《Nature》的光酶中一种C-N键形成的独特机制的发现
文摘
科学
2024-10-11 14:51
江苏
2024年10月8日，Felix C. Raps等人在《Nature》上发表了一篇题为Emergence of a distinct mechanism of C–N bond formation in photoenzymes的研究性论文。
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通讯单位：Department of Chemistry and Chemical
Biology, Cornell University, Ithaca, New York, USA
Abstract
由于氮杂环在小分子药物和农用化学品中的普遍存在，C-N键的形成是现代化学合成不可或缺的一部分。烯烃与未活化烯烃的加氢胺化是构建这些键的原子经济策略。然而，在制备完全取代的碳立体中心时，这些反应很难呈现不对称性。在这里，我们报道了一种通过Baeyer-Villiger单加氧酶进行光催化烯烃氢胺化制备2,2-二取代吡咯烷的方法。五轮蛋白质工程提供了一个突变体，提供了优异的产品产量和立体选择性。与依赖于胺或烯烃氧化形成C-N键的相关光化学氢胺化不同，这项工作利用了还原产生的苄基自由基和氮孤对的空间相互作用。这种反键相互作用降低了自由基的氧化电位，使电子能够转移到黄素辅因子。实验表明，酶微环境对于实现小分子催化中没有平行的新型C-N键形成机制至关重要。通过进行分子动力学模拟以研究酶活性位点中的底物，进一步支持了这一假设。这项工作是非天然生物催化中一种新兴机制的罕见例子，在这种机制中，酶可以获得其单个成分所不具备的机制。我们的研究展示了利用蛋白质工程增强新兴机制的潜力，为化学合成中尚未解决的挑战提供独特的机制解决方案。
酶是化学合成的理想支架，因为它们利用反应中间体和蛋白质之间的共价和非共价相互作用来促进转化。这些接触使酶能够以无与伦比的选择性进行转化，并执行辅因子或最小蛋白质无法接近的反应机制。一个具有访问机制的复杂系统，其各个部分不显示任何属性，这被称为涌现。新兴机制的现象在天然酶功能方面是众所周知的，但在使用酶进行非天然反应时却很少见。例子包括P411催化的硝烯插入C-H键和形成双环丁烷，与黄素依赖性氧化还原酶的高阶电荷转移复合物，以及使用“烯”还原酶在还原偶联中对硝基阴离子的介孔裂解。虽然新兴机制很难预测，但当使用蛋白质工程发现和优化时，它有可能解锁新的反应和逆转录合成断开。烯烃与未活化胺的加氢胺化是一种构建新C-N键的原子经济策略。然而，当超越模型基础时，这些看似简单的转换很难实现。例如，通过Markovnikov氢胺化将1,1-二取代烯烃与胺偶联，不对称构建α-叔胺仍然是一个重大挑战。过渡金属是最常见的加氢胺化催化剂，不太适合构建空间位阻键。涉及自由基中间体的反应是官能团耐受的，但只形成反马氏产物，在C-N键形成事件中很难呈现不对称性（图1a）。然而，最近有报道称，Brønsted酸催化剂可以催化这种转化，但官能团耐受性较差，需要具有导向基团的失活胺来实现对映选择性。我们设想酶非常适合这种反应，然而，目前还没有已知的生物催化剂能够催化未活化的胺和烯烃的氢胺化反应。鉴于其高反应性、与水性条件的相容性和底物耐受性，我们设想自由基是所需反应的理想中间体。然而，该酶需要利用一种独特的机制来克服已知C-N键形成自由基机制的固有区域选择性。我们的目标是开发一种酶催化的分子内水胺化反应，以制备2,2-二取代吡咯烷（图1b）。我们的团队和其他人已经证明，黄素依赖性的“烯”还原酶可以催化各种C-C、N-C和C-O成键反应，其区域和对映选择性可以通过蛋白质工程进行调节。这些反应的一个共同特征是需要活化的自由基前体，如烷基卤化物和异羟肟酯，它们在还原后会发生不可逆的键断裂，以确保生产化学与背电子转移具有竞争力。在这项研究中，我们针对的是一种涉及未活化自由基前体的光酶过程，这是一个需要克服的挑战，以提高光酶过程的合成效用。
我们首先基于模型底物1通过5-外三环或6-内三环形成产物的能力，探索了其与自由基环化的关系（图2a）。基于这样一种假设，即天然催化氧化转化的酶最能耐受活性位点产生的预期自由基，我们编制了黄素酶库。我们发现单胺氧化酶（MAO-N-D11C）、苯乙烯单加氧酶（StyA1）、达米诺酸氧化酶（AcDAAO）、胆碱氧化酶（AcCO6）和胆固醇氧化酶（ShCO）在蓝光照射下无法使氢胺化反应环化。相比之下，来自醋酸钙不动杆菌（AcCHMO）的环己酮单加氧酶对5-外三羟基胺化产物2的转化率较低（1%收率，55:45 e.r.），而不形成6-内三羟基产物3，该产物是在使用氨基或铵基阳离子时形成的（补充图S6）。对照实验证实，CHMO和光对反应性是必要的，游离FAD不能促进这种转化。为了提高这种活性，我们建立了一个CHMO同源物库，并发现赵等人（AcCHMO-M10）报道的奥美拉唑亚砜以12%的产率和55:45 e.r。
有了初始活性，我们进行了一项蛋白质工程活动，使用迭代位点饱和诱变（ISM），遵循减少密码子策略，以提高反应的产量和对映选择性。根据它们与辅因子的接近程度选择诱变位点。为了帮助选择诱变位点，我们使用了AlphaFold 2.0预测的结构，该结构模拟了原型AcCHMO-M2（pdb 6a37）的晶体结构。我们首先靶向黄素辅因子4Å内的残基（图2b-c）。将327位的精氨酸突变为赖氨酸（R327K），产量提高到22%，为71:29
e.r。进一步的诱变发现了连续突变R490E（45%，70:30 e.r.）、C326H（56%，81:19 e.r.）和I491T（71%，93:7 e.r.）。这三个位置都位于通向活性位点的底物通道中，推测在反应过程中会调整底物的位置。最后，479位丙氨酸突变为组氨酸（A479H）导致高产率和优异的对映选择性（97%，95:5 e.r.）的产物形成。分子动力学（MD）模拟显示，三个远端突变——R490E、I491T、A479H——位于一个动态环路区域（残基475-510），该区域控制着酶活性位点的通路（图2d）。该环路类似于同源RmCHMO中研究的“控制环路”区域。在亲本酶中，这种柔性环形成相互作用（例如R490和Q210之间），关闭活性位点入口。这些远端突变的引入似乎会破坏活性位点门控回路与酶其他区域之间的相互作用，从而阻止该环屏蔽活性位点。因此，R490E、I491T和A479H突变可能在保持活性位点开放和底物可及性方面发挥重要作用——这是对这些突变相关的约15-30%产量提高的合理解释。通过将催化剂负载量降至0.04 mol%，在无细胞透析的裂解液中测试了酶催化反应的功效（图2a，记录3）。反应仍以适度的量进行（17%，TON=436），形成保留对映体比例的产物4。我们在未裂解的裂解物（1 mol%）中观察到产物的对映体比率（93:7）降低。在考虑可能的抑制剂时，我们根据NADP+在自然机制中的作用将其视为潜在的候选者。当向反应中加入相对于酶的0.1当量NADP+时，产率降至63%，对映选择性降至93:7e.r。向酶中加入等摩尔量的NADP+（相对于酶为1.0当量的NADP+）会完全阻碍反应，表明NADP+结合具有抑制作用。这与天然反应不同，天然反应需要FADH和NADP+。最后一种酶被称为AcHYAM（HYdro-AMinase），测试了它在几种底物上催化环化的能力（图3）。容忍各种苯胺和苯乙烯基取代，富电子芳烃通常能提供更高的收率和选择性。苯胺侧和苯乙烯部分上的大取代基，如萘，不会降低产率，并且具有优异的对映选择性。此外，可以容忍缺电子含氮杂环，克服了Brønsted酸催化环化的局限性。环化对杂环取代很敏感，在某些情况下受到严重阻碍（补充图S1）。然而，蛋白质工程可能会克服这些局限性。同源底物可以参与6-外三环化反应，以13%的收率提供产物，具有良好的对映选择性（78:22 e.r.）。这个特殊的例子很有趣，因为当使用光氧化还原催化剂时，这种类型的底物通常会在环化反应中发生1,5-HAT事件。吡咯烷骨架的修饰是可以容忍的，二甲基取代以中等收率（42%）和对映体比（27:73 e.r.）获得。接下来，我们考虑了还原黄素是否充当能量转移催化剂。Lewis等人描述了在没有光催化剂的情况下，通过在281nm处直接激发进行的相关5-外三氢胺化（补充图S7）。他们援引二自由基组合作为键形成事件的原因，并通过观察衍生底物中的裂解来证实他们的假设。为了探测酶反应中的任何二自由基特征，将相关的裂解底物（补充底物S40）置于酶反应条件下，并使用GC-MS和NMR分析样品。没有观察到碎裂的证据，这表明能量转移机制不太可能。基于对还原黄素的需求和缺乏能量转移机制的证据，我们得出结论，FADhq*（E0=-2.26 V V.SCE）对烯烃的还原是自由基引发的原因（图4a）。虽然这种电势不足以还原底物（α-甲基苯乙烯Ered=-2.6 V V.SCE），但正电活性位点可以减弱还原烯烃所需的电势，同时稳定所得的阴离子黄素半醌（FADsq-）（图4b）。由此产生的自由基阴离子是高度碱性的，导致快速且不可逆的质子化，从而形成苄基自由基。虽然我们最初假设该自由基被氧化为相应的苄基阳离子，但带有其他亲核物种的取代物，如伯醇、烷基胺和甲基取代烯烃衍生物，是完全不反应的（图4c）。这一观察结果与叔碳阳离子不一致，表明反应需要π-π堆积相互作用才能进行。当考虑C-N键形成的其他机理可能性时，我们假设苯胺和苄基自由基之间的相互作用可能会改变系统的氧化还原性质。虽然这种跨环相互作用在文献中尚不清楚，但众所周知，孤对和自由基之间的超共轭相互作用会增加单占据分子轨道（SOMO）的能量，使自由基更容易氧化。如果蛋白质将这种相互作用模板化，并通过将底物限制在反应构象中来克服排斥电子力，预计会发生类似的氧化还原激活。我们通过密度泛函理论（DFT）计算了预组织中间体的前线分子轨道构型（图4d）。通过对处于双峰状态的产品进行坐标扫描来确定预对准结构。C-N键在迭代中被拉开，以确定一个能量最小值，该值在理论的M06-D3（0）/6311+G（d，p）水平上进行了优化。由此产生的SOMO填充了一种反键构型，其轨道与苯乙烯基芳烃上具有显著特征的C-N键形成的轨道异相。然而，HOMO-1在苯胺氮和苄基自由基之间具有键合特性，在苯胺芳烃上具有显著的轨道系数，这支持了我们的假设，即这种n→SOMO可以导致键合特性。利用Born-Haber关系，通过DFT确定了预组织和开链结构的氧化电位。未对齐形式的氧化电位与苄基α-甲基苯乙烯基非常匹配（补充图S8）。在计算出的预排列结构中，发现氧化电位显著降低（ΔEox=-0.70
V V.SCE）。这一特征至关重要，因为FADsq–的氧化性不足（E0=-0.25 V V.SCE），无法从相应的自由基产生苄基碳阳离子（Eox=0.16 V V.SCE）。基于观察到的反应性和收集到的机理证据，我们得出结论，酶使用不同于小分子催化的机制促进这种氢胺化。这种涌现机制依赖于正式的两中心三电子反键中间体的排斥相互作用，以减弱酶活性位点内自由基的氧化电位。我们假设这种相互作用之所以可能，是因为蛋白质提供了预组织。令人惊讶的是，MD模拟表明，AcHYAM环境为模型底物提供了相对于亲本酶的更多旋转自由度。然而，我们看到AcHYAM中底物构象的证据，类似于DFT研究的预组织构象（图5a），这在亲本酶中很少观察到。催化位点附近的突变（即R327K、C326H）可能是这种构象灵活性增强的原因，因为底物主要是样品，延长了母体酶的构象。我们得出结论，新的旋转自由度允许工程AcHYAM环境中的底物将自身定向到对C-N键形成至关重要的构象。此外，当用10-苯基吩噻嗪（一种据报道可以将α-甲基苯乙烯还原为相应自由基阴离子的光催化剂）进行光氧化还原反应时，没有观察到5-外消旋产物（图5b）。当在硫醇催化剂存在下进行相同的反应时，发现烯烃还原率为34%，这表明尽管10-苯基吩噻嗪能够将烯烃还原为自由基阴离子，但如果没有提供模板，则不会形成C-N键。![]()
图1.自由基氢胺化的挑战a.小分子催化自由基氢胺化策略和局限性；b.酶控制可以通过新兴途径解决自由基氢胺化中的突出挑战。
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图2.蛋白质进化a.选择性光酶氢胺化的模型反应。b.进化运动概述以及产量和对映选择性的增加。c.显示了AcHYAM的蛋白质结构，该结构由AlphaFold 2.0预测，并与原型AcCHMO-M2（pdb 6a37）的晶体结构对齐。d.母体和AcHYAM MD模拟之间的残差均方根波动（RMSF）差异表明有源位点门控回路中的盐桥丢失。AcCHMO=醋酸钙不动杆菌环己酮单加氧酶；AcHYAM=醋酸钙不动杆菌HYdro-AMinase；FAD=黄素腺嘌呤二核苷酸。
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图3.C-N形成反应的范围。光酶加氢胺化反应的底物范围。改性分为苯胺和苯乙烯基改性，以及其他不同的改性。PMP=对甲氧基苯基。
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图4.使用基底探针和DFT进行力学研究。a.建议的加氢胺化反应中的催化循环。b.自适应Poisson-Boltzmann求解器（APBS）计算了AcHYAM的静电势图，指示了带正电的活性位点；c.碳阳离子反应性和设计用于探测任何离子键形成活性的底物；d.MeCN中预组织形式的DFT计算。在M06-D3（0）/6-311+G（d，p）理论水平上计算了前沿分子轨道和能量。利用Born-Haber关系确定氧化还原电位。
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图5.分子动力学和小分子测试对底物结合的研究。a.模型底物构象（浅蓝色）的快照——在AcHYAM MD模拟过程中采样——类似于DFT计算研究的预组织构象。基板上带有自由基的碳原子和指定的FAD氮原子之间的距离以橙色显示。基底上带有自由基的碳原子和基底上的氮原子之间的距离以浅蓝色显示。K327残留物用球体显示；b.模型底物的小分子光催化转化不会产生酶产物。DMA=二甲基乙酰胺。
总之，我们开发了一种高选择性的光酶，用于使用苯胺进行立体选择性氢胺化。基于实验和计算，我们得出结论，该反应利用了一种以前未知的C-N键形成机制，这是由蛋白质活性位点提供的预组织实现的。这种C-N键形成的新兴机制突显了酶揭示新途径的机会，这些途径可用于解决化学合成中的反应性挑战。
原文：Emergence
of a distinct mechanism of C–N bond formation in
photoenzymesDOI:https://doi.org/10.1038/s41586-024-08138-w
