2024年9月，来自集美大学的Ting Wu等人在International Journal of Biological Macromolecules上发表了一篇题为A disulfide bond mutant of Pseudoalteromonas porphyrae κ-carrageenase conferred improved thermostability and catalytic activity and facilitated its utilization in κ-carrageenan industrial waste residues recycling的综述性论文。
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通讯单位：Corresponding author at: College of Ocean Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China.本研究利用Discovery Studio对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶催化结构域潜在的二硫键突变体进行预测，以提高催化活性和热稳定性。突变体N205C-G239C对κ-卡拉胶底物的催化活性显著提高，是WT的4.28倍，N205C-G239C的最适温度为55℃，比WT高15℃。N205C-G239C在50℃时t1/2值为52 min，是WT的1.4倍。微观结构分析表明，引入的二硫键N205C-G239C可以通过促进与κ-necarratetraose的有利相互作用创造独特的催化环境。这种相互作用影响了各种方面，如产物释放、水分子网络、热力学平衡和隧道大小。分子动力学模拟表明，引入的二硫键增强了N205C-G239C的整体结构刚度。底物隧道分析结果表明，突变导致底物隧道变宽。上述结构变化可能是突变体N205C-G239C催化活性和热稳定性同时增强的原因。最后，N205C-G239C对κ-卡拉胶工业废渣具有有效的水解作用，有利于低聚糖和珍珠岩的回收利用。
κ-卡拉胶是一种天然聚合物，具有优异的胶凝和增稠性能，在食品和制药工业中有着广泛的应用。目前，角叉菜胶主要通过碱性提取工艺从Rhodophyceae红海藻中获得。同时产生大量富含珍珠岩、κ-卡拉胶和纤维素的碱性κ卡拉胶工业废渣。根据中国一家工业κ-卡拉胶制造商的数据，每生产一吨κ-卡拉胶，大约会产生8吨工业废渣。κ-卡拉胶工业废渣除了少部分用于生产无土栽培基质外，其余70%以上的κ-卡拉胶工业废渣作为固体工业废弃物直接填埋，造成土壤酸碱失衡，危害生态环境。传统的工业废渣处理方法包括化学处理(如氧化、分解、吸收)和物理处理(如破碎、蒸发、燃烧)。然而，这些方法仍然有二次污染的风险。我们的研究计划涉及从工业废渣中分离珍珠岩、κ-卡拉胶和纤维素，目的是回收这些材料。然而，κ-卡拉胶具有较高的熔融温度，且κ-卡拉胶溶液具有较高的黏度，这对高效分离珍珠岩和κ-卡拉胶提出了挑战。研究表明，当κ-卡拉胶的分子量减小时，其熔融温度和溶液粘度随之降低。目前，κ-卡拉胶水解的主要方法包括化学法和酶法。酶法以定向断裂多糖糖苷键、反应条件温和、便于过程控制和环境友好等特点而著称。因此，酶解法似乎是κ-卡拉胶工业废渣资源化回收的一种有吸引力的方法。
κ-卡拉胶具有热可逆凝胶特性，在较高温度下粘度降低。若要在工业规模上利用κ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.83)对κ-卡拉胶的β-1,4糖苷键进行酶解生产κ-卡拉胶寡糖，需要κ-卡拉胶酶保持良好的酶活和耐受高温工艺条件。据报道，大多数κ-卡拉胶酶的最适温度为30-40 °C，当温度高于50 °C时，它们的热稳定性很差。蛋白质工程通过理性设计和定点突变等手段已被证明可以有效地提高酶的活性和热稳定性。为了提高假交替单胞菌属紫菜κ-卡拉胶酶的酶活和热稳定性，人们采用了多种方法，包括整合折叠自由能变化(ΔΔG)和柔韧性分析，以及PoPMuSiC算法。二硫键是塑造蛋白质构象的关键化学键之一，已被成功用作蛋白质工程的候选物，以增强酶的性质，例如来自米根霉的脂肪酶和来自德氏乳杆菌的2′-脱氧核糖转移酶。Disulfide by Design (DBD)、MODIP和Discovery Studio程序已成功应用于二硫键突变位点的设计。
假交替单胞菌属紫菜LL1 κ-卡拉胶酶的催化结构域已被表征，在pH 7.0-10.0范围内具有良好的稳定性；然而，其在45 °C以上的高温下热稳定性较差。本研究以P. porphyrae LL1 κ-卡拉胶酶(本研究将其命名为KCgCD)的催化结构域为参考蛋白，通过Discovery Studio 2019设计引入额外的二硫键，生成二硫键突变体。筛选具有良好催化活性和热稳定性的突变体。对可能的机理进行了阐述，以了解它们的改进性能。此外，选择的κ-卡拉胶酶突变体被用于κ-卡拉胶工业废渣的酶解，以回收有用的生物资源。
Ramachandran图分析表明预测的KCgCD结构质量较好，92.3 %的残基位于有利区域，7.2 %位于允许区域。VERIFY 3D分析显示，97.7 %的残基具有平均3D single bond1D score ≥ 0.1，表明原子模型( 3D )与目标氨基酸序列( 1D )之间具有良好的兼容性。基于KCgCD的3D结构，选择了4个对胱氨酸残基有一对点突变的突变体(R44C-T292C，S146C-R248C，N205C-G239C，T263C-F270C)。SDS-PAGE分析，重组WT及其突变体均在35.0 kDa左右出现单一条带。突变体N205C-G239C、R44C-T292C、S146C-R248C和T263C-F270C的相对酶活分别是WT的4.28、1.41、0.09和1.92倍(图1A)。对于突变体S146C-R248C，由于其酶活过低，未进行后续的酶学性质测定。热稳定性实验表明，WT在50 °C和55 °C处理30 min后，残余酶活分别为24.3 %和6.7 %。遗憾的是，突变体R44C -T292C和T263C-F270C突变后的热稳定性均低于野生型。突变体N205C-G239C在50 °C的t1/2值显著延长，达到WT的1.41倍(表1)。以上结果表明，新引入的N205C-G239C二硫键使该突变体的热稳定性和催化活性同时提高。深海嗜盐菌属的磷脂酶D (PLD)也有类似的报道。JT01的研究表明，二硫键的引入显著提高了酶的热稳定性和催化效率。![]()
图1. κ-卡拉胶酶的酶活、热稳定性、光谱学和二硫键鉴定。(A)相对酶活。以κ-卡拉胶为底物，在pH 8.0条件下测定酶活性。(B)温度对酶热稳定性的影响。(C) N205C-G239C荧光光谱。(D) N205C - G239C的表面疏水性。(E-H)利用Py MOL对突变体S146C-R248C(E)、R44C-T292C (F)、T263C-F270C(G)和N205C-G239C (H)的二硫键形成进行可视化检测。(Ⅰ) N205C-G239C引入二硫键的鉴定。经MS/MS鉴定橙色峰为MRPGSAPETNHCGYH-QVCYKK。匹配峰的离子类型对于b-离子和y-离子用橙色表示，对于键碎片离子用绿色表示。
选取突变体N205C-G239C进一步测定其他酶学性质。N205C-G239C的最适温度为55 °C，比WT高15 °C (表1)。通过在Clostridium bolteae来源的D -阿洛酮糖-3-差向异构酶中引入二硫键，将其最适温度从55 °C提高到65 °C，增强了酶的潜在工业应用价值。N205C-G239C的最适pH为8.0，与WT相同(表1)。WT和N205C-G239C的Km值分别为2.87和10.90 mg/mL。提示突变导致底物结合亲和力下降。WT和N205C-G239C的Vmax值分别为625 U / mg和3516 U/mg。此外，WT和N205C-G239C的kcat值分别为18229 s-1和102540 s-1。WT和N205C-G239C的二级表观常数值分别为6352 mL·mg-1·s-1和9407 mL·mg-1·s-1。(表1)。上述研究结果表明，N205C-G239C突变提高了κ-卡拉胶酶的活性、最适反应温度和热稳定性，有利于其在医药、化妆品、食品等工业领域的应用。表1. 野生型和突变型κ-卡拉胶酶的特性。
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通过荧光光谱和表面疏水性分析对突变体N205C-G239C进行了表征。蛋白质在Trp环境中的构象变化或Trp环境附近涉及氨基酸的微小结构变化引起的荧光猝灭可能是导致蛋白质荧光强度变化的原因。WT和N205C-G239C的荧光光谱在395 nm处具有相同的最大荧光发射(图1C)，表明突变对κ-卡拉胶酶的三级结构没有明显影响。表面疏水性分析结果显示，野生型和突变体N205C-G239C的最大荧光波长均约为390 nm，但突变体N205C-G239C中新形成二硫键后荧光强度是野生型的1.2倍(图1D)。产生这种现象的原因是二硫键的额外引入使蛋白质结构伸展，从而暴露出更多的内部疏水区域。在蛋白质结构中，两个半胱氨酸残基一般较容易被氧化形成3 Å范围内的二硫键。在本研究中，N205C-G239C中巯基的预测距离最小，为2.0 Å (图1H) ，有利于形成二硫键。对于R44C-T292C、S146C-R248C和T263C-F270C的其他三个突变体，分离巯基的预测距离分别为5.5、4.8和4.7 Å (图1E-G)。此外，在10ns的MD模拟过程中，N205C和G239C之间巯基距离的平均值被确定为2.1。突变体N205C-G239C形成二硫键的概率为100%。这些结果表明，N205C和G239C的巯基可以形成二硫键。N205C-G239C的二硫键位于酶表面，为α-螺旋和柔性环之间提供了桥接纽带。引入突变的二硫键可以削弱构象的挥发性，增强蛋白质的结构刚性，从而提高蛋白质的热稳定性。先前已经报道，二硫键发挥重要的结构作用，但可能会阻碍蛋白质的分子灵活性和功能性，由于疏水基团的暴露而导致结构松动。二硫键对酶性质的影响取决于它在酶中的位置。为了提高氨解酶的热稳定性和催化性能，提出了二硫键构建和骨架环化的策略。据报道，柔性表面区域的氨基酸变化更有可能导致阳性突变，因为它们阻止了与内部残基的不利相互作用的建立，并限制了熵效应。在这项研究中，N205C-G239C的支架可以由α-螺旋和环区之间预期的二硫键的不可逆分子内交联强烈支持。新增加的限制表面环运动的二硫键可能是突变体N205C-G239C耐热性增强的主要原因。碰撞诱导解离(CID)是一种中性试剂气体与分析物离子的碰撞，是基于质谱的二硫键分析最常用的破碎技术。N205C-G239C的CID谱显示出一个简单的链间二硫键肽，二硫键肽 CID 切割后产生特征性片段离子峰。CID通常导致肽(酰胺)键的断裂，同时保持二硫键的完整性，从而产生包含二硫键(++中橙色离子)的b和y信号图1以及不含二硫键的离子(绿色离子)图1I)。规则肽主链断裂和CS、SS键断裂产生的大量片段离子为二硫键的形成提供了有力的证据。通过伴随MassMatrix软件的氨基酸序列分析，突变体中确认了Cys205-Cys239二硫键的存在。拉氏图分析显示 N205C-g239C的预测结构有89.0% 的残基位于有利区域，11.0%位于允许区域。根据VERIFY 3D分析，突变体N205C-G239C具有95.9%的残基，平均3D1D评分>0.1。N205C-G239C的结构表现为β-夹心结构(图2A)，与WT相比没有显著的结构变化。突变位点205和239远离催化核心。预测 E162是亲核残基，预测E167是酸/碱催化残基，预测D164影响去糖基化速率，形成N205C-G239C的催化三联体。通过蛋白质序列比对，我们发现N205C-g239C的结构与来自四齿假交替单胞菌属的κ-卡拉胶酶cgk-k142的结构有90.03%的序列相似性。它们的三维结构叠加良好，包括两种κ-卡拉胶酶(的预测催化三联体图2B)。基于Cgk-K142结构，预测 N205C-G239C (图2C) ，包括 F1(W56-W68)，F2(R91-Y105)，F3(T147-Q159)，F5(V186-G197)和F6(A260-P272)。Q101(位于F2)与W66和Y63(位于F1)共同参与了底物隧道内致密网络的水分子组成。预测了R150(位于F3)的指向性对衬底隧道入口与衬底相互作用的影响。此外，预测R195(位于F5中)和N268(位于F6中)在底物存在下采用“封闭”构象，从而影响底物隧道的形成。![]()
图2. 突变体N205C-G239C的结构分析。(A) N205C-G239C的三维结构。催化三联体用黄色棒状代表，突变位点用绿色棒状代表。(B)叠加N205C-G239C和Cgksingle bondK142的整体3D模型示意图。紫色模型代表突变体N205C-G239C，青色模型代表Cgksingle bondK142，N205C-G239C和Cgk-K142的催化三联体分别用紫色和青色棒表示。(C)突变体N205C-G239C模型。将催化隧道周围的"手指"区域编号为F1-F6。催化三联体E162-D164-E167以紫色棒状形式标记。(D)野生型κ-卡拉胶酶模型在5 Å内引入的二硫键周围显示氢键(黄色)。(E)突变体κ-卡拉胶酶N205C-G239C模型在引入的二硫键周围5 Å范围内显示氢键(黄色)和范德华力(橙色)。
6.N205C-G239C二硫键突变位点周围的相互作用发生变化二硫键突变位点周围的相互作用力显示，WT的氨基酸残基Asn205和Gly239在各自的5 Å范围内仅存在氢键(黄色虚线所示) (图2D)，而突变体N205C-G239C除了存在氢键(黄色虚线所示)外，还存在范德华(VDW) (用橙色虚线表示) (图2E)。在突变体N205C-G239C中，C205可以与周围的His179和Asp180残基形成三个额外的VDW相互作用。VDW在维持蛋白质骨架的刚性结构中起重要作用。额外的VDW可能有助于提高N205C-G239C的热稳定性。在其他酶如嗜热毛菌FAD依赖的氧化还原酶和枯草芽孢杆菌壳聚糖酶BsCsn46A中也观察到了类似的结果。将κ-新卡拉胶糖分别对接到野生型κ-卡拉胶酶及其突变体N205C-G239C的活性位点上。κ-新卡拉多糖与WT和N205C-G239C的结合能分别为-8.0和-9.4 kcal/mol。突变体较低的结合能表明其对κ-新阿卡波糖有较好的结合能力。κ角叉菜胶酶活性位点与其突变体N205 C-G239C的对接相互作用图如图3D(图3A和3C)和2D(图3B和3D)示意图所示。野生型κ-卡拉胶酶有9个残基通过11个氢键与κ-新卡拉胶糖相互作用，E162通过1个碳氢键与配体相互作用。W63、W66、W68、W94、A141、I148、W143、E164、Q256、N268、Q269和F270等12个残基通过范德华力s进一步稳定配合物。另外，R150、H182和R195三个残基通过3个阴离子相互作用s与配体相互作用。值得注意的是，突变体N205C -G239C比WT具有更多的相互作用键的类型和数量(图3D)。尽管N205C-G239C只有5个残基通过8个氢键与配体相互作用，但是 N205C-G239C的配体-酶复合物具有比WT更多的碳氢键，范德瓦尔斯力，pi-硫和pi-烷基。许多研究表明，酶与配体之间的相互作用可以影响酶的催化活性、底物结合亲和力和热稳定性。N205C-G239C与κ-新卡拉胶糖相互作用的增加可能是突变体κ-卡拉胶酶活性和热稳定性提高的原因。![]()
图3. WT和N205C-G239C的结构比较及其与κ-新碳酸酐酶(An-G4S-An-G4S)的相互作用。(A) WT和κ- neocarratetraose的三维受力分析图。(B) WT和κ-新碳酸酐酶的二维力分析图。(C) N205C-G239C和κ-新碳酸酐酶的三维力分析图。(D) N205C-G239C和κ-新碳酸酐酶的二维力分析图。(E)分子对接中野生型κ-卡拉胶酶氨基酸残基空间位置改变的示意图。(F)分子对接中N205C-G239C氨基酸残基空间位置改变的示意图。(G) WT (绿色)和N205C-G239C (紫色)叠加示意图。
在WT中，κ-新碳酸酐酶位于催化通道的中心(图3A)，而N205C-G239C中的κ-新阿拉伯糖偏向于催化通道的末端(图3C)。据报道，酶内部存在的隧道或深腔，提供了排除可能干扰反应进度的外界环境的能力，为催化创造了独特的环境。二硫键N205C-G239C的引入可能会影响酶的底物通道，使产物释放更快，加快酶促反应进度。对底物-4 ~ - 1位对接的κ -新阿卡拉糖进行编号(图3E和F )根据前文所述方法。其中，-4和-2位对应于3,6-脱水-D-半乳糖(An)，-3和-1位对应于D-半乳糖-4-硫酸酯(G4S)。在WT的F1 (以红色标示)指中，W66和Y63共同朝向-1亚位点(图3E)。在N205C-G239C中，W66以45°旋转方向朝向-3位，Y63以45°旋转方向朝向-3位(图3F和G)。这些结果表明突变体的产物能更大程度地释放到培养基中，从而加速酶促反应的进行。突变体F2区(橙色标记)的残基Q101经历了向外的横向运动，并且与WT (中的 Q101相比朝向-1亚位(图3F和G)。预测F2区域通过Q101，W95和Q100与底物建立直接连锁，并且这些残基与F1区域一起可以参与在催化隧道内包围寡糖的致密网络中的水分子的组成。Q101可以使水分子密集网络覆盖更广泛的区域，以便产物能够更大规模地释放，从而加速酶促反应。R195位于F5手指上，突变体中R195位点明显移位，指向-3和-4位点(图3F和G)，而WT中的R195指向 -2亚基。R195被认为是与G4S的带电硫酸盐基团结合并影响其热力学平衡的关键残基。突变体 R195的构象变化更有利于四糖中G4S 盐桥的形成。除了上述差异之外，N205C-G239C 的突变改变了指F3中重要残基R150的方向，其改变有利于An位于-2亚基(图3F和G)。在突变体中，残基R150位于-2和-1亚基之间，与WT (相比在空间上更接近于底物(图3E及F)。在与底物反应过程中，反应物与底物隧道中入口底物之间的相互作用随着反应距离的增加而增强，反过来，反应物与底物反应过程中酶的稳定性也随之增强。值得注意的是，F6中的氨基酸N268和C267(以青色标记)均位于催化裂解位点上方的-3和-2亚位(图3E和F)突变后，这两个氨基酸向外转移(图3G) ，表明碱性贴片结构具有精确识别催化位点和裂解反应的潜在机制。对WT和N205C-G239C在323K下进行MD模拟，分析κ-卡拉胶酶的构象稳定性。RMSD值越低，蛋白质结构的刚性越强。在323K下，WT和N205C-G239C的平均RMSD分别为0.32 nm和0.26 nm(图4)。RMSD结果表明，突变体N205C-G239C在323K下表现出比WT更强的刚性，进一步证明N205C-G239C的热稳定性得到了改善，能够更好地适应高温环境。Rg通常反映蛋白质结构密度的波动。蛋白质的Rg值越小，结构就越紧密。突变体 N205C-G239C(1.85 nm)的平均Rg值小于WT (1.90 nm)(图4B)，表明二硫键的引入增加了κ-卡拉胶酶的致密性。在某些情况下，RMSF可以显示蛋白质中氨基酸的柔韧性。更大的RMSF值表明更多的氨基酸灵活性。N205C-G239C在F93-A103，D180-V185和G280-M285(位置显示氨基酸残基灵活性显著增加(图4C)。参照323K时WT的RMSF值，N205C-G239C结构柔韧性增加和降低的区域分别用红色和蓝色表示(图4D及E)。结果表明，N205C-G239C柔韧性下降的区域主要集中在环状区(F1为W57-W69，F5为T148-Q160) ，柔韧性增加的区域主要集中在β-折叠区(F2为R92-Y106，F6为A261-N268)。预测 F1区Y63和W66与产物释放速率有关。在此范围内氨基酸刚性的增加可能保留了突变体N205C-G239C的酶活性。R150残基在F3区域的刚性增加也可能有助于维持突变体的热稳定性。预测F2区的三个氨基酸W95、Q100和Q101与水分子网络的组成有关。他们的灵活性增加可能使水分子覆盖更广泛的网络，提高酶活性的突变N205C-G239C。此外，预测F5区的R195和F6区的N268参与了基底隧道的封闭构象。两个残基的柔韧性增加可能有利于底物通道的扩展，从而提高突变体的酶活性。![]()
图4 . κ-卡拉胶酶和κ-新卡拉胶酶-酶复合物的分子动力学模拟。(A) 323 K时WT和N205C-G239C的RMSD分析。(B) 323 K时WT和N205C-G239C的Rg分析。(C) 323K时WT和N205C-G239C的RMSF分析。(D和E)323K时N205C-G239C相对于WT的柔性变化(变化超过0.05 nm)。红色是柔韧性增加的区域，蓝色是柔韧性降低的区域。(F) 323 K下κ-新酸催化葡萄糖-酶复合物的RMSD分析。(G) 323 K下κ-新酸催化葡萄糖-酶复合物的Rg分析。(H) 323 K下κ-新酸催化葡萄糖-酶复合物的RMSF分析。(I-K) WT与N205C-G239C在0 ns (I)、25 ns (J)、50 ns (K)三个模拟时间点的结构比对。绿色模型代表WT，紫色模型代表突变体N205C-G239C。使用HOLE对WT (L)和N205C-G239C (M)进行(L和M)底物通道分析。
在323 K下进行了κ- necarcaratose-enzyme复合物的MD模拟，以预测WT和N205C -G239 C在底物结合时的构象稳定性。WT和N205C -G239C的平均RMSD值均为0.27 nm(图4F)。突变体N205C -G239C的平均Rg值(1.92 nm)大于WT (1.85 nm)(图4G)。这可能是由于底物参与了反应，影响了蛋白质系统的溶胀程度。与κ-necaratatose结合后，N205C -G239 C的RMSF值与WT相比有明显的降低趋势(图4H)。简而言之，N205C -G239 C的刚度在Q28 -F48(位于环区)和I148 -Q160(位于F5)残基处显著增加。结合MD模拟轨迹分析发现，在模拟过程中，κ -角叉菜酶的一些结构发生了显著变化(图4I - K)，例如，突变体N205C - g239 C中由残基H204 - h208组成的β -sheet结构(图4I-K中红框表示)持续存在并稳定，但该β -sheet结构在WT中所有三个时间点(0 ns, 25 ns和50 ns)都消失了。这种从loop结构到β - sheet的转变可能有助于突变体的结构维持。此外，F2区域(用蓝色方框表示为图4I-K)和F5区域(用黑色方框表示图4I-K)与催化通道的组成密切相关。在模拟过程中，F2和F5区域有向外扩展的趋势，这与衬底隧道的加宽有关。此外，基于酶-底物复合物的MD模拟，进行HOLE分析，探索底物隧道的变化。结果表明，WT衬底隧道的最小和最大直径分别为0.73 nm和0.90 nm(图2)。突变体N205C -G239C的底物隧道最小直径为0.75 nm，最大直径为1.29 nm(图2 4M)。底物通道的拓宽有助于N205C-G239C酶活性的增强。通过液相电镜观察WT与N205C -G239C在含有κ新卡拉胶糖底物的环境下的反应，发现κ-卡拉胶酶底物通道的动态变化过程与预期一致。酶s在液体环境中的持续运动证明了拍摄到的κ-卡拉胶酶s是有活性的。观察了衬底隧道开口过程(图5)，从构象封闭状态(0 s)开始，最终逐渐恢复到封闭构象(8 s)。图5中也观察到中间结构。隧道在2 s和4 s时开始轻微扩张，在6 s时达到最大张开。成功捕获WT及其突变体N205C - G239C的构象变化过程，呈现并佐证了底物通道。![]()
图5. WT和N205C-G239C底物通道构象变化的LP-EM分析。(A-C) WT基底膜通道的逐渐开放和关闭。标尺：10 Nm。(D-F) N205C-G239C的底物通道的逐渐打开和关闭。标尺：10 Nm。
低聚糖片段中特定官能团的结构一般由FTIR确定。本研究利用FTIR对N205C- G239C从工业废渣中回收的κ卡拉胶寡糖进行了分析(图6A)。3600 cm 1处的吸收峰为羟基(OH)伸缩振动峰。1650 cm 1处的峰为羧基(C=O)的拉伸振动峰。1200 -10 00 cm 1的峰值是由C-O-C振动产生的，表明是一个吡喃糖环。970 cm 1处的峰为糖分子的振动吸收峰，为吡脲糖的不对称伸缩环振动。综上所述，从固体废渣中回收的低聚糖在4000 -500 cm 1区域内具有多糖的一般特征(图6A)。![]()
图6. 对回收的低聚糖和N205C-G239C处理后的κ-卡拉胶工业废渣进行FTIR、MS和SEM分析。(A)回收寡糖的FTIR分析。(B) N205C-G239C处理κ-卡拉胶工业废渣的FTIR分析。(C)回收寡糖的MS测定。(D)κ-卡拉胶工业废渣在×5.00 k的放大倍数下。(E) N205C-G239C在×5.00 k的放大倍数下处理废渣。(F)κ-卡拉胶工业废渣在×10.00 k的放大倍数下。(G) N205C - G239C在×10.00 k的放大倍数下处理废渣。
此外，用质谱法测定了回收的低聚糖的分子组成。在负模式下，检测到代表不同聚合程度的低聚糖(DP)特有的离子峰，主要包括[(An -G4S)] (DP2;403.3 m/z)， [(An -G4S) 2] 2 (DP4;394.4 m/z)， [(An -G4S) (An -G)] (DP4;709.4 m/z)，[(An -G4S) 2H] (DP4;789.0 m/z)，[(An G4S) 2Na] (DP4;811.3 m/z) (An为3,6-脱水α-D-半乳糖，G4S为β-D-半乳糖4-硫酸盐)。结果表明，N205C -G239C降解κ-卡拉胶工业废渣产生κ-卡拉胶四糖(DP4)和二糖(DP2)(图6C)。研究表明，将高分子量、高粘度的κ-卡拉胶降解为κ-卡拉胶寡糖可显著增强其生物利用度和生物活性，从而在医药、食品、农业和化妆品等领域展示出广泛的应用前景。κ-卡拉胶寡糖主要可以通过化学法和酶法制备。而酶消化法是生产和回收低聚糖的一种更绿色的方法。突变体κ-卡拉胶酶N205C - G239C可作为从κ-卡拉胶工业废渣中回收生物功能寡糖的有用工具。11.分析N205C-G239C处理κ-卡拉胶工业废渣对N205C-G239C处理前后的κ-卡拉胶工业废渣进行FTIR分析(图6B)。3600 -3250 cm 1范围内的峰值为nh1的拉伸振动。2820和2720 cm 1附近的吸收峰都对应于醛C-H拉伸带。水分子的弯曲振动产生了约1630 cm 1的吸收峰，表明珍珠岩中存在带有-OH键的分子水。此外，C-O的拉伸振动吸收表现为1300-1000 cm 1处的吸收峰。N205C-G239C处理后的废渣在788 cm 1附近的峰高(Si-O键吸收峰)比原始废渣强。上述FTIR数据显示，突变体N205C-G239C水解处理后，废渣的组成受到显著影响对N205C-G239C处理前后的κ-卡拉胶工业废渣进行了SEM分析。N205C-G239C处理试样呈珍珠状裂纹结构，气孔巨大(图6E和6G)，而未经处理的样品没有显示出多孔结构，只有几个大孔(图6D和6F)。影响孔径大小和孔径数量的主要原因是κ-卡拉胶产品工业化生产后原料残留造成的堵塞。此外，对N205C-G239C处理前后的κ-卡拉胶工业废渣进行了XRF分析。酶解前后废渣的主要元素类型是一致的，包括O、Na、Al、Si、P和K(表2)。酶解改变了固体废物样品的一些元素含量(表2)，其中S和Si元素的变化最大。硫酸盐基团是识别κ卡拉胶的重要指标之一。酶解后的废渣中硫含量明显降低(表2)，说明N205C-G239C能有效降解废渣中残留的κ-卡拉胶，释放出κ-卡拉胶低聚糖。酶解后废渣中单质二氧化硅的含量由22.49%提高到29.72%。工业废渣中含有大量的珍珠岩，珍珠岩的主要成分是二氧化硅。在本研究中，二氧化硅含量的增加表明可以利用酶解法从这些废渣中回收珍珠岩。综上所述，突变体κ-卡拉胶酶N205C-G239C可能是一种从κ-卡拉胶工业废渣中回收珍珠岩的有用工具。通过回收珍珠岩，可以减少自然资源的开采，并最大限度地减少固体废弃物残渣的积累。研究成果将推动κ-卡拉胶清洁生产技术的进步，促进κ-卡拉胶工业废渣的资源化利用。表2. N205C-G239C处理κ-卡拉胶工业废渣的元素分析。
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本研究利用Discovery Studio筛选到一个二硫键突变体N205C-G239C，显著提高了催化活性和热稳定性。通过分子对接、结构叠加、MD模拟轨迹分析、底物通道的HOLE分析对突变前后的微观结构进行分析。结果表明，二硫键的引入不仅使蛋白更有利于与底物结合，提高了整体结构的紧密性和刚性，而且突变体N205C-G239C比WT具有更宽的底物通道。这些结构变化可能是N205C-G239C催化活性和热稳定性提高的原因。此外，利用LP-EM观察了蛋白质构象变化和通道开闭的动态过程，验证了底物通道扩张现象。突变株N205C-G239C在处理κ-卡拉胶工业废渣和回收具有生物活性的κ-卡拉胶寡糖方面具有高效性和绿色性。本研究不仅在κ-卡拉胶酶的热稳定性和催化活性之间找到了一个合适的折衷方案，而且为改造生物催化剂的催化性能和酶法回收废渣提供了一种可行的、有针对性的方法。
原文：A disulfide bond mutant of Pseudoalteromonas porphyrae κ-carrageenase conferred improved therm ostability and catalytic activity and facilitated its utilization in κ-carrageenan industrial waste residues recyclingDOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.135573
