《IJBM》碳水化合物结合模块如何影响内切葡聚糖酶的催化特性

2024年8月，湖北大学的Qiuping Ran等人在International Journal of Biological Macromolecules上发表了一篇题为How carbohydrate-binding module affects the catalytic properties of endoglucanase的研究论文。

纤维素、甲壳素及其衍生物壳聚糖等天然多糖是非常重要且低成本的聚合物。壳聚糖和纤维素在可生物降解材料的可持续加工中发挥着重要作用。除了可以制备（纳米）纤维外，纤维素还可用于生物转化。纤维素由线性β-1,4-D-葡聚糖链组成。目前应用最广泛的纤维素转化方法是三种纤维素酶协同水解：内切葡聚糖酶（EG）切断纤维素链中的内部键，外切葡聚糖酶（CBH）从纤维素链末端逐步水解纤维素生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶（BG）水解纤维二糖释放葡萄糖。在纤维素生物转化的商业化过程中，纤维素酶的高成本是一个主要障碍。因此，人们付出了大量的努力来获得高催化效率的纤维素酶，以提高其商业化潜力。

大多数真菌纤维素酶由催化结构域（CD）和一个或多个碳水化合物结合模块（CBM）组成，这些模块通过高度灵活的糖基化连接子与CD紧密连接，并影响水解反应。CBM根据氨基酸序列相似性分为多个家族，目前碳水化合物活性酶数据库中记录了100个CBM家族。

CBM促进纤维素酶水解的主要机制是增加纤维素对纤维素酶的可及性。CBM可以将附着的CD带到底物表面，从而产生更高的蛋白质浓度，延长纤维素酶与底物的接触时间。结合位点内的芳香族氨基酸通过疏水堆积力、氢键和CH-π键控制CBM与底物之间的相互作用，并产生与微晶纤维素表面结合的疏水层。通常，在没有CBM的情况下，CD表现出较低的底物亲和力和催化性能。纤维素酶CD对特定底物的活性受其所附着的CBM的底物结合类型的影响。CBM还可能以非水解作用的形式对底物产生破坏作用，使纤维素表面松散或改变纤维素底物表面的结晶度。CBMs可以特异性、不可逆性、非均质性地破坏底物结构，导致纤维素表面变形和断裂，增加纤维素对纤维素酶的可及性，从而增强纤维素酶的内切葡聚糖酶活性。已有多项研究报道，辅助蛋白如牛血清白蛋白（BSA）、非离子表面活性剂、大豆蛋白等可以协同或保护纤维素酶，提高纤维素酶的酶解效率。此外，CBM1被发现可作为一种新型辅助蛋白，通过防止非生产性吸附来增强纤维素酶降解能力。CBM3是一种添加剂，可以增加酶混合物中的浆液糖化作用。综上所述,许多研究表明CBM在纤维素酶催化中以不同的方式发挥着积极作用。与传统所说的“有利作用”相反,在我们之前的研究中,发现CBM对CtCBH的催化并不是必需的。CBM不显著性效应的普遍性值得进一步探讨。

本文研究了CBM对来自Trichoderma viride的内切葡聚糖酶III（TvEG3）的催化活性和底物亲和力的影响。在早期的研究中，荧光蛋白被附加到CBM上，以更好地了解其结合特性。早期研究采用耗散监测石英晶体微天平（QCM-D）来监测CBM在不同纤维素表面的整个结合过程。本文报告了对来自不同生物体的四个CBM家族对不溶性底物的亲和力的组合评估。使用GFPCBM融合和QCM-D研究CBM结合能力。然后使用CBM酶融合研究具有高底物亲和力的CBM对催化活性的影响。

1.内源性CBM1对纤维素酶活性的影响

1.1.蛋白表达

TvEG3和TvEG3dc基因在毕赤酵母GS115中成功表达，并用His标签亲和层析技术纯化表达蛋白。纯化的重组蛋白溶液经SDS PAGE分析后呈现单一条带。

1.2.比活

采用不同底物检测TvEG3和TvEG3dc的比活性。实验均在最佳反应条件下进行，实验结果如表1所示。以CMC-Na为底物，TvEG3和TvEG3dc的比活力分别为51.97U/mg和49.48U/mg。以Avicel为底物，TvEG3和TvEG3dc的比活分别为9.75U/mg和9.44U/mg。以滤纸为底物测定TvEG3和TvEG3dc的比活性分别为0.36U/mg和0.37U/mg。CBM1的缺失对TvEG3的比活性无显著影响，独立样本T检验显示无显著差异。综上所述，本实验采用了三种不同的底物来确定TvEG3和TvEG3dc的比活性。TvEG3和TvEG3dc对CMC、Avicel、滤纸的比活性无明显差异，说明TvEG3自身的CBM1并不影响催化活性。

1.3.TvEG3和TvEG3dc的底物吸附能力表征

本实验采用两种纤维素底物滤纸及Avicel，检测TvEG3和TvEG3dc在底物上的吸附能力，实验结果如图1所示。对于滤纸底物，吸附后TvEG3和TvEG3dc的蛋白质浓度分别为0.25 mg/mL和0.51 mg/mL。TvEG3dc的蛋白质浓度在误差范围内与其初始浓度相同。可以认为其没有吸附在滤纸底物上。TvEG3在滤纸底物上的吸附量为5.01mg蛋白/g底物。可以看出，对于Avicel底物，吸附后TvEG3和TvEG3dc的上清液蛋白浓度分别为0.44 mg/mL和0.50 mg/mL。TvEG3dc的蛋白质浓度与初始浓度没有变化，可以认为它没有吸附到Avicel上。根据公式（2）计算TvEG3在Avicel上的吸附容量为1.47mg蛋白质/g底物。

这些结果表明，TvEG3自身CBM1的丢失直接影响其结合纤维素底物的能力。本研究结果与我们之前的研究一致，CBM不是纤维素酶催化活性的必要条件。

2.CBMs的吸附能力表征

2.1.蛋白表达

在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了CBM1-GFP、CBM2-GFP、CBM3-GFP、CBM4-GFP的可溶性蛋白，并单独表达GFP作为对照。纯化的融合蛋白经SDS-PAGE检测，目的条带清晰、单一。CBM1-GFP、CBM2-GFP、CBM3-GFP、CBM4-GFP和GFP 预测的蛋白质大小带分别为35kD、42.1kD、48.5kD、49.6kD和30.3kD。SDS-PAGE 结果如补充材料图S3所示。

2.2.通过QCM-D监测CBMs在底物上的吸附性

图2表示了不同CBM家族引起的CNC、CNF、LF和SiO2上频率的变化。当CBM-GFPs最初加载时，它会吸附到薄膜上。薄膜质量的增加导致QCM频率的快速下降。CBM1-GFP、CBM2-GFP、CBM3-GFP和CBM4-GFP在LF和SiO2上具有相似的性能（图2a和2b）。当加载CBM2-GFP时，LF和SiO2上的QCM频率下降最多，其次是CBM4-GFP、CBM1-GFP和CBM3-GFP。当加载CBM2-GFP时，CNC上的QCM频率下降最多，其次是CBM1-GFP、CBM3-GFP和CBM4-GFP（图2c）。在CNF薄膜上，当CBM2-GFP和CBM3-GFP时，LF和SiO2上的QCM频率下降最多（图2d）。CBM1-GFP和CBM4-GFP以相同的低质量吸附在CNF膜上。可以很容易地得出结论，与其他三种CBM相比，CBM2对不溶性底物表现出更优异的吸附能力。考虑到CBM2在LF上也有很强的吸附能力，而CBM3在LF上的吸附能力较弱，在CNF上的吸附能力与CBM2相同，因此可以认为CBM3在纤维素上具有很高的底物亲和力。

为了阐明吸附在薄膜上的CBM的构象，补充材料S4中展示了频率变化与能量耗散的关系图。耗散值的变化与薄膜粘弹性的变化相对应。吸附在LF薄膜和SiO2上的CBM-GFPs层的剖面呈现出几乎相同的趋势，具有相似的斜率。随着CBM3-GFP的流入，吸附的CNC薄膜变得柔软而有弹性，导致耗散增加且斜率较大。其构象变得比初始层更软，并且CBM2-GFP、CBM1-GFP和CBM4-GFP在CNC薄膜上表现出更为刚性的吸附。当四种CBM-GFP的吸附量小于−50Hz时,CNF膜上的能量耗散趋势相同。当CBM2-GFP和CBM3GFP的吸附量大于−50Hz时,其构象变得更软,直至达到吸附平衡,且CBM2-GFP在4种CBM-GFP中表现出最软的吸附。

2.3.CBM吸附能力的表征

考虑到CBM1和CBM4在QCM-D纤维素膜上的吸附行为相似，后续实验中不再讨论CBM1。采用不溶性滤纸和玉米秸秆定量表征CBM-GFP的吸附能力，并根据公式计算吸附率。结果如图3所示。CBM2-GFP、CBM3-GFP、CBM4-GFP在滤纸上的吸附率分别为75.78%、84.69%、63.14%。CBM2-GFP、CBM3-GFP、CBM4-GFP在玉米秸秆上的吸附率分别为50.8%、63.75%、18.73%。GFP在滤纸和玉米秸秆上的吸附率分别为3.7%和5.56%，这意味着GFP并不影响CBMs的吸附容量。可以看出，本试验所用的CBMs在滤纸和玉米秸秆上表现出明显的吸附结合能力。CBM3-GFP在滤纸和玉米秸秆上的吸附能力强于另外两种CBM-GFP；CBM4-GFP在滤纸或玉米秸秆上的吸附率低于CBM2-GFP和CBM3-GFP。并且这种差异在紫外线照射下的滤纸中也可以清楚地看到（图S5c）。本实验的结果与QCM-D的结果一致。然后在紫外分析仪下观察CBM-GFPs在滤纸和Avicel上的吸附行为，结果显示CBM-GFPs在滤纸和Avicel上呈现出明显的绿色荧光。这些结果如图S5a和S5b所示。即使用缓冲液清洗三次，CBM2-GFP和CBM3-GFP仍然吸附在滤纸和Avicel上。

2.4.通过CLSM观察CBMs在底物上的吸附行为

利用CLSM进一步观察了玉米秸秆和滤纸上吸附的CBM-GFPs，显微镜结果如图S6所示。玉米秸秆吸收CBM4-GFP后强度最弱，与2.2.2中定量数据的结果相符。CBM2-GFP和CBM3-GFP比CBM1-GFP和CBM4-GFP具有更强的底物吸附和结合能力。QCMD实验结果显示，CBM2-GFP对木质素底物有比CBM3-GFP更强的吸附能力。从木质纤维素生物质的酶水解角度来看，对木质素底物的高亲和力将降低纤维素对纤维素酶的可及性。基于这些实验结果，CBM3被用于与GH5内切葡聚糖酶融合的后续实验。

3.外源CBM3对纤维素酶活性的影响

3.1.蛋白表达

TvEG3dcCBM3基因在毕赤酵母GS115中成功表达，并用His标签亲和层析纯化所得蛋白。纯化的重组蛋白溶液经SDS PAGE分析后呈现单一条带（图S2）。

3.2.纤维素酶活性

采用不同底物检测TvEG3dcCBM3的比酶活力，实验结果如表2所示。以CMC-Na为底物，TvEG3dcCBM3的比酶活为107.79U/mg。与TvEG3相比，TvEG3dcCBM3的CMC-Na比活力提高了107.41%，说明高底物亲和力的外源CBM3可以提高内切葡聚糖酶对可溶性底物的催化活性。以Avicel为底物时，TvEG3dcCBM3的比活是46.07U/mg。TvEG3dcCBM的Avicel比活力较TvEG3提高了372.51%，说明高底物亲和力的外源CBM3可以提高内切葡聚糖酶对不溶性底物Avicel的催化活性。以滤纸为底物测定TvEG3dcCBM3的比活力为0.24U/mg。TvEG3dcCBM3的滤纸比活力与TvEG3相比降低了33.33%，说明具有高底物亲和力的外源CBM3降低了内切葡聚糖酶在不溶性底物滤纸上的催化活性。

综上所述，TvEG3和TvEG3dc对CMC、Avicel、滤纸的催化活性没有明显差异，说明其自身的CBM1不影响GH5催化活性。外源CBM3的替代显著提高了TvEG3对CMC-Na和Avicel的比活性，但降低了TvEG3对滤纸的比活性。TvEG3、TvEG3dc、TvEG3dcCBM3的最适温度均为70℃。TvEG3、TvEG3dc和TvEG3dcCBM3的最适pH值为4.0（图S7）。CBM不影响GH5内切葡聚糖酶的最佳反应条件。进一步采用CMC-Na检测内切葡聚糖酶的动力学参数，根据Mi常数方程得到3种内切葡聚糖酶的kcat值，结果见表S2。TvEG3dc、TvEG3dc和TvEG3dcCBM3分别为29.2761min-1、53.4767min-1和129.4559min-1。的kcat。

3.3.纤维素酶嵌合体的底物吸附能力的表征

根据之前的研究结果，CBM3的替换对GH5对不溶性底物的比活性有不同的影响。探究这种影响的差异是如何造成的。本次实验采用了两种纤维素底物滤纸及Avicel，检测了TvEG3dcCBM在底物上的吸附能力，实验结果如图4所示。可以看出，对于Avicel，TvEG3dcCBM3吸附后上清液蛋白浓度为0.19mg/mL。根据公式（2）计算TvEG3dcCBM3在Avicel上的吸附容量为6.59mg蛋白/g基底物。TvEG3dcCBM3与Avicel的结合能力比TvEG3高出约348.3%。对于滤纸，吸附后TvEG3dcCBM3的蛋白浓度为0.38mg/mL。TvEG3dcCBM3在滤纸上的吸附容量为2.42 mg蛋白质/g底物。TvEG3dcCBM3与滤纸的结合能力较TvEG3降低了约51.7%。CBM3的替代提高了TvEG3对Avicel底物吸附的能力，这也反映了Avicel底物比活的提高。CBM3的替代降低了TvEG3在滤纸上的吸附能力，也体现在滤纸比活性的降低上。

4.建模评估

TvEG3、TvEG3dc、以及TvEG3dcCBM3的结构由Phyre2得到，如图5所示。使用PROCHECK分析预测的3D结构的结构准确性，Ramachandran图如图5所示。TvEG3的Ramachandran图显示82.2%的残基位于最有利区域，15.4%的残基位于额外允许区域，1.5%位于大体允许区域，0.9%的残基位于不允许区域（图5d）。TvEG3dc的Ramachandran图显示86.8%的残基位于最有利区域，12.5%的残基位于额外允许区域，0.3%位于大体允许区域，0.3%的残基位于不允许区域（图5e）。TvEG3dcCBM3的Ramachandran图显示75.0%的残基位于最有利区域，20.7%的残基位于额外允许区域，1.3%位于大体允许区域，3.0%的残基位于不允许区域（图5f）。Ramachandran图的数据表明生成的TvEG3、TvEG3dc、TvEG3dcCBM3模型是可靠的。

为了分析TvEG3的活性位点及关键氨基酸，对GH5进行了多重序列比对，序列分析结果如图S8所示。多序列比对结果表明TvEG3的Arg150、Pro152、Asn237、Glu238位可能是关键氨基酸残基。TvEG3、TvEG3dc、TvEG3dcCBM3关键氨基酸的空间位置如图6所示。Asn237和Glu238部分呈不规则卷曲，Arg150和Pro152部分呈β-折叠,CBM对催化活性中心关键氨基酸的位置和二级结构没有影响，即CBM对其催化活性的影响与催化活性中心无关。在我们之前的研究中，删除CBM显著降低了CtCBH与Avicel的结合能力,但其催化活性并未降低。这表明CBM可能不是CtCBH催化所必需的。本研究也得到了类似的结果。CBM结合底物的能力并不完全对应于相应底物的催化活性。CBM的缺失对关键催化氨基酸的二级结构和位置没有影响，因此其自身的CBM1的底物亲和力对于GH5的催化活性不是必要的。然而，外源的高底物亲和力CBM3可以改变对不同底物的亲和力，从而导致不同底物的催化活性发生变化。

图6.TvEG3(a)、TvEG3dc(b)和TvEG3dcCBM3(c)关键氨基酸的整体和局部空间位置。关键氨基酸以粉红色突出显示。

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结论

DOI:https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.134653