《Int J Biol Macromol》M. thermophila GH31 α-葡萄糖苷酶合成α-葡寡糖的生化特性研究

2023年12月来自山东大学的Yu Fang等人在Int. J. Biol. Macromol发表了一篇题为Biochemical characterization of glycoside hydrolase family 31 α-glucosidases fromMyceliophthora thermophila for α-glucooligosaccharide synthesis的研究性论文。

α-葡萄糖苷酶催化α-葡萄糖苷键的水解，从而使葡萄糖从葡寡糖和多糖底物的非还原端释放出。它们广泛分布于昆虫、哺乳动物、植物和微生物中，主要参与淀粉和衍生寡糖的降解。根据底物特异性的不同，α-葡萄糖苷酶通常可分为三类：I型α-葡萄糖苷酶更喜欢水解具有异糖苷连接的底物（蔗糖和芳基α-葡萄糖），而II型α-葡萄糖苷酶对具有全糖苷键连接的底物（麦芽寡糖）具有更高的催化效率；III型α-葡萄糖苷酶更喜欢水解具有全糖苷键连接的底物，但对多糖（淀粉）也表现出较高的活性。根据序列相似性，α-葡萄糖苷酶可分为糖苷水解酶家族（GH）4、13、31、63、97或122；大多数α-葡萄糖苷酶属于GH13和GH31。其中，GH31 α-葡萄糖苷酶分布在许多不同的生物体中，参与各种重要的生物过程，如淀粉降解。它们主要是水解酶，但在底物浓度较高的情况下，GH31 α-葡萄糖苷酶也能催化转糖基化反应，将供体底物中的葡萄糖基转移到受体底物的OH基上，形成α-(1→2)、α-(1→3)、α-(1→4)和/或α-(1→6)糖苷键连接，从而合成不同大小的寡糖。GH31 α-葡萄糖苷酶采用保留α-双置换反应机制，通过含有两个官能团的β-葡萄糖苷酶中间体催化水解和转糖基化反应：分别位于保守区A和B的亲核团和一般酸/碱催化剂。亲核剂攻击异构碳，在酶和葡萄糖基之间形成共价中间体，而酸/碱催化剂则将质子转移到离去基团上。在随后的步骤中，酶-葡萄糖基共价中间体受到水分子的攻击，导致其水解并释放出葡萄糖。在转糖基化反应中，酶-葡萄糖基共价中间体被受体分子的OH基团攻击，从而生成转糖基化产物。

根据真菌GH31 α-葡萄糖苷酶的转糖基化反应，它们可以产生具有α-(1→6)、α-(1→4)、α-(1→3)和α-(1→2)连接的寡糖。例如，Aspergillus niger的GH31 α-葡萄糖苷酶AgdA被用来合成异麦芽寡糖（IMOs），这是一种功能性寡糖，含有2至5个糖基单位，主要由α-(1→6)连接，偶尔由α-(1→2)和α-(1→3)连接。据报道，来自Aspergillus sojae（AsojAgdL）、Aspergillus neoniger（AG）、Xantophyllomyces dendrorhous和Aspergillus oryzae ZL-1 （AgdA）的GH31 α-葡萄糖苷酶也能催化α-（1→6）连接的葡寡糖的合成。此外，据报道，来自Acremonium implicatum（AiG）、Paecilomyces lilacinus和A. niger（AgdB）的GH31α-葡萄糖苷酶可合成α-（1→3）连接的-（黑曲霉低聚糖）、α-（1→2）连接的-（曲二糖）和α-（1→4）连接的葡寡糖。据报道，这些α-葡寡糖具有益生作用。尤其是IMOs，它是重要的益生元寡糖，能刺激肠道有益菌增殖，增强人体免疫力。IMOs单独或与两种双歧杆菌（Bifidobacterium longum Bif10 和Bifodobacterium breve Bif11）和阿拉伯木聚糖共生混合物可缓解右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎。因此，IMOs被广泛用作食品工业中的功能性配料。在工业中，以淀粉为原料，通过α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶和α-葡萄糖苷酶的连续作用生产IMOs。GH31α-葡萄糖苷酶主要用于将淀粉制备的麦芽糖浆通过转葡糖基化反应转化为IMOs。

产品混合物中IMOs的含量决定了其质量。一般来说，需要进一步分离和提纯，以提高产品混合物中的IMOs含量。根据IMOs含量的不同，有两种从淀粉中生产的商用IMOs。由淀粉糖化和转糖基化生产的粗IMOs含有IMOs成分，占总干物质的50%以上；主要功能成分（异麦芽糖、泛糖和异麦芽三糖）占总干物质的35%以上。经过进一步提纯，IMOs含量可达到90%以上，从而得到主要功能成分占45%以上的精制IMOs产品。因此，具有较高转糖基化活性的α-葡萄糖苷酶是促进IMOs和其他类型葡寡糖生产的关键因素之一。此外，α-葡萄糖苷酶催化的转葡糖基化反应是在55 ℃的温度下进行的，这就需要使用耐热酶。然而，已报道的真菌α-葡萄糖苷酶的热稳定性太低，无法支持IMOs的高效合成。此外，转化效率低和GH31 α-葡萄糖苷酶供应不稳定也被认为是限制IMOs合成的主要因素。因此，不断挖掘具有更高转糖基化活性和更高热稳定性的新型GH31 α-葡萄糖苷酶对于提高IMOs的供应和质量至关重要。

本研究探讨了几种典型嗜热真菌的α-葡萄糖苷酶，并从嗜热Myceliophthora thermophila中选择两种α-葡萄糖苷酶（MT31α1和MT31α2）进行异源表达和生化分析。对MT31α1和MT31α2产生的寡糖的结构进行了表征；以30%的麦芽糖为底物，实现了MT31α1产IMOs。

1.嗜热真菌α-葡萄糖苷酶的基因组挖掘和生物信息学分析

以A. niger的AgdA为查询序列，通过Blastp分析鉴定了几种嗜热真菌和常温真菌中可能存在的α-葡萄糖苷酶。据报道，与A. niger的AgdA相比，A. nidulans的AgdB表现出较强的转糖苷酶活性和较弱的水解活性。通过Blastp搜索，在A. fumigatus和A. oryzae中分别发现了3个和5个GH31α-葡萄糖苷酶。为了探索具有更好耐热性的α-葡萄糖苷酶，作者进一步分析了几种嗜热真菌的基因组。在M. thermophila、R. emersonii、C. thermophilus和T. lanuginosa中，分别鉴定出GH31 α-葡萄糖苷酸酶的数量分别为6、6、4和1。由于不同的α-葡萄糖苷酶具有不同的底物和产物特异性，因此对这些α-葡萄糖苷酶进行了系统进化分析，以确定A. niger的AgdA和A. nidulans的AgdB的同源蛋白（图1）。在A. oryzae、A. fumigatus、A. nidulans、C. thermophilum、R. emersonii和M. thermophila中发现了与AgdA同源的蛋白质。它们与AgdA的序列相似性介于58.2%与78.3%之间。在A. oryzae、A. fumigatus、A. nidulans、T. lanuginose、C. thermophilum和M. thermophila中发现AgdB蛋白同源物，它们与AgdB的序列同一性在54.3%到81.8%之间。AgdA和AgdB同源蛋白的序列比对显示，A区域的亲核Asp残基和B区域的酸/碱催化剂Asp在所有分析的蛋白中都是保守的（图2）。结构研究表明，GH31 α-葡萄糖苷酶含有一个N端长隆起环（N-loop），它构成了活性位点口袋的一壁，因此参与了底物的结合。在N环中，一个Asp残基（Asp225，AgdA编号）参与了亚位点+1的形成，这个残基在所有分析的GH31 α-葡萄糖苷酶中都是保守的。GH31 α-葡萄糖苷酶β→α Loop7 中的残基也被证明与底物结合位点有关。AgdA的Phe693接近+1亚位点，该残基在所有AgdA和AgdB同源物中都是保守的，反映了其对底物结合的重要性。M. thermophila拥有一个AgdA和一个AgdB同源物，即XP_003658875.1 (MT31α1)和XP_003661084.1 (MT31α2)。

MT31α1与AgdA和AgdB的氨基酸序列同一性分别为58.2%和34.8%。相比之下，MT31α2与AgdB的序列同一性较高（52.6%），而与AgdA的序列同一性较低（38.8%）。MT31α1由973个氨基酸组成，理论分子量为107kDa。MT31α2由900个氨基酸组成，理论分子质量为100 kDa。保守结构域分析表明，MT31α1和MT31α2都具有一个Glyco_hydro_31结构域，包含MT31α1和MT31α2的催化残基(亲核剂和酸碱催化剂)，预测为Asp496和Asp663, Asp432和Asp617。MT31α1和MT31α2还含有一个GH31 N端结构域，该结构域包括上述N环。

图1.从嗜热真菌和常温真菌中鉴定出的GH31α-葡萄糖苷酶的系统发育分析。本研究中表征的M. thermophila ATCC 42464的 GH31 α-葡萄糖苷酶（MT31α1和MT31α2）用红色标出。

图2.A. niger的AgdA（XP_001402053.1）和A. nidulans的AgdB（EAA63748.1）同源GH31 α-葡萄糖苷酶的多序列比对。

2.MT31α1和MT31α2的异源表达和纯化

将不含预测内含子和信号肽的MT31α1和MT31α2的编码序列克隆到pPICZαA的EcoRI和NotI位点，在P. pastoris GS115中进行表达。MT31α2表达转化培养物的上清液对pNPG有活性，但MT31α1表达转化培养物的上清液对pNPG没有活性。通过检查MT31α1的编码序列，发现了一个错误的内含子。纠正内含子并重建表达载体后，MT31α1表达转化培养物的上清液也显示出pNPG的活性，证实了内含子预测的正确性。通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析和尺寸排阻色谱，从表达转化子的上清液中纯化了MT31α1和MT31α2蛋白。SDS-PAGE分析表明，MT31α1的表观分子质量（130 kDa）高于其预测的理论分子质量（107 kDa）（图3），这可能是由糖基化引起的，而糖基化在P. pastoris表达的蛋白质中很常见。值得注意的是，MT31α2的SDS-PAGE显示出三个主要条带（分别约为120 kDa、70 kDa和55 kDa）（图3）。为检测添加到蛋白C末端的Myc标签而进行的Western-blot分析显示，在120 kDa和55 kDa条带处有明显的信号（图3）。两条较小的条带（70 kDa和55 kDa）可能是全长蛋白质在蛋白质成熟过程中的蛋白水解产物，也有报道称A. nidulans（AgdB）、A. niger（AgdB）、A. implicatum（AiG）和A. sojae（AsojAgdL）中的α-葡萄糖苷酶也存在这种情况。对AgdB和AsojAgdL进行原生PAGE分析后发现，这两种蛋白水解产物存在一条单一的条带，这表明这两种蛋白水解产物形成了异源二聚体进行催化，AsojAgdL的结构分析也证实了这一点。在P. pastoris GS115中重组表达MT31α2时，全长MT31α2的存在（图3）表明其蛋白水解过程不够充分。

图3.纯化的MT31α1和MT31α2蛋白的SDS-PAGE (A)和Western-blot分析(B)。

3.MT31α1和MT31α2的生化表征

3.1.pH、温度、金属离子和化学试剂对MT31α1和MT31α2活性的影响

以pNPG为底物，评估了pH值、温度、金属离子和化学试剂对MT31α1和MT31α2活性的影响。MT31α1的最适pH值为4.5（图4）。在pH值介于4和5.5之间时，MT31α1保持了90%以上的最佳活性，而在pH值低于4.0和高于5.5时，MT31α1的活性迅速下降（图4）。MT31α2的最适pH值为6.5，在pH值为5.0至6.5时，其保持在80%以上（图4）。MT31α1的最适温度为65℃（图4）。在55℃和70℃之间，MT31α1的活性超过80%。MT31α2在50至65℃的温度范围内显示出75%以上的最佳活性，最适温度为60℃（图4）。pH稳定性分析显示，MT31α1和MT31α2在pH值为3.0至10.0的条件下高度稳定，培养24小时后保留超过80%的活性（图5）。温度稳定性表明，MT31α1在50℃和55℃条件下培养24小时后，其活性分别保留了75%和60%以上（图5）。相反，在60℃和65℃下，MT31α1的活性迅速下降，培养24小时后，仅保留了31%和5%的活性。在孵育24小时期间，MT31α2的活性在45℃时未受明显影响，但在50℃和55℃时，其活性逐渐下降至58%和44%（图5）。在60℃时，MT31α2迅速失活。评估了金属离子（2.5 mM）和化学试剂（1%）对MT31α1和MT31α2活性的影响（图6）。金属离子Cu2+、Ag+、Hg2+、Fe2+和Fe3+明显抑制MT31α1的活性，而Ag+、Fe3+、Pb2+和Mn2+则显著抑制MT31α2的活性（图6）。K+能轻微刺激MT31α1和MT31α2的活性，但没有发现金属离子能显著增强它们的活性（图6）。具体来说，2.5mM Cu2+和Fe2+会抑制MT31α1的活性，而对MT31α2的活性影响不大。因此，MT31α2对Cu2+和Fe2+的耐受性更强。与2.5mM NH4+一起培养不会影响MT31α1的活性，但会轻微刺激MT31α2的活性。离子螯合剂EDTA只对这两种酶的活性有轻微影响，这表明MT31α1和MT31α2的活性并不需要特定的金属离子。在测试的化学试剂中，1%SDS几乎完全灭活了MT31α1和MT31α2，而1%Triton-X100和1%Tween-80对它们的活性几乎没有影响。综上所述，MT31α1和MT31α2的稳定性明显高于AgdA，这表明在嗜热真菌中，α-葡萄糖苷酶获得了有利于蛋白质稳定性的突变。值得注意的是，与之前报道的α-葡萄糖苷酶相比，MT31α1在55℃的温度下显示出更高的温度稳定性，而这一温度正是目前通过α-葡萄糖苷酶催化的转糖基作用生产工业用IMOs的温度；因此，MT31α1在工业应用方面具有很大的潜力。

图4.pH和温度对重组MT31α1和MT31α2活性的影响。(A)MT31α1的最适pH;(B)MT31α1的最适温度;(C)MT31α2的最适pH;(D)MT31α2的最适温度。

图5.重组MT31α1(A和B)和MT31α2(C和D)的pH和温度稳定性。

图6.不同金属离子和化学试剂对重组MT31α1(A和B)和MT31α2(C和D)活性的影响。

3.2.MT31α1和MT31α2底物特异性及动力学分析

测定了MT31α1和MT31α2对各种潜在底物的活性，以评估它们的底物特异性（表1）。MT31α1对具有α-(1→4)连接的底物（麦芽糖和麦芽三糖）的活性最高，其次是α-(1→6)（异麦芽糖和异麦芽三糖）、α-(1→2)（曲二糖）和α-(1→3)（黑曲霉糖）。MT31α1对pNPG和可溶性淀粉的活性也相对较高，对甲基-α-吡喃葡萄糖苷的活性较低。MT31α2对具有α-(1→3)连接的底物（黑曲霉糖）具有较高的选择性，对具有α-(1→2)连接的底物（曲二糖）和α-(1→4)连接的底物（麦芽糖和麦芽三糖）也表现出相对较高的活性。值得注意的是，在具有不同α-葡糖糖苷键的底物中，MT31α2对具有α-（1→6）键的底物（异麦芽糖和异麦芽三糖）的活性明显较低。与MT31α2相比，MT31α1对pNPG的活性高出30多倍，对甲基-α-吡喃葡萄糖苷的活性高出2倍，而它们对可溶性淀粉的活性相当。MT31α1和MT31α2对蔗糖、海藻糖和葡聚糖70均无活性。总之，研究结果表明，MT31α1是一种具有广泛底物特异性的α-葡萄糖苷酶，而MT31α2则明显偏好具有α-(1→3)连接的底物。据报道，AgdB对具有α-(1→3)和α-(1→4)连接的底物有偏好，这与MT31α2的底物特异性相似。在系统发育上，MT31α2确实更接近于AgdB（图1）。值得注意的是，与MT31α2相比，MT31α1对具有α-(1→6)连接的底物的偏好明显更高。GH31 α-葡萄糖苷酶β→α Loop1中的芳香残基已被证明参与底物结合位点的形成，并且是底物连接特异性的重要决定因素。具体来说，β→α Loop1中含有Tyr和Trp的GH31 α-葡萄糖苷酶分别表现出对具有α-(1→4)和α-(1→6)连接的底物的偏好。结构研究表明，底物结合位点+1上的Trp残基具有较大的尺寸和刚性结构，可能会限制葡萄糖基单元的柔性α-（1→6）连接，从而促进催化。事实上，MT31α1在β→α Loop1中有一个Trp残基（W343，AgdA编号），这与它对α-（1→6）连接底物的高活性是一致的。不过，MT31α1对具有其他类型糖苷键连接的底物[α-(1→2)、α-(1→3)和α-(1→4)]也具有很高的活性。MT31α1具有广泛的底物特异性，其决定因素值得进一步研究。相比之下，MT31α2有一个Tyr残基（MT31α2中的Y289）（图2）。这与研究人员对底物特异性的测定结果一致，即MT31α2对具有α-(1→6)连接的底物的偏好较低。GH31α-葡萄糖苷酶的N端长凸环（N-loop）已被证明形成活性位点口袋的一壁，因此参与底物结合。N环中间部分的氨基酸残基变化很大（图2），可能有助于确定MT31α1和MT31α2的底物特异性。

表1.MT31α1和MT31α2的底物特异性

表2.MT31α1和MT31α2与pNPG和麦芽糖的动力学

以麦芽糖为底物，GH31α-葡萄糖苷酶可以同时催化释放葡萄糖的水解反应和释放葡萄糖形成潘糖的转糖基化反应（如下所述）。MT31α1对麦芽糖的水解活性表现出明显的底物抑制。经测定，MT31α1对麦芽糖水解活性的Km、Vmax和Ki值分别为2.62±0.37 mM、186.9±8.04 U/mg和593.3±156.7 mM。相反，MT31α1对麦芽糖的转糖基活性遵循Michaelis-Menten方程，其Km和Vmax值分别为187.9±22.04 mM和469.0±31.72 U/mg。当麦芽糖浓度为20 mM时，MT31α1的水解活性最高。当麦芽糖浓度高于100 mM时，MT31α1的转糖基活性高于其水解活性。综上所述，研究结果表明，底物浓度对MT31α1的水解和转糖基活性有显著影响。

图7.在298k的D2O中记录的30%麦芽糖与MT31α1和MT31α2培养产物混合物的1 H NMR图谱。

图8.以30%麦芽糖为底物的MT3α1反应产物的HPLC分析。G：葡萄糖；M2：麦芽糖；I2：异麦芽糖；M3：麦芽三糖；P：潘糖；I3：异麦芽三糖。

图9.MT31α2与麦芽糖孵育反应产物的HPLC分析。G:葡萄糖;M2:麦芽糖。

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讨论

DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.126452