采用RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology)服务器对菌株XJ60A和WH60A的基因组序列草图进行注释。我们发现每个菌株都有一个半乳糖利用位点，由一个糖结合脂蛋白(麦芽糊精ABC转运蛋白底物结合蛋白)、两个糖转运蛋白(麦芽糊精ABC转运蛋白渗透酶蛋白)和两个半乳糖水解酶(内切-1,4-β-半乳糖酶和β-半乳糖苷酶)组成(图1)。在枯草芽孢杆菌XJ60A中，内源性1,4- β-半乳糖酶基因(ORF936, Bs936)位于推定的β-半乳糖酶基因(ORF937, Bs937)的上游，而在枯草芽孢杆菌亚种中，基因顺序相反。细小WH60A。具体来说，推定的内切1,4-β-半乳糖酶基因(ORF4828, Bs4828)位于推定的β-半乳糖酶基因(ORF4829, Bs4829)的下游。由于内切-1,4-β-半乳糖酶是半乳糖或I型阿拉伯半乳糖降解中最重要的水解酶，因此我们的分析主要集中在内切-1,4-β-半乳糖酶上。![]()
图1. 枯草芽孢杆菌XJ60A (A)和枯草杆菌WH60A (B)推测的内切-1,4-β-半乳糖酶编码基因Bs936和Bs4828的基因组背景。
Bs936和Bs4828基因全长编码402-和429-氨基酸残基多肽，分别含有25-和26-aa残基信号肽。Bs936和Bs4828(以下为成熟酶)序列同源性为34.48%。在GenBank上进行BLASTp搜索发现，Bs936和Bs4828都含有一个GH53模块，并且与假定的芽孢杆菌内切-1,4-β-半乳糖酶的序列一致性最高。如表1所示，与以往的研究相比，Bs936与Ignisphaera aggregans中的GH53 endo-1,4-β-半乳糖酶(IaGal)的同源性最高(41.64%)，其次是来自嗜脂热地杆菌Geobacillus stearothermophilus的GsGanA(38.99%)，来自B. licheniformis DSM 13/ATCC 14580的BlGal(36.07%)，来自B. subtilis的BsGanB(34.48%)，来自长双歧杆菌的BlGalA(33.42%)。该序列与其他GH53内切-1,4-β-半乳糖酶的序列一致性<30%。值得一提的是，Lima等从B. licheniformis CBMAI 1609中鉴定了一个新的GH53内切-1,4-β-半乳聚糖酶(Bl1609Gal)，其与BlGal具有94 %的序列一致性，但未提供该序列的登录号。同时，Bs4828与Bs Gan B的相似性最高(97.52 %)，其次是BlGal (77.19 %)和Bs Gan A (69.31 %)。表1. Bs936和Bs4828与其同源GH53内切-1,4-β-半乳糖酶的比较。
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利用PDBsum对蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)进行序列检索，发现Bs936和Bs4828与上述来自B. licheniformis DSM 13/ATCC 14580的BlGal最为相似(PDB代码:1R8L)。基于结构的序列比对表明，Bs936中的Glu156/Glu263和Bs4828中的Glu169/Glu267残基分别与BlGal的β-链4/7末端的Glu165/Glu263相对应，并被预测为催化酸碱/亲核残基(图2)。目前，除BtGal外，所有具有结构特征的GH53内切-1,4 -β-半乳糖酶都含有延伸环7和8。它们之间含有稳定的特征(真菌半乳糖酶中的二硫桥和细菌和古细菌酶中的钙结合位点)。此外，较长的环8形成含有-3和-4结合亚位的底物结合区，阻止酶切割聚合度<4的半乳糖寡糖。比对结果显示，Bs4828含有延伸环路7和8，预测Bs4828中Trp351/Trp367残基分别为-3和-4亚位，与BlGal的Trp347/Trp363残基对应。而Bs936含有一个延长的环7，其环8几乎与IaGal一样长，但比Bs4828和bgal短得多，这使得Bs936只含有-3亚位点(对应于Trp334残基)(图2)。因此，我们推测Bs936和Bs4828可能无法降解短半乳糖三糖和半乳糖二糖。基于同样的原因，这些酶对半乳糖的降解可能产生半乳糖三糖、半乳糖二糖和半乳糖为主要产物。Bs936和Bs4828的域架构示意图如图3A所示。Bs4828和BsGanB仅在n端和GH53结构域内表现出轻微的差异。如图2所示，在中端，与Bs4828相比，BsGanB被拉长了8个残基(1-CSSTGYAA-8)，在24位和25位又增加了2个残基(24-ed-25)；此外，BsGanB中的Ala9残基与Bs4828中的Met1残基是对齐的。值得注意的是，Bs4828和BsGanB的GH53结构域之间只有5个不同的残基(Ile46/Thr56、His76/Asn86、Val132/Ala142、Ala327/ Glu337和His382/Asn392)。已有研究表明，末端氨基酸可能对酶的热稳定性和催化活性有很大影响。同样，也有许多例子表明，催化区域内单个或多个氨基酸的取代可以改变内切-1,4-β-半乳糖酶的性质。此外，虽然BlGal和BsGanB具有较高的序列同源性(77.19%)，但对lupin galactan的特异性活性却明显(BlGal: 5754 U/mg;BsGanB: 75 U/mg)。因此，尽管Bs4828和BsGanB之间具有高度的共享序列一致性，但这些结果表明某些关键残基对两种酶之间的酶性质有很大影响。![]()
图2. Bs936、Bs4828及其同源物的多氨基酸序列比对。
对纯化后的重组酶Bs936和Bs4828进行SDS-PAGE分析，发现各酶均得到了很好的纯化，SDS-PAGE凝胶中观察到的蛋白条带分别与重组酶Bs936 (45.5 kDa)和Bs4828 (47.0 kDa)的预测分子量一致(图3B)。为了评价Bs936和Bs4828的四级结构，采用分子排阻色谱法测定了两种酶的大小。与标准品的保留时间相比，Bs4828和Bs936分别在44.0- kDa标准蛋白前和后洗脱。通过对标准曲线中洗脱体积的拟合，计算出天然重组酶Bs936和Bs4828的表观分子量分别为42.5 kDa和51.2 kDa，表明两种酶在溶液(图3C , D)中以单体形式存在。![]()
图3. Bs936和Bs4828的示意图域结构。
2.pH、温度和底物对酶性能的影响
本部分的所有测定均以Otato半乳聚糖为底物。重组Bs936的最适pH为5.5，在pH 3.5-7.5之间保持> 60 %的相对活性。相反，Bs4828在pH 6.5时活性最高，在pH 5.5-7.0范围内保持75 %以上的相对活性(图4A)。Bs936/Bs4828的最适温度分别为55 ℃/65 ℃，在45-60 ℃/45-70 ℃范围内均能保持60 %以上的酶活力(图4B )。此外，两种内切-1,4-β-半乳糖酶在4.5-10.0的较宽pH范围内均保持稳定，在25℃下孵育12 h后仍保持80%以上的活性。即使在11.0的pH下，Bs936和Bs4828仍分别保持其原始活性的94.1%和41.0%。值得注意的是，在更极端的pH环境下，Bs936在酸性条件下更稳定(pH 3.0时残留活性为24.8%)，而Bs4828在极端碱性条件下更稳定(pH 12.0时残留活性为39.1%)(图4C, D)。热稳定性分析表明，Bs936在45 ℃时保持稳定，培养2小时后保持75%以上的活性;然而，当在50 ℃下孵育仅10分钟时，酶失去了大部分活性(图4E)。相比之下，Bs4828在50 ℃和55 ℃条件下孵育4 h和30 min后仍保持100%和60%的活性。然而，在60 ℃下孵育30分钟后，酶失去了大部分活性(图4F)。![]()
图4. pH值、温度和底物对酶活性和稳定性的影响。(A) Bs936和Bs4828的pH曲线。(B) Bs936和Bs4828的温度分布图。(C) Bs936的pH稳定性分析。(D) Bs4828的pH稳定性分析。(E) Bs936的热稳定性分析。(F) Bs4828的热稳定性分析。(G)添加或不添加马铃薯半乳的Bs936蛋白热移实验。年代,衬底。(H)添加或不添加马铃薯半乳的Bs4828蛋白热移实验。在最佳pH和温度条件下，酶活性最高为100%。稳定性试验中，未经任何处理的活性设为100%。条形图表示三次重复反应的标准差。
这些结果表明，Bs936和Bs4828是酸性和中温性酶，Bs936酸性更强，而Bs4828耐热性更强。Bs4828在50◦C预处理后显示超过100%的活性，表明它可以在特定温度下加热激活。类似的观察结果也见于一种曲曲霉漆酶，表明在一定温度下的预孵育可能会刺激酶的活性。如表1所示，除两种曲霉内切-1,4-β-半乳糖酶外，其余酶的最佳pH值均在5.0-8.0之间。同时，大多数最佳温度落在37-60 ℃的范围内。来自嗜热性I. aggregans的IaGal是唯一比Bs4828(95 ℃ vs 65 ℃)具有更高最佳反应温度的酶。有趣的是，虽然BsGanB与Bs4828是高度同源的酶(97.52%的同源性)，并且具有与Bs4828相同的最佳pH值(pH 6.5)，但其最佳温度要低得多(50 ℃)。这种现象可能至少部分归因于N端序列的差异。预测BsGanB的N端寡肽1- CSSTGYAA-8的二级结构为随机线圈，其存在可能会损害蛋白质的整体稳定性。Bs936和Bs4828的Tm分别为52.0 ℃和59.3 ℃，与马铃薯半乳聚糖共孵育使它们的Tm分别提高到59.5 ℃和68.15 ℃，产生的Tm值分别为+ 7.5℃和+ 8.85 ℃。Bs936和Bs4828的热位移可能解释了最适温度测定和热稳定性测定之间的矛盾：Bs936和Bs4828的最适温度分别为55 ℃和65 ℃，但它们在50 ℃和60 ℃无底物预处理时更不稳定。我们前期对双功能内切木聚糖酶/内切葡聚糖酶Ba Xyn A的研究也发现了类似的结果。然而，在BaXynA中加入山毛榉木聚糖只导致ΔTm值为+ 1.97 ℃，远低于本研究中观察到的值。由于Tm代表蛋白质的疏水残基暴露温度，这些结果表明底物可能与内切-1,4-β-半乳糖酶相互作用，使酶对热不敏感。为了确定Bs936和Bs4828的底物特异性，对一系列模型多糖进行了测试。如表2可知，Bs936和Bs4828对半乳聚糖具有较好的水解活性，Bs936/Bs4828对马铃薯半乳聚糖和羽扇豆半乳聚糖的比活力分别为1859.46/3110.79 U/mg和754.43/1962.74 U/mg。相比之下，Bs936和Bs4828对脱支阿拉伯糖(0.077 U/mg和0.038 U/mg)和阿拉伯糖(0.040 U/mg和0.028 U/mg)的活性较弱。未检测到木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、CMC、地衣多糖、β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、半乳甘露聚糖和果胶的显著活性(<0.01 U/mg)。表2. 不同底物对重组Bs936和Bs4828的特异性活性测定。
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为进一步验证其水解作用机理，采用HPAEC-PAD对马铃薯半乳聚糖、阿拉伯聚糖和脱支阿拉伯聚糖的水解产物进行了分析。如图5所示，Bs936和Bs4828能够从马铃薯半乳糖中释放半乳糖(G1)、半乳糖二糖(G2)和半乳糖三糖(G3)。由于手头缺乏半乳寡糖标准品，我们采用PMP衍生法结合HPLC- ms分析对水解产物进行鉴定。HPLC结果中观察到三个主峰，与HPAEC分析结果一致。峰1 (P1)、峰2和峰3的保留时间分别为20.00、12.62和11.11 min。其中，峰1与半乳糖(PMP)2-G1的PMP衍生物洗脱时间相同。从质谱分析中，根据ESI-MS阳性模式检测到的质荷比(m/z)， P1、P2和P3的分子质量分别为510、672和834。由此可以确定P1、P2、P3分别为G1、G2和G3，分别被两个PMP标记(PMP的分子量为174.2，两个PMP会滴下1分子水)。![]()
图5. 通过 Bs936和Bs4828对半乳聚糖（马铃薯）、去支链阿拉伯糖和阿拉伯聚糖的水解产物进行HPAEC-PAD分析
Bs936/Bs4828的Km、Vmax和kcat值分别约为4.93/6.60 mg/mL、1926/5960 U/mg和1461/4667 s-1。Bs936和Bs4828的催化效率(kcat/Km)分别为296.35 mL/mg/s和707.12 mL/mg/s。综上所述，Bs936和Bs4828对半乳多糖具有较高的水解活性，两者均对马铃薯半乳多糖具有较强的水解活性。这种现象的部分原因可能是马铃薯半乳糖(纯度>85%，半乳糖:阿拉伯糖:鼠李糖:半乳糖醛酸= 87:3:4:6)的纯度和半乳糖百分比高于露平半乳糖(纯度>80%，半乳糖：阿拉伯糖：鼠李糖：木糖：半乳糖醛酸：其他糖= 82:5.8:5.1:1.4:14.6:5.7)。此外，由其他糖组成的修饰分支会在空间上阻碍酶进入半乳糖骨架，因此，更多的分支表明酶水解的阻碍程度更大。这种位阻效应也被观察到在A. aculeatus的endo1,4 -β-半乳糖酶(AaGal)上，它对卢平半乳糖的比活性(1641 U/mg)比马铃薯阿拉伯半乳糖(287 U/mg)高得多(表1)。虽然Bs936和Bs4828对阿拉伯糖和脱支阿拉伯糖表现出轻微的活性，但对水解产物(G1和G2)的分析显示，所呈现的活性归因于β-D-半乳糖醛酸键的水解，而不是α-L-阿拉伯糖醛酸键的分解(图5)。根据制造商的产品描述，半乳糖分别占阿拉伯糖和脱支阿拉伯糖中总糖残基的18.7%和26%。半纤维素是一种带有侧链的杂聚物，通常由D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸组成。因此，可以想象，商业木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖和加拉聚糖除了主要的糖单位外，总是有几个额外的单糖。对于落叶松阿拉伯半乳糖，主链上的半乳糖残基由1,3-β-D-半乳糖苷键而不是1,4-β-D-半乳糖苷键连接，修饰的半乳糖残基通过1,6-β-双半乳糖苷键与主链连接。对落叶松阿拉伯半乳糖缺乏水解活性表明Bs936和Bs4828特异性地降解1,4-β-D-半乳糖苷键。来自B. thetaiotaomicron的BtGH53和来自B. subtilis的BsGanB也报道了这种特异性。到目前为止，GH53酶中只发现了endo-β-1,4-半乳糖酶活性，而GH43家族成员中发现了对endo-1,3-β-半乳糖酶活性的特异性。与其他内啡肽-1,4-β-半乳糖酶相比，据我们所知，Bs936和Bs4828对半乳糖的比活性优于大多数已知的内啡肽-1,4-β-半乳糖酶。只有地衣芽孢杆菌的BlGal表现出更高的比活性(5754 U/mg)(表1)。但在pH 7.5和30℃条件下，BlGal的催化效率约为265.96 mL/mg/s，低于最佳pH和温度条件下的Bs936和Bs4828。此外，嗜热脂肪芽孢杆菌来源的Gs Gan A对马铃薯半乳聚糖具有较高的催化效率(1200 mL/mg/s)，但水解活性较低(167 U/mg)。值得一提的是，与Bs4828高度同源的Bs Gan B对羽扇豆半乳聚糖的酶活只有75 U/mg，远低于Bs4828。考虑到催化模块内部的末端氨基酸和重要残基可能会影响酶活性，我们推断酶活性的差异可能是序列差异共同作用的结果。由于在GH53结构域中Bs4828和BsGanB之间只有5个不同的残基，我们很想了解这些残基对Bs4828构象和功能的影响。因此，我们模拟了Bs4828的三维结构，并进一步将半乳糖己糖酶对接到其底物结合间隙中(图6A)。两个保守的催化谷氨酸残基(Glu169和Glu267)位于结合的半乳糖己糖的近端。对Bs4828和半乳糖己糖酶相互作用的分析发现，17个残基(His280、Trp367、Gly281、Thr208、Asn209、Glu167、Asp360、Trp351、Lys286、Trp241、Glu267、Tyr238、Asp121、Ala123、Lys124、Asp363和Lys366)可能通过氢键与半乳糖己糖酶相互作用(图6B)，并给出了氨基酸残基与其最接近的半乳糖残基之间的距离(图6C)。令人惊讶但有趣的是，这五种不同的残基离底物的结合位点很远。因此，我们推测这些不同的残基可能通过间接作用参与催化，例如影响对关键残基的柔韧性。然而，这一假设将在随后的突变研究中得到验证。然而，本研究对Bs4828和BsGanB的比较分析，为GH53家族内endo1,4-β-半乳糖酶的结构-功能关系提供了新的见解。![]()
图6. Bs4828半乳糖六糖复合物的结构分析。
4.不同化学物质对内切-1,4-β-半乳糖酶活性的影响接下来，我们筛选了各种常用生化试剂对Bs936和Bs4828活性的影响。如表3所示，尿素、EDTA、Triton X-100、甲醇、丙酮、异丙醇和β -巯基乙醇均能提高Bs936的活性(110.8-327.9 %)，表明Bs936能被尿素等蛋白质变性剂和Triton X - 100等非离子表面活性剂激活。EDTA的促进作用表明二价金属离子并非正常发挥作用所必需。尽管如此，除Fe2 +和Cu2 +外，低浓度(1 mM)的金属离子刺激Bs936的活性。浓度为1和10 mM的Co2+、Ni2+、Mn2+、Al3+和Ca2+使Bs936的活性达到113.5 ~ 149.3%，而高浓度的Fe2+、Cu2+、Fe3+、Ag+、Mg2+和二硫代苏糖醇抑制了Bs936的活性。此外，阴离子表面活性剂SDS在两种浓度下都能强烈抑制酶的活性。当Zn2+、Al3+、Ca2+、EDTA、Triton X-100、二硫苏糖醇、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇和β-巯基乙醇添加量为1 mM时，Bs4828的活性提高了111.9-199.5%；添加量为10 mM时，Bs4828的活性提高了114.5-214.1%。随着Fe2+、Cu2+、Ni2+、Ag+、Al3+和二硫代苏糖醇浓度的增加(10 mM)， Bs4828的相对活性下降到<60%。这些结果表明，Bs936应避免使用Fe2+、Cu2+、SDS以及高浓度的Fe3+、Ag+和Mg2+， Bs4828应避免使用除Triton X-100、异丙醇和β-巯基乙醇外的所有高浓度金属离子和化学试剂。表3. 不同化学物质对Bs936和Bs4828内源性1,4-β-半乳糖酶活性的影响。
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5.半乳聚糖、脱支阿拉伯糖、阿拉伯糖和PCS的协同水解根据观察到的Bs936和Bs4828的水解活性，我们推测这两种酶可能与β-半乳糖苷酶和内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶相互作用，降解半乳糖和阿拉伯糖。为了证实这一推测，用芽孢杆菌β-半乳糖苷酶(Bs937或Bs4829)和内酯-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶(BsAbn2)对半乳糖和阿拉伯糖进行了协同水解实验。Bs937、Bs4829和BsAbn2的SDS-PAGE分析如图7A所示，所观察到的条带大小与重组Bs937 (82.8 kDa)、Bs4829 (83 kDa)和BsAbn2 (53.4 kDa)的分子量一致。BsAbn2的最佳反应pH和温度分别为pH 7.0和50℃。在马铃薯半乳的水解过程中，Bs936和Bs4828释放的还原端分别为12.69 mM和16.33 mM。Bs937和Bs4829单独只产生少量的还原糖(0.05 mM和0.85 mM)，而Bs937加入Bs936和Bs4829加入Bs4828后，还原端分别增加到16.36 mM和26.56 mM。Bs937/Bs936和Bs4829/Bs4828组合的对应协同度(DS)分别为1.28和1.55(图7B、G)。这些结果表明内切-1,4-β-半乳糖酶是半乳糖降解的主要酶。而β-半乳糖苷酶是一种重要的辅助酶，负责将内切-1,4-β-半乳糖酶产生的半乳糖寡糖水解成半乳糖单体。![]()
图7.Bs936/Bs4828与其同源糖苷水解酶的协同作用。(A)两种β-半乳糖苷酶(Bs937和Bs4829)和一种内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶(BsAbn2)的SDS-PAGE分析。(B)内切1,4-β-半乳糖酶(Bs936或Bs4828)及其同源β-半乳糖苷酶(Bs937或Bs4829)单独或组合水解半乳糖(马铃薯)。(C)内切-1,4-β-半乳糖酶(Bs936或Bs4828)和BsAbn2单独或联合水解脱支阿拉伯糖。(D)内切1,4-β-半乳糖酶(Bs936或Bs4828)和BsAbn2单独或联合水解阿拉伯糖。(E)内切-1,4-β-半乳糖酶Bs936、芽孢杆菌双功能内切木聚糖酶/内切葡聚糖酶BaXynA和商用纤维素酶LsCel单独或联合水解PCS。(F)内切1,4-β-半乳糖酶Bs4828、BaXynA和LsCel单独或联合水解PCS。(G)不同协同酶促反应的协同程度。以不加酶溶液的底物为阴性对照。每个柱上的数字表示三次反应的平均值，误差柱表示标准差。注:***表示差异非常显著(P<0.001)， **表示差异显著(0.001<P<0.01)， *表示差异有统计学意义(0.01< P<0.05)。
同样，Bs936和Bs4828与BsAbn2在水解脱支阿拉伯糖方面的协同作用也被测定。在pH 5.5和55℃条件下，Bs936、BsAbn2和Bs936 + BsAbn2产生的阿拉伯糖当量分别为0.56、2.68和3.80 mM, Bs936和BsAbn2的DS为1.17。同样，Bs4828、BsAbn2和Bs4828 + BsAbn2产生的阿拉伯糖当量分别为0.55、7.86和8.72 mM, DS为1.04(图7C, G)。对于阿拉伯糖的水解，Bs936 + BsAbn2和Bs4828 + BsAbn2分别释放了约3.98 mM和5.53 mM的还原端，分别是BsAbn2和Bs936/Bs4828 (3.65 mM和5.12 mM)的1.09/1.08倍，对应的DS为1.09和1.08(图7D, G)。在结构上，阿拉伯糖的主链由α-1,5连接的L-阿拉伯糖氨基糖基残基组成，其中一些残基末端由L-阿拉伯糖氨基糖和D-半乳糖氨基糖修饰。脱支阿拉伯糖是用α-L-阿拉伯糖醛酸苷酶去除阿拉伯糖中所有的1,2-和1,3-α-L-阿拉伯糖醛酸基分支而制备的。上述观察结果表明，Bs936/Bs4828可以通过切割D-半乳糖基分支单元直接促进降解，从而为BsAbn2进入并水解阿拉伯糖和脱支的阿拉伯糖主干提供空间。但由于半乳糖糖侧链数量有限，协同作用较弱。玉米秸秆是生产替代能源和生物制品的良好原料。半乳糖占玉米秸秆重量的2.5%，通常与其他植物结构多糖松散关联。从理论上讲，玉米秸秆中半乳糖的降解可能有助于破坏果胶多糖及其连接的半纤维素或纤维素微原纤维之间的联系，从而使其更容易受到进一步的酶降解。为了证实这一推测，研究了Bs936或Bs4828、双功能内切木聚糖酶/内切葡聚糖酶BaXynA和商用纤维素酶LsCel对PCS降解的协同作用。如图7E和7F所示，Bs936、BaXynA、LsCel、BaXynA + LsCel和Bs936 + BaXynA + LsCel在pH 5.5和45℃条件下水解PCS，分别释放0.01、0.22、12.41、14.03和16.13 mM的还原糖。同时，Bs4828，BaXynA，LsCel，BaXynA + LsCel和Bs4828 + BaXynA + LsCel在pH 6.5和55 ° C下对PCS的水解产量分别为0，2.08，6.89，11.97和13.30 mM。研究发现，单独使用Bs936或Bs4828对PCS几乎没有水解，BaXynA的水解性能优于内切-1,4-β-半乳糖苷酶，而LsCel产生的还原末端远远多于BaXynA。这些结果与PCS中半乳聚糖、木聚糖/ β -葡聚糖和纤维素的含量相一致。此外，Ba Xyn A与Ls Cel在整个过程中表现出协同作用，这与我们之前的报道一致。此外，将Bs936/Bs4828单独添加到BaXynA + LsCel混合物中，PCS的水解作用更为明显，释放的还原糖约为Bs936/Bs4828与BaXynA + LsCel生成糖量总和的1.15/1.11倍，说明Bs936与BaXynA + LsCel的DS为1.15,Bs4828与BaXynA + LsCel的DS为1.11(图7G)。因此，实验结果支持我们的假设。Bs936/Bs4828对半乳聚糖的降解可以分解存在于细胞壁的果胶RG-I，从而提高LsCel和BaXynA对纤维素和半纤维素的可及性。到目前为止，大量研究表明，通过在二元纤维素酶和木聚糖酶混合物中添加果胶酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶、阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶等辅助果胶酶和半纤维素酶，可以提高木质纤维素生物质的糖化效果。至于内切-1,4-β-半乳糖酶，据我们所知，只有de Lima等人报道了在商用纤维素酶混合物(Accellerase 1500)中加入B. licheniformis的GH53内切-1,4-β-半乳糖酶，脱木质素蔗渣的糖化能力提高了25%，但没有提供DS。我们的研究首次报道了当内切-1,4-β-半乳糖酶、内切木聚糖酶和内切葡聚糖酶一起使用时，可以实现更明显的复杂植物多糖降解。研究结果证实了内源性-1,4-β-半乳糖酶在生物降解酶混合物中的协同作用，为该混合物在生物催化工业中的应用提供了依据。
