独使用BePL6时一样，裂解酶的产物也会持续存在一个浅平台期，因此裂解酶的产物并没有全部转化为Δ。加入非常高效的内溶酶A1-I后，褐藻胶的产率大大提高(图13B)，而且，当所有四种酶存在4小时后，235 nm处的吸光度仍然下降，表明继续降解，并有一些释放，随后开环和Δ缩合。在235 nm处，BePL17的吸光度先是快速上升，然后又快速下降，这表明BePL17的外显作用产生Δ。当BePL6和A1-I存在时，与不含BePL6的BePL17和A1-I反应相比，在235 nm处吸光度损失缓慢但略快，从而导致开环和Δ缩合(图13B)。这可能反映了BePL17对A1-I形成的一些AOS的降解能力相对较差。![]()
图13.褐藻酸乙酯降解酶的协同作用。在50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.7条件下，每种酶分别用100 nM单独或不同组合降解褐藻胶(0.5 mg mL-1)。A) BeKdgF, BePl6, BePL17和B)与A)结合来自Sphingomonas sp. A1的100 nM A1-I酶相同。样本一式三份，这里表示为数据点的平均值。
虽然BePL6和BePL17这两种褐藻胶裂解酶能够降解褐藻胶，但由于B. eggerthii不编码胞外内作用的褐藻胶裂解酶，它依赖于其他细菌从褐藻胶中释放的AOS，这是HGM成员的一种合作作用，称为交叉喂养。有充分的证据表明，微生物群落代表了一个复杂的不同相互作用的网络。然而，关于B. eggerthii和其他HGM成员之间潜在的交互共生在褐藻胶降解中的研究超出了目前的研究范围。根据以前的报道，SusCH/SusDH系统结合和运输的是低聚糖而不是多糖。BePL6和BePL17都含有信号肽，最有可能位于质周间隙，并且在B中缺乏胞外褐藻胶裂解酶。卵磷脂被认为是它不能在褐藻胶上生长的原因。卵泡B. ovatus CP926的PUL比卵泡B. eggerthii的PUL多编码两个蛋白质，其中最重要的是多特异性褐藻胶裂解酶BoPL38，这似乎是卵泡B. ovatus CP926能够以褐藻胶作为唯一碳源生长的原因，而不像卵泡B. eggerthii。值得注意的是，在删除编码外表面糖苷水解酶的基因后，肠道微生物拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)无法在这些多糖上生长，因为它既可以利用支链淀粉，也可以利用levan。同样的研究表明，并非所有的生物都是如此，因为从卵圆虫的菊粉利用位点上删除两个外表面糖苷水解酶并不会导致菊粉的生长损失。值得注意的是，卵形芽孢杆菌的这种缺失降低了以菊粉分解产物生长但不能利用菊粉的普通拟杆菌的交叉取食能力。BePL6、BePL17和BeKdgF对褐藻胶的协同降解是明显的，这与两种能够释放Δ的褐藻胶酶各自的底物特异性是一致的。BePL6产生AOS，而BePL17似乎只以外显模式作用，释放Δ。如预期的那样，添加非常高效的内作用A1-I显著提高了褐藻胶的降解效率。因此，虽然BePL6、BePL17和BeKdgF一起降解褐藻胶的能力很差，但来自海洋细菌鞘单胞菌菌株A1的重组A1-I褐藻胶裂解酶产生的AOSs的供应确保了褐藻胶的利用，可能模拟了肠道内的交叉摄食。值得注意的是，将重组BePL6和BePL17添加到B. eggerthii DSM 20697培养基中并没有导致生长，可能是因为这些酶对褐藻胶的活性分别比A1-I低约25-10倍(图13)。此外，A1I从褐藻胶中释放的DP2−4的AOS可能比BePL6形成的DP5−7的aos更容易被B. eggerthii DSM 20697利用。4小时后，含有A1-I的酶组合仍然形成Δ，当BePL6、BePL17和BeKdgF这三种酶同时存在时，Δ的形成最为强烈，这表明褐藻胶发生了持续且可能完全的降解。这是之前通过将Vibrio sp. SY08的内作用酶AlySY08与来自Cellulophaga sp. SY116的两种外作用酶(OalC6和OalC17)混合在一起观察到的海洋细菌酶，将褐藻胶降解为单糖的效率提高了84%。根据PULDB， 180个PULs具有PL6和PL17的组合，以及没有其他PLs的组合，表明在其他生物中可以看到相当广泛的组合。这包括一个较短版本的卵黄芽孢杆菌PUL，跨越6个而不是10个基因在目前的工作中发现的PUL；两个PUL版本都编码PL6和PL17酶。然而，目前尚不清楚在PULDB中这些PULs中有多少酶参与褐藻胶的分解和利用。因此，尽管PL6和PL17的共存相对常见，但它们的合作尚未得到详细研究。但有研究报道，来自海洋细菌噬纤维菌属sp .的poly G活性PL6和poly M活性PL17的组合。SY116在褐藻胶上的活性比两种酶的活性之和提高了150 %。同时发现噬纤维菌属sp. SY116选择性地作用于褐藻胶，该工作既没有报道生长数据，也没有报道基因组中存在其他预测的褐藻胶裂解酶。噬纤维菌属sp. SY116只有一个PL6和一个PL17酶，因此似乎能够利用褐藻胶。此外，来自海洋真菌Paradrendryphiela salina的PL8和PL7家族的内切和外切褐藻胶裂解酶协同促进褐藻胶降解。PL17家族的褐藻胶裂解酶通常被认为是外显作用的，对M区有很强的偏好。事实上，在PL17家族酶的系统发育定位和筛选中，据报道，B. eggerthii PL17是外显作用的和M特异性的，但没有更详细的表征。相比之下，PL6家族涵盖了几种作用模式和特异性，包括褐藻胶和硫酸软骨素。大多数PL6成员以内模作用，倾向于G块，尽管有报道称来自肠道细菌拟杆菌(Bacteroides cellulosilyticus)的BcelPL6具有M块特异性。BePL6的kcat值为12.3±0.1 s-1，与其他具有多G活性的PL6酶相比，BePL6对polyG(其首选底物)的活性中至低。来自Shewanella sp. Kz7的OalS6的kcat值为38 s-1，来自Cellulophaga sp. SY116的OalC6的kcat值为109 s-1。此外，尽管BePL17在其首选底物polyM上表现出高活性，kcat为50.9±0.8 s-1，但其他具有polyM活性的PL17酶的活性比BePL17高2.5倍和1.8倍。之前仅有2个KdgF酶被鉴定，分别是来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的果胶酶位点的YeKdgF和来自盐单胞菌的褐藻胶酶位点的HaKdgF，它们对褐藻胶来源的4,5 -不饱和单糖醛酸的作用速率相当。BeKdgF未被检测到4,5 -不饱和半乳糖醛酸，但与YeKdgF和HaKdgF分别具有45.95 %和41.23 %的序列一致性和非常相似的结构特征。然而，虽然YeKdgF的活性被证明严格依赖于金属离子，但BeKdgF的活性并没有被50 mM EDTA预处理或即使在检测混合物中存在0-1 m M EDTA时完全消除。值得注意的是，与YeKdgF类似，添加金属离子使酶活提高了3倍，BeKdgF添加金属离子使酶活提高了2.8倍。由于4,5-不饱和单糖醛酸的自发转化率较高，Hobbs等在甘露糖醛酸二糖和Digalacturonate的特异性裂解酶原位生成的底物上测定活性，而不是直接在纯的4,5-不饱和单糖醛酸上测定活性。为了克服这个缺点，我们将BePL17产生的Δ调节到pH 3，抑制了自发转化，并首次估计了KdgF酶的动力学参数，这将有助于未来KdgF的表征。BeKdgF的作用机制还有一些未知，包括金属离子的可能参与，哪些步骤实际上是由酶催化的，哪些是自发的，催化残基的鉴定，以及详细的分子机制。金属离子可能对BeKdgF的活性有一定的影响，尽管EDTA预处理并不能完全灭活BeKdgF，而且在实验过程中也没有EDTA的存在。值得注意的是，无法区分EDTA去除与BeKdgF结合的金属离子所产生的影响与EDTA作为抑制剂与活性位点结合所产生的影响，并且考虑到EDTA抑制Δ的自发转化。不同的金属离子适度地增加BeKdgF的活性，从1.6倍到3倍，这取决于金属(图10B)。再加上金属对BeKdgF稳定性的强烈影响，这可能暗示这种对活性的影响更大程度上是由于对结构的影响，而不是金属直接参与分子事件。考虑到不同的刺激金属离子所观察到的相对较小的差异，如果有直接参与，它对催化作用的贡献很小。由于Δ开环在235 nm处的吸光度损失取决于酶的浓度(图8A)，因此这一步是酶催化的。在酶催化和自发转化中观察到的呋喃苷(5S)-DHF水合物和(5R)DHF水合物的比例相同，这表明KdgF酶不催化DEH水合物收缩成呋喃苷(图7)。问题仍然是酶是否只催化开环，或者还催化随后的重异构化，如Hobbs等人和/或水合作用。两种情况都有可能，但我们倾向于最简单的一种，即它只催化开环。由于随后的反应速度太快，即使没有酶催化也无法观察到，因此用实验证明酶能加速反应速度是有问题的。由于自发反应是由氢氧阴离子有效催化的(图6)，我们认为KdgF酶通过类似的碱催化机制起作用。因此，单一的催化残渣作为酸碱就足够了。我们通过结构证据(图14A,B)，核磁共振pKa测量，酶的pH活性谱和早期的突变研究来支持Asp102作为这种一般酸碱。事实上，YeKdgF的同源Asp100Ala突变体导致其完全丧失活性。此外，Asp102的羧酸基团的pKa为5.9(图12)，与BeKdgF对D的活性在pH约7时的最佳值一致(图9A)。没有其他残基具有pKa约为6的可电离基团，最接近的是Asp110和Glu66, pKaof分别为5.5和5.6，它们都位于远离活性位点的位置。虽然Δ的不稳定性阻止了共结晶，但我们在BeKdgF结构中观察到的甘油位置对D进行了建模和改进(图14B)。模拟的Δ的C1、O1、C2和O2在BeKdgF的晶体结构中与甘油分子叠加良好(图14A,B)。在HaKdgF结构的活性位点(两个碳PDB 5FQ0之间<0.3 Å)， Δ分子的羧酸盐也与柠檬酸盐的羧酸盐基团重叠良好，面临着Arg108或最终金属阳离子的潜在电荷稳定。值得注意的是，模拟的Δ分子在活性位点内没有显示出空间冲突，并且在涉及Asp102的碱基催化反应中表现出完美的状态。事实上，在该模型配合物中，异头O1和环内O5氧与Asp102羧酸盐之间的距离分别为3.1和2.9 Å。总之，这些突变、结构、动力学和NMR的pH滴定结果使我们假设Asp102在Be Kdg F中充当催化碱。由此提出了Be Kdg F催化开环形成线性化醛(DEH)的简单酶促机理(图14C)，该醛离开活性位点，发生酮-烯醇互变异构后水合环化形成呋喃糖型(图7)。![]()
图14.提出的BeKdgF机制。A)活性位点用所提出的催化酸/碱Asp102和Arg108表示，它与配位锌/金属离子(紫色球体)结合，通过电荷中和作用稳定过渡态。甘油分子如图所示(黑色实心棒)。B)通过BeKdgF中甘油分子(固体黑色棒)的实验电子密度建模和精炼的Δ分子(透明灰色棒)的表示。Arg108和Asp102在绿色棒中，其他相关残基在鲑鱼棒中，金属离子为紫色球体。C)提出的bekdgf催化Δ开环生成DEH的简单机理方案，DEH经互变异构/水化缩聚，如图7所示。
