2024年7月来自中国海洋大学的Jingjing Shen等人在Carbohydrate Polymers发表了一篇题为Biochemical characterization and cleavage specificities analyses of three endo-1,3-fucanases within glycoside hydrolase family 174的研究性论文。
Abstract
近几十年来，硫酸化岩藻糖因其多样的生物活性而引起了广泛的研究兴趣。岩藻多糖酶是研究硫酸化岩藻糖的重要工具。本研究报道了三种GH174家族的内切-1,3-岩藻多糖酶的生物信息学分析和生化特性。其中，Fun174Rm和Fun174Sb在已报道的岩藻多糖酶中的最适反应温度最高，Fun174Sb具有良好的热稳定性和催化效率。Fun174Rm显示出随机的内切作用方式，而Fun174Ri和Fun174Sb则以进行性方式水解硫酸化岩藻糖。UPLC-MS和NMR分析证实，这三种酶催化了Isostichopus badionotus中硫酸化岩藻糖中Fucp2S和Fucp2S之间α（1→3）键的裂解。这些酶表现出了新的裂解特异性，可以在亚位点-1和+1接受α-Fucp2S残基。这些生物技术工具的获得将有助于硫酸化岩藻糖的深入研究。
01
简介
硫酸化岩藻糖是一种重要的海洋多糖，主要由硫酸化的α-L-Fucp残基组成。它们具有多种生物特性，包括抗肿瘤、抗凝血、抗脂肪形成、抗炎、胃保护等。此外，实验证明硫酸化岩藻糖还可用作骨组织再生和伤口敷料的支架。因此，硫酸化岩藻糖可被视为天然功能成分，可用于开发新药物或健康食品等潜在的工业应用领域。
岩藻多糖酶是一种内切酶，能够特异性地裂解硫酸岩藻糖中α-L-Fucp残基之间的糖苷键。由于具有解聚特异性，岩藻多糖酶被认为是研究硫酸岩藻糖结构和建立构效关系的有效工具。根据α-L-Fucp链的裂解情况，可将其分为内切-1,3-岩藻多糖酶和内切-1,4-岩藻多糖酶。截至2023年11月，岩藻多糖酶根据碳水化合物活性酶（CAZy）分类（http://www.cazy.org），分为四个糖苷水解酶家族，即GH107、GH168、GH174和GH187。GH107家族包含内切-1,4-岩藻糖酶和内切-1,3-岩藻糖酶，而GH168、GH174和GH187家族的所有已表征的酶都是内切-1,3-岩藻糖酶。GH107和GH168家族中分别有18种和2种酶被不同程度地报道过。然而，在GH174和GH187家族中仅表征了一种酶。
生物信息学分析的发展为糖苷水解酶的研究提供了极大的便利。前期研究人员通过生物信息学分析鉴定了GH174家族中多个潜在成员的酶活性。初步实验结果表明，GH174家族中的三个蛋白WP_018969589.1、KLU01157.1和NBS51666.1对（1→3）连接的硫酸岩藻糖具有明显的活性。这三种蛋白质先后被命名为Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb，它们与GH174家族唯一已鉴定的成员的相似性较低（<31%）。推测它们可能具有不同于之前报道的GH174家族岩藻多糖酶的新的酶学特性。因此，随后阐明了这些蛋白质的生化特性、水解模式和裂解特异性。这里描述的新型酶可能有助于硫酸化岩藻糖和内切-1,3-岩藻糖酶的生物技术应用。
02
结果
1.序列分析
Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb编码了458、601和484个氨基酸残基，这些残基含有信号肽，分别为Met1-Ala31、Met1-Ala32和Met1-Ala19。CAZy注释显示，它们都具有GH174家族的催化结构域，即分别为Met47-Phe457、Ser75-Ala552和Ser55-Lys446。以前的报告已经明确了三个残基，即D119、E120和E218，是GH174家族中唯一已鉴定的成员的酶活性所必需的。多序列比对表明，所报道的关键残基在Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb中是保守的（即Fun174Rm中的D117、E118和E123；Fun174Ri中的D152、E153和E268；Fun174Sb中的D129、E130和E210）。局部比对分析表明，这三种蛋白质与Fun174A的蛋白质序列同一性分别为30.74%、29.47%和26.26%。由Fun174Rm、Fun174Ri、Fun174Sb、Fun174A和GH174家族其他假定蛋白构建的系统发育树表明，前三个蛋白与Fun174A分支分离（图1）。此外，研究还发现这三个蛋白和Fun174A起源于三个生物门类，包括拟杆菌门、浮霉菌门和疣微菌门（图1）。序列的新颖性、与Fun174A的进化位置相距甚远以及来源生物的多样性表明，这三种蛋白可能具有不同于Fun174A的新特性，值得进一步研究。
图1.Fun174Rm、Fun174Ri、Fun174Sb及其同源物的系统发育分析。
2.克隆和表达
将编码Fun174Ri的基因克隆并在大肠杆菌中表达。含有Fun174Rm和Fun174Sb的重组质粒也成功实现了异源表达。通过Ni亲和层析从细胞裂解液中纯化了这三种重组蛋白，每种重组蛋白都带有六个组氨酸标签。经SDS-PAGE检测，纯化后的蛋白单独显示为一条条带（图2），分子量约为54.3、70.5和56.8kDa，与理论值51.2、68.4和53.7kDa相符。经测定，Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb对来自I. badionotus的（1→3）连接硫酸化岩藻糖的活性分别为2.5±0.1 U/mg、5.2±0.1 U/mg和29.3±2.1 U/mg。
图2.纯化的重组Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb的SDS-PAGE。
3.生化特性
Fun174Rm在50℃和pH 8.5时的酶活性最高（图3A，B）。它在4℃和25℃下储存24小时后仍能保持稳定（图3C），在5.0至9.5的pH值范围内孵育2小时后仍能保持保留其原始活性的80%以上（图4A）。Fun174Ri在35℃和pH值为6.5时活性最高（图3D、E）。它还能在4℃和25℃储藏24小时后保持稳定（图3F），并在5.0至10.5的pH范围内保持稳定（图4C）。Fun174Sb的最佳反应条件是35-50℃和pH 7.5（图3G、H）。它在4℃、25℃和30℃下都很稳定（图3I），在40℃下储存24小时后仍能保持79.7%的初始活性，这表明它具有良好的热稳定性。Fun174Sb可在4.0至10.5的pH范围内保持稳定（图4E）。这三种酶在不使用NaCl的情况下也显示出活性（图4B、4D、4F），这表明它们具有不依赖于盐的特性。本研究还测定了金属离子对这些酶的活性（表1）和动力学常数（表2）的影响。
在所有已报道的岩藻多糖酶中，Fun174Rm和Fun174Sb的最佳反应温度最高。Fun174Sb具有良好的热稳定性，因为迄今为止其他已表征的岩藻多糖酶在40℃下的温度稳定性相对较低。这一特点在工业应用中具有良好的应用前景。金属离子对所表征的岩藻多糖酶活性的影响各不相同，这意味着岩藻多糖酶的催化机理存在差异。
与Fun174A相比，三种酶的Km值相对较低，这表明Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb具有更高的底物亲和力。此外，Fun174Sb的kcat值最高，证明其催化效率最高。这些有利的动力学特性表明，本研究中的三种酶可用作水解硫酸化岩藻糖的活性催化剂。
图3.生化特性：(A)Fun174Rm的最适温度；(B)Fun174Rm的最适pH；(C)Fun174Rm的热稳定性；(D)Fun174Ri的最适温度；(E)Fun174Ri的最适pH；(F)Fun174Ri的热稳定性；(G)Fun174Sb的最适温度；(H)Fun174Sb的最适pH；(I)Fun174Sb的热稳定性。
图4.生化特性：（A）Fun174Rm的pH稳定性；（B）NaCl浓度对Fun174Rm活性的影响；（C）Fun174Ri的pH稳定性；（D）NaCl浓度对Fun174Ri活性的影响；（E）Fun174Sb的pH稳定性；（F）NaCl浓度对Fun174Sb活性的影响。
表1.金属离子和化学品（1mM）对Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb活性的影响。
表2.以I. badionotus硫酸化岩藻糖为底物的三种酶的动力学常数
4.水解模式
在解聚的初始阶段（0-30分钟），监测到底物的分子量迅速下降（图5A、B、C），证实Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb是内切水解酶。根据HPSEC-RID显示的Fun174Ri和Fun174Sb的寡糖图谱，保留时间为24min的组分（图5B，C）持续增加，且在反应产物中含量始终占优势，表明这两种酶以进行性方式降解硫酸化岩藻糖。同时，在Fun174Rm的HPSEC-RID结果中（图5A），保留时间为20分钟的组分在降解初期有所增加，并在0-4h的反应中成为主要产物；保留时间为24分钟的组分在反应过程中持续累积，并在最终产物中成为主要产物。这些现象证实Fun174Rm以随机内切方式水解硫酸化岩藻糖。
根据之前的报道，Fun174A是一种内切-1,3-岩藻多糖酶。也就是说，Fun174Ri和Fun174Sb与Fun174A表现出相同的水解模式，而Fun174Rm在水解硫酸化岩藻糖时表现出与Fun174Ri、Fun174Sb和Fun174A不同的水解模式，这表明GH174家族中水解模式存在多样性。在此之前，研究人员已经证实了GH168家族存在水解模式多样性，这表明在一个糖苷水解酶家族中经常会发现不同的水解模式。
图5.对Fun174Rm(A)、Fun174Ri(B)和Fun174Sb(C)催化的硫酸化岩藻糖水解产物进行HPSEC-RID分析。
图6.Fun174Rm(A)、Fun174Ri(C)和Fun174Sb(E)最终产物的总离子色谱图。Fun174Rm(B)、Fun174Ri(D)和Fun174Sb(F)主要水解产物的质谱通过UPLC-MS测定。
图7.Fun174Rm最终产物中主要成分的1H NMR(A)、COSY(B)、NOESY谱图；Fun174Ri最终产物中主要成分的1H NMR(C)、COSY(D)、NOESY谱图；Fun174Sb最终产物中主要成分的1H NMR(E)、COSY(F)、NOESY谱图。
表3.Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb分别降解产生的岩藻四糖的1H 化学位移
图8.以Isostichopus badionotus的硫酸化岩藻糖为底物的Fun174Rm（A）、Fun174Ri（B）和Fun174Sb（C）最终产物中主要成分的TOCSY图谱。
图9.Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb最终产物中主要成分的结构。
03
结论
在大肠杆菌中异源表达了三种GH174家族内切-1,3-岩藻糖酶Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb。与其他已表征的岩藻糖酶相比，Fun174Rm和Fun174Sb表现出最高的最适反应温度，Fun174Sb对硫酸岩藻糖表现出良好的热稳定性和催化效率。Fun174Rm以随机方式降解硫酸化岩藻糖，这与Fun174Ri、Fun174Sb和Fun174A的进行性水解模式不同。Fun174Rm、Fun174Ri和Fun174Sb的-1和+1亚位点可容纳Fucp2S。这三种内切-1,3-岩藻糖酶所表现出的多种水解模式和新的裂解特异性揭示了GH174家族的多样性。本研究中描述的三种内切-1,3-岩藻糖酶可用作水解硫酸岩藻糖的生物技术工具。
DOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122083
END
前期回顾
《Food Chemistry》海洋来源的海藻黄杆菌中一种新型α-L-岩藻糖苷酶的发现、鉴定及其在2′-岩藻糖乳糖生产中的应用
