2024 年6 月 5 日，来自中国海洋大学的Jinhang Zhou等人在Carbohydrate Polymers上发表了一篇题为Discovery and characterization of a novel poly-mannuronate preferred alginate lyase: The first member of a new polysaccharide lyase family的研究性论。
Abstract
褐藻胶是一种重要的海洋胶体多糖，其寡糖已被证明具有多种生物学功能。褐藻胶裂解酶能够特异性地降解褐藻胶，是研究和开发褐藻胶的理想工具。研究发现，一个新的催化结构域，与所有先前定义的功能结构域没有显著的序列相似性，被证实对褐藻胶表现出随机的内作用裂解酶活性。作用模式分析表明，异源表达蛋白Aly44A倾向于降解polyM。其最小底物和最小产物分别为不饱和褐藻胶三糖和二糖。基于Aly44A及其同源物序列的新颖性，提出了一个新的多糖裂解酶家族（PL44）。新的酶和多糖裂解酶家族的发现，为褐藻胶裂解酶的基因挖掘和获取提供了新的入口，有利于褐藻胶及其寡糖的利用。
01
简介
褐藻胶是一种广泛分布于褐藻细胞壁的线性阴离子多糖，由1-4个连接的β- d -甘露醛酸(M)及其C5异构体α- L -葡萄糖醛酸(G)组成。这些基本单元组成了三种不同的嵌段，包括聚α- L -古洛醛酸酯（polyG）、聚β- D-甘露醛酸酯（polyM）和异聚物（polyMG）。褐藻胶作为水凝胶生物材料广泛应用于食品、生物医学和化妆品的应用，因为它的生物相容性和凝胶形成特性。褐藻胶寡糖（AOS）是褐藻胶的降解产物，具有相对分子量（Mw）低、溶解度好、安全性高、稳定性高等特点。结果表明，AOS具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌等多种生物活性。
褐藻胶裂解酶是一种多糖裂解酶(PL)，它通过β-消除机制裂解糖单体之间的1-4糖苷键来降解褐藻胶，是将褐藻胶降解为AOS的关键工具。褐藻胶裂解酶已被用于研究褐藻胶的精细结构，以生产特定的目标产品。在CAZy数据库中，褐藻胶裂解酶被划分为14个PL家族。根据结构类型的不同，可将褐藻胶裂解酶分为4类。大部分褐藻胶裂解酶分别采用(α/ α)n桶状(PL5、PL38)、平行β-螺旋状(PL6、PL31)、β-果冻卷状(PL7、PL14、PL18、PL36)、(α/ α)6环状+反平行β-片状(PL8、PL15、PL17、PL39)。作为结构最多样化的多糖裂解酶之一，褐藻胶裂解酶的复杂性体现在序列、拓扑结构等多个方面。因此，探索新的褐藻胶裂解酶家族有利于扩大对褐藻胶裂解酶结构多样性的认识，也为褐藻胶裂解酶的基因挖掘和获取提供了新的入口。
在细菌Bacillus sp. FJAT-50079的基因组中，人们注意到一个序列(编号WP_213137828.1)包含一个假定的褐藻胶裂解酶催化结构域。该结构域显示出polyM偏好的褐藻胶裂解酶活性。在此基础上，构造了一个新的PL族。研究旨在阐明该结构域的作用模式、生化特性和选择性降解。
02
结果
1.Aly44A的生物信息学分析及基因克隆
序列WP_213137828.1的总长度包括838个氨基酸(aa)残基，包括信号肽(1-29 aa)、碳水化合物结合模块(CBM)32(40-161 aa)和CBM96(645-838 aa)(图1A)。InterProScan工具将212 ~ 568 aa的推定结构域标注为多糖裂解酶。然而，该结构域无法被dbCAN标记为任何已知的PL家族。AlphaFold2预测该结构域的结构为平行β-螺旋结构(图1B)。平行的β-螺旋折叠被PL6和PL31等几种多糖裂解酶所采用。进一步分析了该结构域在基因组中的遗传背景。该结构域位于一个与褐藻胶代谢相关的操纵子中。在该结构域旁边发现了PL15_1(编号WP_213137827.1)中编码外褐藻胶裂解酶的基因。值得一提的是，CBM32结构域和CBM96结构域分别与非还原端和褐藻胶的内部区域结合。CBMs的结合功能通常与其相邻催化结构域的活性相匹配。因此，有人认为该结构域可能是一种褐藻胶裂解酶。
图 1.WP_213137828.1编码蛋白的预测结构域。该蛋白编码一个838个氨基酸的多肽。信号肽位于1 ~ 29个氨基酸之间(以紫色突出显示)；CBM32结构域位于40 ~ 161个氨基酸之间(以青色突出显示)；推定催化结构域位于180 ~ 643个氨基酸之间(洋红色突出显示)；CBM96结构域位于645 ~ 838个氨基酸(蓝色突出显示)。
克隆了该结构域(180-643 aa)，并进行了侧链表达loop。纯化后的蛋白在SDS-PAGE上显示为单条带。SDS-PAGE上57 kDa的表观Mw(图2)与52.57 kDa的理论Mw一致，表明酶表达成功。这种酶后来被命名为Aly44A。
图 2.纯化重组Aly44A的SDS-PAGE分析。
2.酶活性和动力学常数
Aly44A对褐藻胶、polyM和polyG具有降解活性，酶活性分别为4.278±0.053、4.462±0.035和0.825±0.020 U/mg，体积酶活性分别为0.683±0.009、0.712±0.006和0.132±0.003 U/mL。证实Aly44A具有褐藻胶裂解酶活性。Aly44A不能降解其他糖醛酸多糖，如果胶、透明质酸和硫酸软骨素，表明Aly44A对褐藻胶具有特异性。
动力学分析(表1)表明，与polyG相比，Aly44A具有更高的转化效率和对polyM更强的亲和力，表明Aly44A是polyM的首选。褐藻胶裂解酶的降解偏好决定了它的应用，并受到了广泛的吸引。双功能褐藻胶裂解酶对polyG或polyM没有偏好，与之相反，Aly44A在制备由M块组成的AOS方面表现出优越的潜力。polyM和polyG的Mw (< 25 kDa)均低于褐藻胶(约1000 kDa)。结果表明，Aly44A对长链褐藻胶的polyM区具有较高的亲和力和催化效率。
表 1.Aly44A的Vmax、Km、kcat和kcat/Km值。
3.生化性质分析
Aly44A的最适反应温度为45℃(图3A)，这与通常报道的褐藻胶裂解酶的最适反应温度范围为30℃–50℃一致。在4℃和20℃储存24小时后，酶的剩余活性分别为初始活性的89%和86%，表明具有优异的储存稳定性(图3B)。Aly44A的最适pH为9.0，在3.0-11.0的较宽pH范围内具有良好的pH稳定性(图3C-3D)。
4.UPSEC-MS作用模式分析
在反应初始阶段(酶用量为0.05 U)，Aly44A产生不同聚合度的低聚糖(DP)，表明其为内作用方式(图4A)。在整个反应过程中，没有优势寡糖连续积累，表明Aly44A以随机方式降解褐藻胶。随着酶用量的不断增加，DP≥3的AOS数量呈现先增加后减少的趋势，而双糖则持续积累(图4B)。结果表明，Aly44A的最小底物为三糖。酶加入量为5.00 U时，反应达到终点。随着酶用量逐渐增加到10.00 U，产物的寡糖谱几乎没有明显变化。
图 4.Aly44A降解褐藻胶的反应过程。(A.UPSEC-UV;B.UPSEC-MS).
最终酶促产物为DP 2-8的AOS;主要产品为DP 2-4的AOS。来自PL31家族的褐藻胶裂解酶也采用平行β-螺旋折叠。PL31中paeh-aly的主要降解产物为DP 2-4，PL31中PsAly的主要降解产物为DP 3-5。由此可以推断，具有相同拓扑结构的褐藻胶裂解酶在产物DP上可能具有相似性力。
03
结论
在研究中，获得了一个新的褐藻胶裂解酶家族，并研究了Aly44A的生化特性和作用模式。Aly44A的最适反应温度为45℃，最适反应pH为9.0。Aly44A在降解polyM时表现出最高的酶活性，HPAEC检测可以完全降解三糖中的ΔMM，表明Aly44A是polyM的优先选择。通过对其作用模式的分析，Aly44A为随机内作用方式，降解的最终产物为DP 2-8的AOS，降解的主要产物为DP 2-4的AOS。基于Aly44A及其同源序列的新颖性，构建了多糖裂解酶家族PL44。这项研究为了解褐藻胶裂解酶的多样性提供了新的见解，并提供了新的工具用于褐藻胶的分子修饰、结构分析和寡糖制备。新家族的发现将促进褐藻胶研究的进一步发展。
DOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122474
END
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