《APPL ENVIRON MICROB》一株高效降解褐藻胶弧菌中多种褐藻胶裂解酶的特性及其降解策略
文摘
科学
2024-10-03 02:39
江苏
2022年10月，来自中国海洋大学的Xinxin He等人在Applied and Environmental Microbiology上发表了一篇题为Characterization of Multiple Alginate Lyases in a Highly Efficient Alginate-Degrading Vibrio Strain and Its Degradation Strategy的研究性论文。
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通讯单位：Frontiers Science Center for Deep Ocean Multispheres and Earth System & College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao, China
Abstract
褐藻胶是海洋中重要的多糖，支撑着海洋微生物的生长。许多分布广泛的弧菌都具有褐藻胶裂解酶，可以利用褐藻胶作为碳源，但具体的褐藻胶在弧菌中的降解机制还有待进一步探索。本研究获得了一株具有11个褐藻胶裂解酶（VpAly-I至-XI）的高效褐藻胶降解菌株海弧菌WXL662，并进一步阐明了其降解褐藻胶的分子机制。在WXL662基因组的不同部位发现了3个褐藻胶利用位点（AUL），包括6个褐藻胶裂解酶（VpAly-I、-II、-VIII、-IX、-X和-XI）以及其他与褐藻胶降解相关的基因。当提供褐藻胶作为唯一碳源时，大多数褐藻胶降解基因被强烈诱导。10个褐藻胶裂解酶（VpAly-I至-X）被纯化并鉴定，其中6个来自多糖解酶家族7（PL7），3个来自PL17，1个来自PL6。这些存在于不同细胞位置的重组褐藻胶裂解酶在较宽的温度（10至50°C）和pH（4.0至9.0）范围内具有活性，对底物的偏好不同，降解产物也多种多样，使WXL662能够在不断变化的海洋环境中高效利用褐藻胶。重要的是，外膜囊泡（OMV）可以作为WXL662中褐藻胶裂解酶（VpAly-II，-V和-VI）的载体。对公共弧菌基因组的进一步研究表明，大多数降解褐藻胶的弧菌具有一个AUL，而不是先前报道的“分散”系统。这些结果强调了Vibrio pelagius WXL 662特定的褐藻胶降解策略，可以作为模型菌株来研究海洋中有效降解褐藻胶的弧菌的生态重要性。重要性：褐藻胶是海洋环境中重要的碳源，而弧菌是褐藻胶的主要利用菌。以往的研究只关注弧菌中单个褐藻胶裂解酶的特性，而很少讨论褐藻胶的综合降解策略。本文描述了一株高效降解褐藻胶的弧菌WXL662对褐藻胶的利用机制及其生态意义，该菌株含有11种具有不同酶学特性的褐藻胶裂解酶。重要的是，与其他只有一个褐藻胶利用位点（AUL）或先前报道的“分散”系统的弧菌不同，WXL662中发现了三个AUL。此外，首次提出外膜囊泡（OMVs）与褐藻胶裂解酶的分泌。
弧菌属是海洋环境中普遍存在的异养细菌，具有高代谢灵活性，特别是在沿海系统中。弧菌约占易培养细菌的10%，在河口和沿海沃茨中的平均丰度为103至106 CFU L21。它们中的大多数可以利用各种海洋碳源，如几丁质，琼脂，烷烃和褐藻胶，通过编码多种多糖裂解酶（PL）来有效地降解这些类型的海洋有机物。因此，弧菌属。可能对海洋有机碳循环产生巨大影响，特别是在边缘海。弧菌属是海洋环境中普遍存在的异养细菌，具有高代谢灵活性，特别是在沿海系统中。弧菌约占易培养细菌的10%，在河口和沿海沃茨中的平均丰度为103至106 CFU L21。它们中的大多数可以利用各种海洋碳源，如几丁质，琼脂，烷烃和褐藻胶，通过编码多种多糖裂解酶（PL）来有效地降解这些类型的海洋有机物。因此，弧菌属。可能对海洋有机碳循环产生巨大影响，特别是在边缘海。褐藻胶是褐藻的主要多糖（占干重的40%），由通过β-1,4-糖苷键连接的糖醛酸β-D-吡喃甘露糖醛酸（M）和α-L-吡喃古洛糖醛酸（G）组成。由于这两种糖醛酸的不同随机组合，褐藻胶分为三种形式：即，polyM（单体M通过B-1,4-糖苷键连接）、polyG（单体G通过β-1,4-糖苷键连接）和polyMG（单体G和M随机排列并通过β-1,4-糖苷键连接）。褐藻胶是许多海洋异养细菌的重要营养物质，细菌褐藻胶裂解酶降解褐藻胶是海洋碳循环中的重要过程之一。到目前为止，已经鉴定和表征了来自弧菌属、鞘氨醇单胞菌属、假交替单胞菌属和假单胞菌属的许多褐藻胶裂解酶。这些褐藻胶裂解酶通过β-消除机制裂解糖苷键将褐藻胶降解为不饱和寡糖。在碳水化合物-活性酶（CAZy）数据库中，根据其氨基酸序列组成和空间结构特征，目前已知的褐藻胶裂解酶分布在12个PL家族（PL 5、-6、-7、-14、-15、-17、-18、-31、-32、-34、-36和-39）中。迄今为止，已经报道了细菌中三种不同的褐藻胶降解系统：多糖利用位点（PUL）系统、“分散”系统（主要在弧菌菌株中）和“凹坑”转运系统（仅在鞘氨醇单胞菌属菌株A1中发现）。一些普尔斯是许多利用褐藻胶的细菌中的特异性褐藻胶利用基因座（AUL），例如拟杆菌门（Bacteroidetes）和γ-变形菌门（Gammaproteobacteria）内的成员。在PUL系统中，细胞外褐藻胶裂解酶首先将大分子褐藻胶脱附，并且随后将所得寡糖产物转移到周质空间中，在周质空间中，寡褐藻胶裂解酶（Oals）将这些寡糖催化成单体。主要易化剂超家族（MFS）转运蛋白或内膜转运蛋白样蛋白（ToaABC）将单体转移到细胞质（CP）中，KdgF催化不饱和单体酮化为4-脱氧-L-异丙基-5-己糖醛酸酯（DEH）。DEH通过多种下游酶（DehR、KdgK和Eda）转化为最终产物2-酮基-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸盐（KDPG），并通过Entner-Doudoroff途径同化。与PUL系统不同，分散系统主要发生在弧菌中，并且包含分散在整个基因组中而不是在一个操纵子中的褐藻胶分解基因。此外，分散系统使用孔蛋白KdgMN进行细胞外底物转运，但不使用SusC和SusD。周质中的寡聚核苷酸（PP）通过内膜同向转运体ToaABC而不是MFS系统直接转移到细胞质中。凹坑系统仅在鞘氨醇单胞菌属菌株A1中发现，其中大分子褐藻胶通过由外膜上的“口状凹坑”组成的超通道直接掺入细胞质中。本研究从青岛近海海水中分离到一株高效降褐藻胶的菌株Vibrio pelagius WXL662，该菌株具有独特的褐藻胶降解策略，而不是以往报道的分散的弧菌系统。三个AUL分布在V. pelagius WXL 662基因组的不同区域，并协同催化褐藻胶。从菌株WXL 662中鉴定出11种具有不同酶学性质的褐藻胶裂解酶。提出了一种新的见解，褐藻胶降解策略的弧菌，其中外膜囊泡（OMV）被检测到作为重要载体的褐藻胶裂解酶的进一步讨论。
1.V. pelagius WXL662褐藻胶降解相关基因的研究
菌株WXL662在16~37 °C 温度下表现出较强的褐藻胶降解活性（见图1）。16SrRNA基因序列分析表明，WXL662与远缘弧菌CECT4202T（GenBank ID AJ293802）具有最高的相似性（99.29%）。WXL662的基因组分析显示总共有11个褐藻胶裂解酶编码基因（命名为Vpaly-I至-XI）（表1）。此外，还鉴定了参与褐藻胶降解的其他基因，包括编码 KdgM（N-乙酰神经氨酸外膜通道蛋白[NanC]）的三种寡聚半乳糖醛酸特异性孔蛋白的基因，三种2-脱氢-3-脱氧葡萄糖酸激酶（KdgK 样蛋白），三种2-脱氢-3-脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)和多种转运蛋白（钠溶质转运蛋白[SSF]和称为ToaA的褐藻胶转运系统）（图1)。![]()
图1. 菌株WXL 662基因组中的三个AUL。AUL以上的数字是染色体和质粒的起始和结束位置。
表1. 来自菌株WXL662的褐藻胶裂解酶的核苷酸和氨基酸序列分析
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表1总结了pelagius WXL662中11种褐藻胶裂解酶（VpAly-Ⅰ至-XI）的详细信息。其中6个（VpAly -III、-VI、-VIII、-IX、-X和-XI）与已知的褐藻胶裂解酶序列同源性较低（40%）。11个VpAlys的预测分子量（MW）在31.82 ~ 65.78 kDa之间，pi在4.29 ~ 7.01之间。这些VpAlys属于4个不同的PL家族（图2）。其中6个属于PL7家族，具有单催化结构域（VpAly-III、-V和VI）、双催化结构域（VpAly-I）或具有碳水化合物结合结构域CBM32的多结构域（VpAly-II和VpAly-IV）。VpAly-VII是一种具有单一催化结构域的PL6褐藻胶裂解酶。在PL17家族中，VpAly-VIII和VpAly-IX含有双催化结构域，而VpAly-X是单催化结构域的褐藻胶裂解酶。来自PL14家族的VpAly-XI编码一个催化结构域。PL6和PL7家族的VpAly基因在其N端编码一个信号肽，而PL17和PL14家族的4个VpAly基因在其N端未发现信号肽。![]()
图2. 基于来自菌株WXL662的11种褐藻胶裂解酶（红色）和其它已知褐藻胶裂解酶的氨基酸序列的相邻连接的遗传树。基于1，000次重复测定计算Bootstrap值。条形图，每个核苷酸位置0.2个取代。属于家族PL6、PL7、PL14和PL17的所有氨基酸序列来自CAZymes数据库。
预测了该途径中褐藻胶裂解酶和其他关键酶的细胞定位。来自PL 17的三种褐藻胶裂解酶（VpAly-VIII、-IX和VpAly-X）和一种PL 14褐藻胶裂解酶（VpAly-XI）在细胞质（CP）中。VpAly-I至-VII似乎是分泌型褐藻胶裂解酶，考虑到它们上的信号肽。尽管不同软件在预测VpAly-I至-VII的准确细胞定位时存在差异，但根据Cello的结果，我们假设VpAly-III位于周质（PP）中，而其他VpAly的位置更有可能在细胞外间隙（EC）中。对于其他蛋白质参与褐藻胶降解，KdgK样蛋白，埃达，磷酸甘油酸激酶在细胞质（CP）；三个褐藻胶降解特异性转运蛋白（KdgM和NanC）在外膜（OM）。2.V. pelagius WXL662中3个AUL的鉴定尽管先前的研究表明弧菌包含分散在整个基因组中而不是在一个操纵子中的褐藻胶分解基因，但我们发现菌株WXL 662中的褐藻胶降解基因成簇存在，形成三个典型的褐藻胶利用位点（AUL 1至AUL 3）（图1）。AUL 1至AUL 3分别位于大染色体（染色体I）、小染色体（染色体II）和大质粒（质粒I）上。每个AUL包含编码两种不同的褐藻胶裂解酶的基因、多种转运蛋白（包括外膜中的KdgM/NanC和内膜中的ToaA）以及一些进一步水解的关键基因，如KdgF编码基因，其可以催化不饱和单体酮化成DEH。因此，AUL 1具有编码具有DEH还原酶活性的短链脱氢酶/还原酶（SDR）的基因，而另外两个AUL缺乏该基因。此外，AUL 2和AUL 3分别携带编码下游代谢KdgK样蛋白（2-脱水-3-脱氧葡萄糖酸激酶）和Eda（2-脱水-3-脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶）的基因。KDG可被KdgK和Eda催化生成KDPG，后者可通过Entner-Doudoroff（艾德）途径被直接同化。值得注意的是，AUL 3中的一些基因，如kduD（2-脱氧-D-葡萄糖酸3-脱氢酶）、uxaC和kduI（预测的4-脱氧-L-苏式-5-己糖磺糖醛酸酮醇异构酶），也在果胶降解中发挥作用，表明AUL 3可能是一个多功能基因座。为了探索褐藻胶降解基因的转录，对在0.6%（wt/vol）褐藻胶和葡萄糖矿物培养基中培养的菌株WXL 662进行转录组测序和定量逆转录-PCR（qRT-qPCR）。在褐藻胶降解基因中，PL 7家族中编码6个内型VpAlys的基因明显上调，这些基因负责将褐藻胶转化为AOS（聚合度[DP] = 3至6）。三个PL 17褐藻胶裂解酶编码基因以及一个PL 6和一个PL 14 VpAly编码基因各不受褐藻胶的差异调节。此外，每个AUL中的三个转运蛋白KdgM（NanC）基因和编码与下游褐藻胶代谢相关的一些关键酶的基因，如AUL 2中的Kdgk样蛋白和Eda，也显著上调（log 2倍数变化[FC]>1；P，0.01）。AUL 1中的KdgF和短链脱氢酶/还原酶（SDR）编码基因以及AUL 3中的KdgF和DEH酮醇异构酶编码基因上调。此外，通过褐藻胶添加褐藻胶诱导位于褐藻胶裂解酶附近的许多转运蛋白的转录，例如ABC转运蛋白、钠溶质同向转运蛋白（SSF）和推定的褐藻胶转运系统ToaA（26）。qRT-PCR证实了上述结果的准确性。因此，分布在三个AUL中的褐藻胶降解基因可以响应于褐藻胶而上调，并且这三个AUL似乎在有效地分解代谢褐藻胶中合作。此外，参与菌株WXL 662的中心代谢循环的基因的转录水平也升高（log 2 FC>1；P，0.01），表明褐藻胶的有效利用促进了远洋弧菌WXL 662的能量代谢。4.V. pelagius WXL662中的褐藻胶裂解酶表现出多种酶学特性在本研究中，11个潜在的VpAlys在E.coliBL 21（DE 3），并对其中10个（VpAly-XI除外）进行了纯化。重组酶VpAly-XI的粗酶液具有降解褐藻胶的活性，但未能得到纯化的酶。Zhang等人对VpAly-V的详细酶性质进行了表征，本研究获得了其他9种VpAlys的数据。通过SDSPAGE估计纯化蛋白的分子量，其与预测的分子量一致（表1）。这10种纯化的重组VpAlys表现出广泛的温度适应性，它们的最佳温度在10 °C和50 °C之间变化（表2）。特别地，VpAly-VI（PL 7家族中的潜在新成员）作为低温褐藻胶裂解酶在10 °C下显示出最佳温度，而VpAly-VII在50 °C下显示出最佳活性（表2）。这10种VpAlys的最佳pH值范围为6.0 - 8.0（表2）。其中，VpAly-I更喜欢酸性环境，在pH 6.0时表现出最佳活性，在pH 5.0时保持40%以上的酶活性。然而，VpAly-II，-III，-V，-VI，和-VII优选碱性环境，并在pH 8.0时显示出最大的酶活性。这些VpAlys对金属离子和还原剂的响应不同（表2和图S6）。例如，5 mM Zn 21使VpAly-VIII的酶活性增加2.5倍。Al 31、Ni 21、Ca 21、Zn 21、Ba 21和Mg 21（5 mM）使VpAly-IX的酶活性增加超过2.5倍。WXL 662中的这些褐藻胶裂解酶所显示的宽温度和pH范围以及对环境因素的不同响应可以使该菌株能够在不断变化的海洋环境中更好地利用褐藻胶。此外，WXL 662中的褐藻胶裂解酶呈现出明显的底物偏好性。VpAly-IX和VpAly-X优选polyM而不是polyG嵌段和褐藻胶，如先前对于PL 17褐藻胶裂解酶所报道的，而VpAly-VIII优选polyG而不是polyM嵌段和褐藻胶（表2）。表2. 菌株WXL 662中纯化的褐藻胶裂解酶的蛋白质含量和酶性质
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考虑到VpAly-VIII与最相似的蛋白（来自Zobellia galactanivorans DsijT的AlyA 3）的蛋白序列同一性仅为35%，VpAly-VIII可能是一种新的PL 17褐藻胶裂解酶。与AlyA 3（pH 8和polyM）相比，VpAlyVIII显示出不同的最佳pH和底物偏好（pH 6.8和polyG）。VpAly-V优选催化polyM，而其他PL 7 VpAlys优选降解褐藻胶。PL 6家族中的VpAly-VII也优选褐藻胶。此外，这些褐藻胶裂解酶的降解产物高度多样化，产生不同类型的褐藻胶寡糖（表2）。VpAly-I至-VII（在PL 6和PL 7中）都是内切型酶，产生不同类型的褐藻胶寡糖（DP = 3至6），而位于细胞质中的来自PL 17的三种褐藻胶裂解酶（VpAly-VIII至-X）仅产生单糖（表2）。基于透射电子显微镜（TEM）和AFM观察，菌株WXL 662在以褐藻胶作为唯一碳源的矿物培养基中培养时可以分泌外膜囊泡（OMV）（图3）。为了验证这些OMV是否在褐藻胶降解过程中起作用，我们收集并分析了三种不同培养条件下的OMV：0.6%（wt/vol）褐藻胶矿物培养基，0.6%（wt/vol）葡萄糖矿物培养基和海洋ZoBell肉汤（MB）。从0.6%（wt/vol）褐藻胶矿物培养基中的培养物收集的粗囊泡组分显示出在25.0和35.0 kDa之间的粗条带中的明显差异。![]()
图3. 不同培养条件下纯化囊泡样品的形态。(A)用褐藻胶作为唯一碳源培养的菌株WXL 662的形态和内部结构;（B）用褐藻胶作为唯一碳源培养的纯OMV的形态（棒，100 nm）;（C）在MB培养基中培养的纯OMV的形态（棒，200 nm）;（D）用葡萄糖作为唯一碳源的WXL 662的形态，其不产生OMV（棒，200 nm）。
对不同条带进行测序以验证囊泡的组成。该目标条带中共鉴定出219种可信蛋白质，其中含量较高的褐藻胶裂解酶VpAly-II、VpAly-V和VpAly-VII（在219种蛋白质中分别排名第15、16和42位）。因此，这三个VpAlys似乎分泌到周质中，然后通过OMV运输到细胞外空间。此外，基因编码的三个最丰富的蛋白质OMV位于AUL 1，包括一个褐藻胶裂解酶VpAly-II，一个假定的生物膜相关的表面蛋白，和一个寡聚半乳糖醛酸特异性孔蛋白KdgM。因此，推测AUL 1可能是负责通过OMV降解褐藻胶的关键位点。为了进一步确定弧菌属中的褐藻胶降解物种，从NCBI数据库中下载了总共94个几乎完整的弧菌基因组，并在本研究中进行了注释。构建了来自18个弧菌分支的这些弧菌基因组的最大似然（ML）树（图4）。在来自七个弧菌分支（鲁莫氏弧菌、嗜盐弧菌、Splendidus弧菌、地中海弧菌、食琼脂菌、东方弧菌和哈维氏弧菌）的总共25个（26%）弧菌菌株中鉴定出褐藻胶降解基因（图4）。21株降解褐藻胶的弧菌菌株中的褐藻胶降解基因成簇存在，其基因组中只有一个完整的AUL（图4中标记的红色圆圈）。除了在奥氏弧菌1700302和奥氏弧菌SH 14的基因组中的AUL外，它们缺少编码KdgM和NanC的基因除褐藻胶降解特异性转运蛋白外，其他AUL基因均编码褐藻胶降解途径中的关键蛋白，包括多个褐藻胶裂解酶和polyM裂解酶（n = 2至10）、特异性转运蛋白KdgM和/或NanC、三种类型的DEH还原酶、KdgF、KdgK样蛋白和Eda。WXL 662菌株的3个AUL中，AUL 2和AUL 3的基因结构与其他弧菌的AUL相似，而AUL 1缺少编码KdgK样蛋白和Eda的基因（图1）。然而，4株降解褐藻胶的弧菌，包括V. breoganii FF 50、V. astriarenae HN 897、Vibrio sp. strain THAF 190 c和V. halioticoli IAM 14596 T，其降解褐藻胶的基因分散在基因组中。这些结果表明，AUL在弧菌物种中比褐藻胶降解基因的“分散”系统更常见。大多数弧菌菌株只有一个AUL，除了V. pelagius WXL 662，其中已经鉴定出三个AUL。图4. 来自18个弧菌分支的95个弧菌基因组的最大似然（ML）系统发育树。具有褐藻胶降解基因的基因组用实心圆圈标记（红色以AUL的形式，绿色表示分散的系统）。V. pelagius WXL 662的基因组用星星标记。
许多广泛分布的弧菌物种可以利用褐藻胶作为碳源。利用褐藻胶的弧菌菌株编码多种褐藻胶裂解酶，并具有特定的策略(即分散系统)来降解褐藻胶。在本研究中，我们描述了一种有效的褐藻胶降解机制，并鉴定了多种含有AUL和褐藻胶裂解酶的OMV。对不同酶性质的褐藻胶裂解酶进行了表征，强调了V. pelagius WXL662在不同条件下对褐藻胶的强大利用能力以及这种褐藻胶降解弧菌潜在的生态意义。1.V. pelagius WXL662基因组中的特异性AUL由褐藻胶降解基因组成的AUL通常存在于褐藻胶降解细菌的基因组中。例如，鞘氨醇单胞菌属菌株A1中的AUL由编码ABC转运蛋白、褐藻胶结合蛋白、外切褐藻胶裂解酶（Aly-IV）和三种类型的内切褐藻胶裂解酶（Aly-I、-II和-III）的基因组成。黄杆菌属菌株UMi-01还仅具有一个AUL（该AUL的长度为约15.6 kb）编码的转运蛋白SusC/SusD样蛋白、两个褐藻胶裂解酶基因、一个SDR样酶基因和降解下游褐藻胶所必需的其他基因（编码KdgF样蛋白、KdgK和Eda）。然而，先前的研究报道，弧菌属物种中的褐藻胶分解基因并不共定位在同一操纵子中，而是分布在整个基因组的不同区域，如华丽弧菌12 B 01中所述，其被命名为“分散的”褐藻胶降解系统。然而，我们实际上在灿烂弧菌12 B 01的基因组中鉴定了一个AUL：即使AUL中不存在褐藻胶裂解酶，但在我们的研究中，褐藻胶降解基因在基因组中的分布模式仍然被定义为“AUL系统”。我们确实在25种降解褐藻胶的弧菌菌株中的4种中鉴定了分散系统，证实了这种分散系统不是弧菌中褐藻胶降解的主流形式。我们的研究结果发现，虽然AUL广泛存在于弧菌基因组中，但大多数弧菌只含有一个AUL。相比之下，三个褐藻胶降解AUL位于WXL662基因组的不同位置（分别为染色体I中的AUL 1、染色体II中的AUL 2和质粒I中的AUL 3）（图1）。所有三种AUL都能够将褐藻胶降解为DEH，并通过DEH还原酶进一步产生KDG，其可以并入中央代谢循环。以褐藻胶为唯一碳源的转录组结果显示，在WXL662中，AUL1的所有基因均显著上调，AUL2和AUL3的部分褐藻胶降解基因也上调，表明这三个AUL在WXL662利用褐藻胶的过程中协同作用。多个AUL可能有助于弧菌在海洋环境中快速转录褐藻胶降解基因以响应褐藻胶，并赋予褐藻胶降解过程更高的调节灵活性。2.V. pelagius WXL662中多种褐藻胶裂解酶的协同作用该菌株除具有特异的AUL外，还具有大量的褐藻胶裂解酶（VpAly-I至-Xi）。许多褐藻胶降解细菌编码多个褐藻胶裂解酶，其协作以降解褐藻胶。例如，在海洋细菌Agarivorans sp.菌株B2 Z 047的全基因组中鉴定了属于PL 6、-7、-17和-38家族的12个潜在褐藻胶裂解酶基因。藻嗜纤维素菌DSM 14237编码5种褐藻胶裂解酶，其中3种为内切酶，2种为外切酶。对于弧菌，表征了来自灿烂弧菌12 B 01的七种褐藻胶裂解酶，其在pH 7.5和8.5之间以及在16至35 ℃下显示出最佳活性。相比之下，在WXL 662中鉴定出更多的褐藻胶裂解酶，并且这些裂解酶显示出更宽的最佳温度范围（10至50 ℃），表明该菌株可以在极端温度波动下有效地降解褐藻胶。WXL 662中这些褐藻胶裂解酶的广泛pH和温度适应性，独特的底物偏好性和细胞位置使其成为海洋环境中强大的褐藻胶利用者。先前报道的弧菌中的褐藻胶裂解酶已在PL 6、-7和-17中发现，而在本研究中首次报道了弧菌中的PL 14褐藻胶裂解酶（VpAly-XI）（表2）。WXL 662中的这些褐藻胶裂解酶中的一些与弧菌中的其他褐藻胶裂解酶具有高蛋白质序列同一性，但酶活性不同。例如，PL 6家族中的VpAly-VII与灿烂弧菌OU 02中的AlyF显示出90.2%的同一性，但VpAly-VII的降解产物是寡糖（DP = 3至6），而AlyF的降解产物是三糖。表S10总结了来自不同物种和蛋白质家族（PL 6、-7、-14、-17）的91种先前研究的褐藻胶裂解酶的酶特性。WXL 662中的六种褐藻胶裂合酶与已知的褐藻胶裂合酶具有较低的蛋白质序列同一性（40%）（表1），其中一些与同一蛋白质家族中最相似的酶相比表现出独特的酶特征。例如，PL 17家族中的VpAly-VIII与已知的褐藻胶裂解酶仅具有35%的蛋白质序列同一性，并且表现出对polyG嵌段的偏好，而其他先前报道的PL 17寡褐藻胶裂解酶优选polyM或褐藻胶。此外，目前报道的PL 7家族的褐藻胶裂解酶表现出16 ℃至70 ℃的最适温度，而VpAlyVI在10 ℃下显示出最高的酶活性，并扩大了PL 7褐藻胶裂解酶的最适温度范围。因此，VpAly-VIII和-VI可能代表弧菌中新型的褐藻胶裂合酶。由细菌产生的囊泡具有多种生物学功能，包括毒力因子运输、DNA转移、噬菌体拦截、抗生素和真核宿主防御、细胞解毒以及细菌之间的通信。不同的细菌，包括弧菌，可以分泌不同形状和功能的OMV。例如，创伤弧菌可形成在对数期作为毒力因子发挥作用的分节管状OMV，而在平台期的OMV产量低且形状不规则。具有几丁质降解能力的志贺氏弧菌可以释放两种类型的OMV，具有单膜或双膜，其可以将信号分子和活性酶如几丁质酶释放到其环境中。在这项研究中，我们首次提出了OMV在褐藻胶降解过程中的作用。由菌株WXL 662分泌的OMV具有两种形式：单个囊泡和分节管状。菌株WXL 662中OMV的形成也可能与细胞的生长状态有关。刚刚完成分裂的新一代WXL 662细胞不能立即分泌OMV。生长一段时间后，细胞质开始扩散到细胞边缘，OMV开始形成，随后将褐藻胶裂解酶释放到环境中。与具有几丁质降解能力的志贺氏弧菌一样，V. pelagius WXL 662分泌的OMV可能是几种褐藻胶裂解酶（VpAlyII、-V和-VII）和其他组分的载体。通过释放OMV，弧菌可以更有效地利用周围环境中的褐藻胶。OMV是否普遍参与弧菌的褐藻胶代谢尚有待证实。4.对弧菌物种的褐藻胶降解过程及其生态意义的新见解基于结果，阐明了菌株WXL 662的海褐藻胶降解过程，如图5所示。简要地说，该过程发生如下。(i)胞外酶（VpAly-I、VpAly-II、VpAly-V、VpAly-IV、VpAly-VI和VpAly-VII）被转运穿过膜并将褐藻胶的大分子降解成具有3至6个聚合度（DP）的寡糖，从而完成褐藻胶代谢的第一步。OMV参与VpAly-II、-V和-VII的分泌。(ii)一些转运蛋白，如KdgM，位于外膜上，可以将褐藻胶低聚物转运到周质中。位于周质中的褐藻胶裂解酶（VpAly-III）进一步将寡糖（DP = 3至6）降解成三糖。(iii)三糖通过内膜转运蛋白样ToaABC转移到细胞质中。寡聚褐藻胶裂解酶（VpAly-VIII、-IX和-X）将三糖还原成单糖，形成4-脱氧L-赤-5-己酮糖糖醛酸（DEH）。DEH通过多种下游酶（DehR、KdgK样蛋白和Eda）转化为最终产物2-酮基-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸盐（KDPG），并通过中央代谢循环被同化。![]()
图5. 远洋弧菌WXL 662的褐藻胶降解策略。胞外褐藻胶裂解酶（VpAly-I、-II、-V、-IV、-VI和-VII）将大分子褐藻胶降解为具有3至6个聚合度（DP）的寡糖，完成褐藻胶代谢的第一步。三种褐藻胶裂解酶（VpAly-II、VpAly-V和VpAly-VII）可通过外膜囊泡（OMV）转移到环境中。特异性外膜转运蛋白KdgM将寡糖（DP = 3至6）转移到周质中，在周质中VpAly-III催化寡糖转化为甘油三酯。此外，丰富的三聚氰胺通过内膜转运蛋白ToaA转移到细胞质中，并且细胞质中的寡藻酸裂解酶（VpAly-IX，-X，Xi）将三聚氰胺还原成单糖。单糖4-脱氧-L-赤型5-己糖基葡糖醛酸（DEH）通过多个下游酶（DehR、KdgK和Eda）转化为最终产物2-酮基-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG），并通过中心代谢循环同化。
弧菌在海洋环境中无处不在，尤其是在沿海地区，在基于培养的研究中，弧菌占可培养海洋细菌的10%；通过非培养方法，弧菌占浮游细菌总数的1%。编码多种褐藻酸裂解酶的弧菌是海洋环境中褐藻酸的高效利用者，促进海洋有机碳循环。在本研究中，我们发现V. pelagius WXL 662的强烈的海褐藻胶降解活性是由于多种具有不同酶性质的海褐藻胶裂解酶。这些裂解酶被组织成三个AUL，并在褐藻胶降解过程中合作。OMV的加入还可以进一步提高胞外褐藻胶的降解效率。这些结果强调了V. pelagius WXL 662的特定海褐藻胶利用策略，这可能是研究高效利用海褐藻胶的弧菌的理想模型。本研究描述了一个高效褐藻胶降解菌株WXL662的褐藻胶利用机制。WXL662的基因组编码11种褐藻胶裂解酶，并包含参与褐藻胶完全降解的其他基因。其中10种褐藻胶裂解酶（VpAly-I至-X）被纯化，并在宽的温度和pH范围内显示出活性，具有不同的底物偏好性和降解产物。这些褐藻胶裂解酶和其它褐藻胶降解相关基因中的一些被组织成三个AUL，并且可以用褐藻胶作为唯一的碳源来诱导。此外，OMV还参与了褐藻胶裂解酶的运输。这些研究结果有助于我们更深入地了解弧菌对褐藻胶的利用过程，并强调弧菌在全球碳循环中的生态学重要性。
原文：Characterization of Multiple Alginate Lyases in a Highly Efficient Alginate-Degrading Vibrio Strain and Its Degradation StrategyDOI: https://doi.org/10.1128/aem.01389-22
