《Angew. Chem. Int. Ed.》硫酸软骨素蛋白聚糖糖肽的固相支持化学酶法合成与分析
文摘
科学
2024-10-25 20:45
江苏
2024年5月，来自Michigan State University的Po-han Lin等人在Angewandte Chemie上发表了一篇题为Solid-Phase-Supported Chemoenzymatic Synthesis and Analysis of Chondroitin Sulfate Proteoglycan Glycopeptides的研究性文章。
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通讯单位：Department of Chemistry, Michigan State University, East Lansing, Michigan, 48824 United States
Abstract
蛋白聚糖(PGs)是由糖胺多多糖(GAG)通过四糖连接区与核心蛋白连接而成，在许多重要的生物学事件中发挥作用。PG糖肽的化学合成具有极大的挑战性。在本工作中，表达了合成硫酸软骨素(CS)PG(CSPG)所需的酶，并建立了合适的酶反应顺序。为了加速CSPG的合成，将多肽受体固定在固相上，并将多多糖单元直接酶促连接到多肽上。随后的酶链延长和硫酸盐化导致了CSPG糖肽的成功合成。CS十二糖糖肽是迄今为止合成的最长的均一CS糖肽。酶促合成的效率远高于化学合成相应的CS糖肽，可将合成步骤减少80%。CS糖肽的结构经质谱学和核磁共振确证。此外，还研究了CS糖肽与组织蛋白酶G的相互作用。糖链的硫酸化是与组织蛋白G结合的重要途径，这一有效的化学酶策略为研究PGs的结构和功能开辟了新的途径。
蛋白聚糖（PGs）是糖蛋白的一个家族，通常存在于细胞表面和细胞外基质中。它们在许多生物学事件中起关键作用，包括细胞增殖、炎症和病毒感染。PG含有一个或多个糖胺多糖（GAG）链，其通过与葡萄糖醛酸（GlcA）-β1-3-半乳糖（Gal）-β 1 - 3-半乳糖（Gal）-β 1 - 4-木糖（Xyl）-β1-Ser（GlcAβ1 - 3Galβ1 - 3Gal β1-4Xylβ1 Ser）序列的典型四糖键与核心蛋白骨架上的丝氨酸（Ser）残基共价缀合。蛋白多糖的GAG链可以是硫酸软骨素（CS）或硫酸乙酰肝素（HS），形成CS蛋白多糖（CSPG）或在多糖链的各种羟基处具有硫酸化的HS蛋白多糖。天然存在的PGs的硫酸化模式是异质的，导致大的结构差异。
传统上，PG的生物学功能被认为通常由所连接的多糖链指导。然而，越来越多的研究表明核心蛋白也很重要，核心蛋白和多糖链可能对PG的生物学功能表现出协同效应。为了更深入地了解PG的功能并破译多糖和核心蛋白各自的作用，必须获得结构明确且均一的糖肽和PG。由于它们的高度异质性，几乎不可能从天然来源纯化同质PG结构。已经开发了几种策略用于合成含有天然四糖键区的HS和CS糖肽。含GAG的糖肽的化学合成是一项艰巨的挑战，源于所需的一系列复杂的保护基团操作、糖基化反应、化学硫酸化以及典型肽和GAG合成条件之间的不相容性。迄今为止制备的最长的HS和CS糖肽在肽主链上带有八糖。这些合成是繁琐的，对于一些靶，所需的合成步骤总数远远超过100。最近，Huisgen炔叠氮环加成反应被用于将HS与带有炔基酪氨酸的蛋白质骨架缀合。虽然具有突破性，但这些PG模拟物含有异质多糖，并且多糖链通过非天然三唑部分连接到核心蛋白中的酪氨酸。为了加快天然四糖连接区和CS糖肽的合成，本研究采用固相支持化学酶促法。其基本原理涉及PG合成所需酶的克隆和表达。随后将肽骨架偶联到琼脂糖凝胶珠（交联琼脂糖基珠）上，随后进行连续几轮酶促延伸和修饰。然后在温和的反应条件下释放形成的天然四糖连接区和CS-承载糖肽，而不影响敏感的糖肽。利用这种强大的策略，我们成功地产生了多个四糖键轴承糖肽轴承不同的氨基酸序列的骨干，以及CS轴承糖肽的不同长度的毫克规模。这些确定的糖肽的可用性使得能够通过NMR和MS进行结构分析。此外，研究了糖肽与潜在结合剂组织蛋白酶G（CatG）的亲和力，并通过计算建模进行了合理化，证明了聚糖硫酸化对CatG结合的重要作用。
在建立用于PG合成的可行酶促途径中存在多个挑战，其包括鉴定催化合成的合适酶、酶的产生以及从水性反应介质中分离高极性产物的耗时过程。为了加快合成和减少纯化高极性糖肽所需的时间，我们研究了在固相上进行PG糖肽的酶促合成的可能性。已经报道了用于聚糖或糖肽的酶促合成的各种固体载体，其包括聚乙二醇聚丙烯酰胺共聚物（PEGA）、胺官能化二氧化硅、可控孔玻璃（CPG）、和热响应性水溶性聚合物。虽然它们已经证明与酶的相容性，但每种固体支持物都需要独特的考虑。例如，溶胀树脂如PEGA，由于其有限的孔径，可能证明不足以用于需要分子量高于50 kDa的酶的反应。相反，与溶胀固体支持物相比，非溶胀固体支持物如胺官能化的二氧化硅和CPG可表现出与某些酶的较低相容性。热响应性水溶性聚合物可以为酶促合成提供溶液样环境，同时允许在反应后通过加热从反应介质中沉淀产物。然而，当聚糖在反应后带电时，聚合物在加热时不再从溶液中沉淀。因此，由于PG上的高度负电荷的GAG序列，其可能不适合PG合成。为了实现PG糖肽的化学-酶促合成，我们探索了琼脂糖凝胶作为潜在的固相支持物。琼脂糖凝胶在具有大孔径（~ 20，000 kDa）的水性缓冲液中具有值得称赞的溶胀性质，并且通常用于蛋白质纯化。PG糖肽在强酸性或碱性条件下表现出有限的稳定性，主要是由于糖肽在碱性条件下易于发生聚糖消除，以及在酸性条件下可能发生硫酸盐损失。因此，可以在温和条件下裂解的接头对于固相合成是必需的。我们选择利用方酸二乙酯作为无痕连接体，因为它可以在从树脂上切割后产生天然糖肽。1.四糖键区糖肽的酶法合成
为了建立固相支持酶促合成PG糖肽的可行性，在碳酸盐缓冲液和甲醇的混合溶剂中，肽受体通过其N-末端胺与方酸二乙酯官能化（方案1a）。6小时后，液相色谱质谱（LCMS）分析证实形成了所需的方酸酯修饰的肽，游离肽完全消耗。随后，将反应混合物与EAH Sepharose孵育，EAH Sepharose是一种市售的Sepharose树脂，其具有来自表面的11个原子的亲水性间隔臂（2当量）。基于Sepharose上的游离胺与肽）。将所得浆液保持在玻璃料装配的注射器中，并在端对端旋转下搅拌24小时，此时LCMS分析表明溶液中没有游离的方酸酯修饰的肽。![]()
方案1.(A)固相支撑的含有糖肽6-10的四糖连接区的酶合成示意图。对于每个肽/糖肽序列，丝氨酸糖基化位置以红色突出显示；(B)Sepharose支持从肽1酶合成糖肽6。该图是使用BioRender经允许创建的。
为了建立切割条件，我们首先用硼酸与浓氨组合处理负载肽1的琼脂糖凝胶。基于LCMS分析，这产生了一些期望的肽产物沿着作为副产物的方酸酯修饰的肽（数据未显示）。该方法还产生显著量的硼酸铵盐，不利地影响随后的高效液相色谱（HPLC）纯化。研究的第二种方法使用5%肼水溶液。有趣的是，当它从琼脂糖凝胶上切割肽时，它也导致了不期望的副产物，其中N-末端氨基酸残基被去除。将肼的浓度降低至1%完全缓解了这种副反应。随着固相固定和切割条件的建立，我们继续表达在连接区形成糖基键所需的酶，包括木糖基转移酶-1（XT 1）、 β 1，4-半乳糖基转移酶7（β 4GALT 7）、 β1，4-半乳糖基转移酶6（β 3GALT 6）、和β1，3-葡萄糖醛酸转移酶3（β 3GAT 3）。结果表明，β 4 GALT 7和β 3 GAT 3在大肠杆菌中得到了高效表达。在HEK 293 F细胞中，XT-1和β 3GALT 6的表达量分别为10、2.3和16.7mg/L。固相酶促合成传统上使用糖基化肽作为底物来引发酶促反应。该策略通常从糖基化氨基酸盒的化学合成开始，然后将其掺入糖肽链中，这需要使用过量的有价值的糖基氨基酸结构单元。作为替代方案，我们选择在固相上探索肽的直接糖基化。用尿苷二磷酸（UDP）-Xyl和XT-1处理负载肽1的Sepharose树脂（分子量：87 kDa）在包含25 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）、25 mM KCl、5 mM KF、5 mM MgCl 2、5 mM MnCl 2，pH 6.5，在4 ℃下翻转12小时，重复一次以确保完全转化（方案1b）。使用1%肼水溶液裂解粗产物，随后通过LCMS分析，其显示所需的目标糖肽11为唯一产物。在确认木糖基化成功的情况下，将琼脂糖上的木糖基化糖肽与UDP-Gal和β 4GALT 7在20 mM MES和10 mM MnCl 2中在pH 6.2下在4°C下孵育（方案1b）。随后用1%联氨处理琼脂糖凝胶，得到糖肽12作为所需产物，表明Gal单元成功转移至木糖肽12。接下来，我们测试了第二个Gal向连接区的转移。不幸的是，在将带有Gal-Xyl糖肽12的琼脂糖与UDP-Gal和β 3GALT 6孵育后，没有获得所需的三糖Gal-Gal-Xyl糖肽13。这种失败不是由于固相支持物，因为用溶液中的UDP-Gal和β 3GALT 6处理游离糖肽12也未能产生所需的三糖糖肽13。具有序列相似性的酶家族20成员B（FAM 20 B）是一种能够磷酸化四糖连接区中木糖的2-OH的激酶。已知其作为调节β 3GALT 6功能的分子开关。[38为了提高糖肽的合成产率，将琼脂糖上的二糖糖肽12在50 mM N-（2-羟乙基）哌嗪-N '-（2-乙磺酸）（HEPES）和10 mM MnCl 2缓冲液（pH 7.4）中用三磷酸腺苷（ATP）和FAM 20 B进行磷酸化条件。随后用UDP-Gal和β 3GALT 6处理（方案Ib）。令人欣慰的是，按照这一系列反应从琼脂糖凝胶上切割糖肽显示成功形成了带有磷酸化Gal-Gal-Xyl的糖肽15。这表明FAM 20 B可以磷酸化附着在固相上的糖肽，并证实2-O磷酸化显著提高了β 3GALT 6的Gal转移产率。所用的β 3GALT 6是包含氨基酸35至329的蛋白质的截短形式。这是第一次证明这种构建体具有酶活性，其活性受FAM 20 B调节。为了再生非磷酸化的聚糖，我们表达了2-磷酸木糖磷酸酶（XYLP），它将糖肽15去磷酸化为糖肽13。由于XYLP在HEK 293 F细胞中表达，我们探索了用市售碱性磷酸酶（AP）替代XYLP以降低与哺乳动物细胞表达相关的成本的可能性。AP也可以有效地在Sepharose上使糖肽15去磷酸化。随后，在pH 6.5的50 mM MES、2 mM MnCl 2中，在琼脂糖凝胶上用β 3GAT 3以UDP-GlcA作为供体延伸三糖糖肽13，产生带有完整四糖键区的糖肽6。从肽1到糖肽6的总产率为10%，即每个合成步骤的平均产率为77%。随着糖肽6在固相上的成功酶促合成，我们用几种其他代表性肽底物2-5（方案1a）测试了该方法的通用性，所述肽底物2 - 5含有多种氨基酸残基，包括侧接糖基化位点的酸性、碱性、芳香族和脂肪族氨基酸。这些肽序列衍生自自然界中常见的蛋白聚糖，其包括多配体蛋白聚糖3（肽2和3）、多配体蛋白聚糖4（肽4）和bikunin（肽1和5）。肽2和3各具有两个糖基化位点，而肽4具有三个糖基化位点。令人满意的是，按照与合成糖肽6相同的琼脂糖凝胶反应方案，肽2-5成功转化为糖肽7-10，每个肽均具有完整的四糖键合区域，产率分别为6%、11%、20%和10%，证明了合成方案的稳健性。对于每个糖肽合成，从肽骨架开始需要九个步骤。相比之下，带有四糖键区的肽的化学合成总共需要39个合成步骤，并且对于来自肽和市售碳水化合物结构单元的最长线性步骤（27个步骤），产率为1.1%。为了提高tP4H对底物1的活性，我们开始了定向进化运动，但由于酶稳定性差，很快就遇到了限制。首先，发现由于酶不溶性，tP4H变异体难以表达和纯化。此外，发现亲本野生型tP4H酶随着时间的推移而失去活性（图3）。这些观察结果与之前关于tP4H行为的报道一致。在定向进化过程中，酶的稳定性有可能得到改善，无论是通过在每一轮中选择更稳定的变体，还是偶然的。例如，与野生型相比，进化后的Fe(II)/αKG PsEFE的稳定性略有提高，尽管研究人员没有选择提高稳定性。在另一种情况下，Fe(II)/αKG UbP4H在最初的筛选轮使酶不稳定后，成功地筛选了Fe(II)/αKG UbP4H，以提高其稳定性。然而，从一种高度稳定的酶开始进行定向进化的好处是公认的。一个稳定的蛋白质支架可以潜在地增加活性的、正确折叠的蛋白质的数量，或者为其他不折叠的突变体提供通道。Bikunin，也称为间-α-胰蛋白酶抑制剂或胰蛋白酶抑制剂，是天然存在的CSPG。最初在尿液和人血浆中发现，它涉及抗炎和癌症的各种生物活性，并已用于治疗急性炎症性疾病，包括败血症。利用携带糖肽10的四糖键区，我们继续合成均质的bikunin糖肽。在自然界中，CSPG的合成由添加到连接区的直接糖残基指导，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）残基通过GalNAc转移酶-I（GalNAcT-I）转移到四糖连接区，启动CS合成。聚糖链通过GlcA转移酶和GalNAc转移酶进一步延伸，形成CS骨架。随后，各种磺基转移酶将选择性地将O-硫酸根安装到CS主链上，形成CSPG。KfoC是一种参与大肠杆菌K4的荚膜软骨素骨架合成的细菌酶，其是双功能的，能够将GlcA和GalNAc两者转移到软骨素链。我们测试了KfoC指导CS糖肽合成的能力，而不是表达GalNAcT-I。如方案2a中所示，糖肽10首先在pH 7.2的50 mM 3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）和15 mM MnCl 2缓冲液中用UDP-GalNAc和KfoC处理，然后通过C18硅胶固相萃取。将含有所需产物的所得级分冻干，然后用UDP-GlcA和KfoC处理。将该过程再重复两次，交替使用UDP-GalNAc和UDP-GlcA，由四糖糖肽10以65%的产率产生八糖软骨素糖肽16。这表明KfoC不仅可以用于延伸软骨素骨架，还可以启动连接区形成软骨素骨架，以实现CS糖肽合成。有了八糖糖肽16，其聚糖链通过在KfoC存在下交替UDPGalNAc和UDP-GlcA进一步延伸，分别以79%和75%产率产生带有十糖和十二糖链的软骨素糖肽17和18（方案2b和2c）。为了合成CS糖肽，使用3 '-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐（PAPS）和CS 4-O磺基转移酶（CS4 OST）对糖肽16、17和18进行4-O硫酸化（方案2）。使用C18反相HPLC分离相应的O-硫酸化糖肽19、20和21，产率分别为55%、54%和52%。十二糖糖肽21带有三个O-硫酸酯，这是迄今为止合成的最长的带有GAG的糖肽。为了测试在固相支持物上合成CS链的可能性，我们用KfoC和交替的UDPGalNAc、UDP-GlcA、UDP-GalNAc和UDP-GlcA孵育糖肽10连接的琼脂糖，然后用1%肼从固相裂解（方案3）。在4天内从10以54%的总收率获得糖肽16。硫酸化反应也可以在固相上进行。用PAPS和CS4 OST处理带有16的琼脂糖凝胶，然后用1%肼裂解，以30%的总产率从糖肽10得到CS八糖糖肽19。虽然19的固相支持合成的总产率与基于溶液的合成（方案2）的总产率相似，但固相合成将合成所需的时间量减少了约50%，因为它减少了对耗时的中间体纯化和冻干以除去水和样品浓缩的需要。先前，使用收敛策略通过化学合成来合成带有糖肽的CS八糖。从可生物利用的碳水化合物结构单元，总共需要超过80个合成步骤才能完成，对于26个步骤的最长线性合成序列，总产率为0.73%。相比之下，酶促合成CS糖肽19从肽5总共进行了14步合成，总收率为3.4%。![]()
方案2.酶法合成(A)CS十八糖糖肽19；(B)CS十糖糖肽20；(C)CS十二糖糖肽21。
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方案3.CS糖肽19的固相支持合成。
由于糖肽19-21中存在多个GalNAc残基，因此存在潜在的硫酸化位点，因此应用基于MS的方法来确定硫酸化GalNAc的位置。用放线菌素酶E消化糖肽，并使用毛细管区带电泳傅里叶变换离子回旋共振（CZE-FT-ICR）MS对所得丝氨酸聚糖进行片段化和测序。例如，对于十二糖糖肽21，片段Y 7显示最初的两个硫酸酯位于GalNAc 5和GalNAc 7上（图1）。片段B2和B7表明最接近非还原末端的GalNAc（GalNAc 11）未被硫酸化。因此，第三个硫酸化的GalNAc是GalNAc-9，这进一步得到了B2和B4片段的观察结果的支持。这些证据共同证明了对GalNAc残基的硫酸化朝向还原端的偏好。以类似方式测定糖肽19和20上硫酸盐的位置。最接近非还原端的GalNAc上缺乏硫酸化与文献一致，这可能是因为CS4 OST需要在硫酸化位点的非还原端存在更长的聚糖。![]()
图1.糖肽21的CZE-FT-ICR MS裂解模式。结构上的虚线表示观察到完整的片段。序列上的黑色实心圆圈表示观察到硫酸盐丢失的碎片离子和完整碎片。空圆圈表示观察到硫酸盐损失的碎片离子。
尽管认识到其功能的重要性，目前知之甚少的结构特点的PG。作为糖肽和糖蛋白，CSPG的聚糖链的构象可以受到蛋白质核心的影响，反之亦然。因此，在公共利益的背景下对这些组成部分进行综合分析是至关重要的。获得明确的CSPG结构提供了一个机会，以确定这些糖缀合物的构象和动力学。
肽5和糖肽10，16和19中的肽骨架的构象的系统分析，随着结构复杂性的增加，已经使用NMR方法进行。由于NH基团在肽骨架中的化学位移对局部环境的变化特别敏感，因此对肽的二级结构的变化特别敏感，我们将肽5的NH基团的1H共振与糖肽10、16和19的1H共振进行了比较。进行2D-TOCSY（图2）和2D-NOESY实验。所有NMR测量均在相同的实验条件下进行，包括温度和pH，以排除与肽结构不直接相关的外部因素，如溶剂效应。所有化合物显示出良好分散的NMR信号，并且可以分配肽骨架的大多数1H共振。NOESY光谱显示不存在中程或长程NOE效应，强烈表明在NMR时间尺度上所有化合物缺乏任何持久的二级或三级结构。这些研究结果支持的概念，这些化合物可能存在的动态构象合奏，与平均可观的类似的灵活的无规卷曲构象。这与肽、未硫酸化糖肽和硫酸化糖肽记录的相似圆二色性（CD）光谱一致，这些光谱都类似于典型的无规卷曲。
作为糖肽10、16和19的一般和独特特征，观察到丝氨酸10（S10）的骨架NH基团的化学位移的显著区别。在这些糖肽中，与肽5中的信号相比，来自S10的NH基团的信号发生了低场位移（图2）。另外检测到S10近端氨基酸的微小变异，包括谷氨酸7（E7）、谷氨酸8（E8）和甘氨酸9（G9）。因此，围绕糖基化位点的氨基酸的骨架NH对Ser 10侧链的功能化敏感。还注意到C-末端肽附近的氨基酸存在轻微变化，特别是赖氨酸22（K22）、谷氨酸23（E23）和丝氨酸25（S25）。考虑到S25残基距离糖基化位点较远，并且未检测到与聚糖部分的接触，我们推测此类变化可能表明该残基的pKa存在细微差异。
糖肽之间的化学位移扰动的比较揭示了硫酸化糖肽19与非硫酸化糖肽10和16的不同变化模式。除了所有糖肽共有的S10周围化学位移的变化外，在19中还检测到19肽骨架中大多数氨基酸的显著变化（图2E）。这些数据表明聚糖硫酸化可以显著影响糖肽19的整体3D结构。目前正在进行进一步的研究，以破译硫酸化糖肽的详细构象。
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图2.化合物5、10、16和19中肽骨架的NH基团的1H NMR共振分析。2D-TOCSY光谱的1H共振归属为：A）1.54 mM 5的水：D2 O 90：10溶液; B）0.78 mM 10的水：D2 O 90：10溶液; C）0.69 mM 16的水：D2 O 90：10溶液;和D）0.2 mM 19的水：D2 O 90：10溶液。E）与作为参比的肽5相比，观察到的10、16和19的化学位移扰动。Δδ表示为δNH（x）-δNH（5）。
5.Bikunin CS糖肽16的糖链和肽骨架有助于增强其与组织蛋白酶G的结合有了结构确定的糖肽在手，我们的目标是更好地了解bikunin糖肽结合所需的结构特征。组织蛋白酶G（CatG）是一种中性粒细胞丝氨酸蛋白酶，在调节各种生理过程中起着至关重要的作用，包括炎症、消化、平滑肌收缩和组织重塑。虽然已报道CatG与CSPG相互作用，但尚未确定CSPG结合的结构要求。为了测量对CatG的结合亲和力，将肽5和糖肽10、18-21生物素化并固定在链霉亲和素包被的传感器上用于生物层干涉测量（BLI）研究。生物素化的50 kDa CS和CS-A也固定在传感器上用于比较。如表1所示，生物素化的肽5、带有糖肽10的四糖键区和非硫酸化的软骨素十二糖肽18分别显示出400、650和490 nM的相似解离常数（KD）。有趣的是，硫酸化的8-mer CS-承载糖肽19、硫酸化的10-mer CS-承载糖肽20和硫酸化的12-mer CS-承载糖肽21在49、74和56 nM下显示出低10倍的KD值，表明糖肽上的硫酸化可以显著增强结合。市售CS和CS-A聚合物与CatG的KD值分别为180和220 nM。总的来说，这些结果表明硫酸化聚糖和肽骨架都可以参与与CatG的相互作用。6.Bikunin糖肽与组织蛋白酶G结合的模型研究为了更好地理解硫酸盐如何增强与CatG的结合，利用了分子对接方法。我们使用CHARMM GUI和分子操作环境（莫伊）在pH=7和300 K下制备了肽5、非硫酸化十二糖肽18和三个硫酸化糖肽19-21和CatG（PDB：1 T32）的结构。此外，所有获得的姿势均考虑了诱导拟合对接。CatG具有带多个精氨酸残基的高电荷表面，并且其催化残基埋在空腔内（图3a、B）。基于对接位姿，图3c中所示的区域已被鉴定为肽和糖肽的潜在结合位点。![]()
图3.CatG蛋白的表面和结合表面。(a)CatG的整个表面以静电表示，主要是带正电的残基。蓝色代表正电荷，红色代表负电荷，灰色代表中性残基。(b)CatG的催化残基His57、Asp102和Ser195以棒状表示。(c)CatG蛋白表面用于糖肽结合的选定区域。残基的编号遵循1T32 PDB编号。
对接结果表明，CatG与肽之间的结合主要通过CatG的表面精氨酸和赖氨酸残基与肽的带负电荷的谷氨酸残基E8和E18形成的相互作用发生（图S4 a）。此外，尽管较弱，但在CatG的侧链或主链与肽的主链之间存在相互作用。肽和糖肽的对接评分（表S1）表明，糖肽上存在O-硫酸盐导致较低的对接评分和较强的结合，与实验测定的解离常数一致（表1）。导致更强亲和力的关键相互作用主要是CatG蛋白的表面精氨酸残基与糖肽的硫酸酯基团之间的相互作用。例如，观察到糖肽21的所有三个硫酸酯通过氢键与CatG的残基直接相互作用，如图4所示。GalNAc 5残基上的O-硫酸酯与R147和R188残基的侧链相互作用，类似地，GalNAc 7和9残基上的O-硫酸酯与R148残基形成氢键（图4）。在八糖CSPG 19的情况下，其O-硫酸根与R185和R186形成氢键（图S4 b）。对于十糖CSPG 20，GalNAc 5上的O-硫酸根靠近R125，尽管没有观察到直接相互作用（图S5 b），并且其GalNAc 7上的O-硫酸根与R239残基形成直接氢键（图S5 c）。对于未硫酸化的糖肽18，CatG的表面精氨酸残基不与糖肽形成氢键。这些观察结果突出了糖肽上的硫酸酯基团的重要性，其通过实现与表面精氨酸残基的直接氢键相互作用而对CatG蛋白具有更强的亲和力。应该指出的是，硫酸盐对糖肽以外的糖蛋白与CatG结合的影响仍有待确定，因为糖蛋白可能比糖肽更具构象刚性。![]()
图4.(a)最高得分的姿势21与CatG。(b)O-硫酸酯在GalNAc 5上的直接氢键相互作用用绿色线表示。(c)GalNAc 7和9上的O-硫酸盐的直接氢键相互作用由绿色线表示。残基的编号遵循1 T32 PDB编号。
表1：BLI实验测定了生物素化的化合物5、10、18-21、50 kDa CS和50 kDa CS-A的解离常数。
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首次成功地开发了CSPG糖肽的化学酶法合成。这一办法包括几个关键要素。琼脂糖凝胶珠被用作多步酶促反应的固相支持物，并且在对CSPG和肼介导的裂解条件的酶促反应下被证明是稳健的。选择方酸二乙酯作为无痕接头，其与CS糖肽相容，在从琼脂糖凝胶裂解后产生天然糖肽作为最终产物。Ttide，从Sepharose裂解后产生天然糖肽作为最终产物。T tide，从Sepharose上切割后产生天然糖肽作为最终产物。GAG起始转移酶XT-1将第一种糖（木糖）转移到肽底物上，避免了合成糖基化氨基酸模块以形成糖肽的需要。据我们所知，这代表了肽的直接糖基化而不是使用糖肽作为酶底物来启动固相合成的第一个例子。已经产生了所有必需的酶，并且已经鉴定了能够合成PG的必要的反应顺序。用这种方法，我们已经成功地合成了五个不同的四糖键区轴承糖肽，不同的肽长度，糖基化位点的数量，和极性的氨基酸残基侧翼的糖基化位点。此外，该方法在生产CS-承载糖肽中是有效的，包括迄今为止合成的最长的均质GAG-承载糖肽。与化学合成相比，这种新的化学酶策略可以减少80%以上的合成步骤。各种定义明确的合成bikunin糖肽的可用性使得能够通过NMR进行糖肽的构象研究，这表明聚糖硫酸化可以显著影响糖肽19的整体3D结构。此外，进行了与CatG的结合研究。糖肽上硫酸盐的存在显著增强了其对CatG的亲和力，这意味着CatG可能在体内与bikunin相互作用。对接研究提供了硫酸盐和CatG上的残基之间的相互作用的进一步见解，阐明了bikunin可能与其各自的蛋白质伴侣结合的机制。因此，有效的化学酶策略开发开辟了新的途径，合成和研究的生物功能的PG。
原文：Synergy of the Two Alginate Lyase Domains of a Novel Alginate Lyase from Vibrio sp. NC2 in Alginate DegradationDOI: https://doi.org/10.1002/ange.202405671
