Abstract
01
简介
β-1,3-葡聚糖是一组天然的碳水化合物聚合物，普遍存在于世界上的非纤维素生物质中，以真菌细胞壁、藻类储存多糖、细菌代谢物和谷物非淀粉多糖的形式存在。各种天然的β-1,3-葡聚糖，如层粘连蛋白、酵母葡聚糖、凝乳蛋白和pachyman，通常由β-1,3连接的主链组成，并伴有支链修饰β-1,3-葡聚糖由于其特殊的物理、化学和生物学特性，是一种有益的人体食用天然多糖。β-1,3-葡聚糖及其衍生的β寡糖常被用作食品增稠剂、功能性食品因子、生物防治剂和医药原料。
大型藻类是沿海生态系统的主要初级生产者，也是深海和沉积物的碳供给者。它们主要由复杂多样的多糖组成，如琼脂、藻胶和卡拉胶。了解海洋异养细菌降解多糖的机制对于破译海洋生态系统中的碳通量至关重要，因为这些微生物在环境碳循环中发挥着关键作用。卡拉胶是一种直链硫化多糖，是卡拉胶植物海洋红藻(红藻)的主要细胞壁成分。结构上，卡拉胶的重复二糖亚基由β-D-半乳糖(G-单位)和4-连接的α-D-半乳糖(D-单位)或4-连接的3，6-脱水-α-D-半乳糖(DA-单位)组成，它们通过β−1，4-和α−1，3-糖苷键交替连接。根据硫酸酯基团的位置和数量(S)和3，6-脱水-α-D-半乳糖在半乳糖重复单元中的存在，卡拉胶可分为κ-卡拉胶(G4S-DA)、ι-卡拉胶(G4S-DA2S)、α-卡拉胶(G-DA2S)、β-卡拉胶(G-DA)和λ-卡拉胶(G2S-D2S，6S)。卡拉胶的这种多样性意味着它的完全降解需要海洋异养细菌的降解酶和调节过程的复合体。
为了利用卡拉胶作为碳源，海洋细菌产生一系列蛋白质，包括卡拉胶酶和硫酸酯酶，用于卡拉胶的解聚、脱硫，以及其他用于3，6-脱水-D-半乳糖和D-半乳糖代谢的酶。内切作用的κ-卡拉胶酶(GH16)和ι-卡拉胶酶(GH82)特异性地裂解β−1，4糖苷键。不同的卡拉胶硫酸酯作用于低聚卡拉胶的硫酸盐基团以释放无机硫酸。编码这些蛋白质的基因通常是相邻的，并在一个称为PUL(14-16)的多糖利用基因座区域内共同调节。首次鉴定的卡拉胶多糖利用位点(CarPUL)来自海洋细菌Zobellia galactanivorans DsijT。该菌株首先利用κ-卡拉胶酶和ι-卡拉胶酶分别将κ-卡拉胶和ι-卡拉胶降解为κ-卡拉胶和ι-新卡拉胶寡糖。κ-新卡拉胶寡糖G4S上的硫酸盐基团可被G4S-硫酸酯酶S1_7脱除。G4S-硫酸酯酶(S1_19)和DA2S-硫酸酯酶(S1_17)分别负责脱除ι-新卡拉胶寡糖G4S和DA2S上的硫酸盐基团。释放的β-新卡拉胶寡糖在没有硫酸盐化的情况下最终转化为D-半乳糖和3，6-脱水-D-半乳糖，用于代谢的外源α−3，6-脱水-D-半乳糖苷酶(GH127和GH129型)和外源β-半乳糖苷酶(GH2)。
假交替单胞菌属(Pusoternomonas spp.)是全球分布的海洋相关菌株，可以通过不同的卡拉胶利用途径降解卡拉胶。例如，P. fuliginea PS47可以生长在κ-卡拉胶和ι-卡拉胶上，但在其CarPUL(12)中含有三个κ卡拉胶酶基因和不含ι卡拉胶酶编码基因。体外酶分析表明，ι-卡拉胶转化为β-新碳二糖是由G4S硫酸酯酶S1_19A、外源DA2S硫酸酯酶S1_NC、外源G4S硫酸酯酶S1_19B、GH16B酶和GH167外糖苷酶催化的。Pseudoalteromonas carrageenovora 9T同时具有κ-卡拉胶酶和ι-卡拉胶酶，但由于缺乏外-κ3，6-脱水-D-半乳糖苷酶，不能利用ι-卡拉胶作为唯一碳源。除假交替单胞菌外，还包括 Pseudoalteromonas spp. 和 Z. galactanivorans，还鉴定了海藻黄杆菌中的CarPUL，它含有一个多功能的G4S硫酸酯酶(OUC-S1_19B)，用于从κ-，ι-和λ-新卡拉胶寡糖中去除G4S或G2S硫酸盐基团。这些发现表明CarPUL具有高度的复杂性和多样性，特别是在不同的糖苷水解酶(GH)家族和不同的硫酸酯酶亚家族中。此外，CarPUL硫酸酯酶的功能对于各种卡拉胶的微生物利用至关重要。
之前分离到一株海洋Pseudoalteromonas LL1，它不显示ι-卡拉胶酶活性，但以κ-或ι-卡拉胶为碳源生长。根据16S rRNA基因序列，该菌株以前被认为是Pseudoalteromonas porphyrae，根据基因组DNA的平均核苷酸同源性分析，进一步确定该菌株为Pseudoalteromonas haloplanktis。在本研究中，对菌株LL1进行了深入的研究，以更好地阐明卡拉胶的代谢多功能性。根据CarPUL基因的生物信息学分析、关键硫酸酯酶的生化特性以及硫酸酯酶缺失突变株的构建，得出结论：菌株LL1利用硫酸酯酶PhSulf1和PhSulf2启动ι-卡拉胶分解代谢途径。此外，还研究了PhSULF1和PhSULF2基因及其转录本在全球的分布情况。这些结果为理解卡拉胶的利用机制提供了新的见解，特别是对于硫酸酯酶引发的ι-卡拉胶的分解代谢而忽略了ι-卡拉胶酶，并将加深我们对海洋细菌从复杂的多糖中有效地获取能量和营养的能力的理解，展示了生态背景下的多功能性。
02
结果
图1.P. porphyrae LL1对κ-卡拉胶和ι-卡拉胶的生长和卡拉胶酶的产生。以κ-卡拉胶(κ-CAR)、ι-卡拉胶(ι-CAR)或半乳糖(GAL)为碳源，以不添加卡拉胶和半乳糖(NC)的培养基作对照，培养28h。通过监测颗粒蛋白(A)来确定细胞生长情况。用上清液测定胞外卡拉胶对κ-卡拉胶和ι-卡拉胶的活性(B)，并用薄层层析法检测寡糖的生成(C)。NS，没有意义。
图2.CarPUL基因簇和硫酸酯酶的生物信息学分析。(A)已报告的卡拉胶降解剂中CarPUL的示意图和比较。表S2列出了PhPUL簇中基因的位置标签和注释。(B)用邻接法对PhCarPUL的PhSulf1、PhSulf2和PhSulf3进行了系统发育分析。根据系统发育，硫酸酯酶亚家族用不同的颜色突出显示。来自菌株LL1的硫酸酯酶用红点标记。浅蓝色三角形表示该菌株不含ι-卡拉胶酶。蓝色和白色方框分别表示κ-卡拉胶(κ-CAR)/ι-卡拉胶(ι-CAR)的G4S/DA2S位硫酸盐基团有或没有相应的硫酸酯酶活性，如外切酶(Exo-)/内切酶(Endo-)。
图3.P.haloplanktis LL1卡拉胶代谢途径几个关键基因的相对表达水平。该菌株以κ-卡拉胶(κ-CAR)、ι-卡拉胶(ι-CAR)或半乳糖(GAL)为碳源培养。**P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001.
图4.PhSulf1和PhSulf2的功能和底物特异性的测定。(A)对表达和纯化的PhSulf1或PhSulf2蛋白进行了SDS-PAGE分析。将纯化的蛋白质用于测定κ-卡拉胶(B)或ι-卡拉胶(C)的硫酸盐基团含量。采用3个独立重复进行统计分析。**，P<；0.01。NS，没有意义。(D)PhSulf2和PhSulf1对κ-(G4S-DA)、β-(G-DA)、ι-(G4S-DA2S)和α-(G-DA2S)卡拉胶的脱硫作用。
图5. P. haloplanktis LL1及其硫酸酯酶突变株∆SULF1和∆SULF2的相对细胞生长情况。以κ-卡拉胶(A)、ι-卡拉胶(B)或半乳糖(C)为碳源进行培养。计算各条件下LL1细胞的生长率为100%。用细胞总蛋白含量来评价细胞生长水平。(D)添加卡拉胶培养过程中硫酸盐基团含量的变化。
图6.P. haloplanktis LL1.ι-卡拉胶和κ-卡拉胶的分解代谢途径。
图7.海洋细菌中PhSULF1和PhSULF2的地理分布。使用截止值e−30研究PhSULF1(A和C)和PhSULF2(B和D)基因(A和B)及其转录本(C和D)的地理分布。每个站点的相对丰度用不同大小的符号表示。这些地图是使用在线海洋数据集(https://tara-oceans.mio.osupytheas.fr/ocean-gene-atlas/)
03
讨论
海洋生态系统是地球上最重要的生态系统之一。海洋细菌在海洋生态系统动力学和生物地球化学循环中发挥重要作用。假交替单胞菌属是一种海洋特有细菌，广泛分布于不同的海洋区域，具有很高的丰度。它被认为是具有代表性的卡拉胶降解菌属。此外，假交替单胞菌的生长表型表现出广泛的多样性和复杂性。例如，卡拉胶假单胞菌9T既能降解κ-卡拉胶，又能降解ι-卡拉胶，但缺乏将其作为唯一碳源利用的能力。4株假交替单胞菌，分别为P. fuliginea PS47, P. fuliginea PS2, P. distincta U2A和 Pseudoalteromonas sp. FUC4。据报道，FUC4在κ-卡拉胶和ι-卡拉胶上都生长，这是唯一可能的，然而，当在培养基中添加ι-或κ-卡拉胶寡糖时。在本研究中，P. haloplanktis LL1可以在不添加任何寡糖的情况下利用ι-卡拉胶，并显示出与κ-卡拉胶相似的生长效率(图1a)，这表明了一条独特的利用ι-卡拉胶的途径。
卡拉胶的代谢主要包括两个过程：解聚和脱硫(15，17)。通常，根据对卡拉胶降解菌的研究，κ-卡拉胶和ι-卡拉胶的利用遵循解聚和脱硫的顺序，如卡拉胶降解菌Z.Galactanivorans DsijT，C.echini A3T，F.algicola和P.carrageenovora 9T。这意味着κ-和ι-卡拉胶首先被κ-和ι-卡拉胶酶解聚生成寡糖，然后被卡拉胶专一性硫酸酯酶进一步脱硫以进行胞内代谢。P. haloplanktis LL1中含有编码GH16κ-卡拉胶酶PhCgk和外源G4S-硫酸酯酶PhSulf3的基因(图2a)，表明该菌株也对κ-卡拉胶的分解代谢采用了这种解聚-脱硫序列过程。然而，P. haloplanktis LL1没有ι-卡拉胶酶(图1B、C和2A)，并且在ι-卡拉胶分解代谢途径上显示出显著的差异。
另一株P. fuliginea PS47也被报道利用ι-卡拉胶，但不含编码ι-卡拉胶酶的基因。在前人研究的基础上，提出了将高度聚合的ι-卡拉胶输入周质，并利用S1_19A内切-G4Sι-卡拉胶硫酸酯酶和脂质锚定的GH16B共同作用产生不同硫化模式的寡糖。杂化寡糖被两个外源DA2S硫酸酯酶S1_NC和G4S硫酸酯酶S1_19B进一步脱硫，生成β-卡拉胶寡糖以供进一步代谢。这里，基于生物信息学(图2；S1)，生化(图4)以及遗传证据(图3和图5)，我们得出结论：P. haloplanktis LL1对ι-卡拉胶的分解代谢采用了独特的脱硫-解聚序列过程(图6)。硫酸酯酶PhSulf1和PhSulf2在启动分解代谢途径中起着不可或缺的作用。
在先前的研究中，脱硫-解聚顺序过程被定义为卡拉胶分解代谢的“途径II”。在这个过程中，ι-卡拉胶的脱硫是糖苷水解酶催化后续解聚的先决条件。因此，硫酸酯酶是卡拉胶降解的关键酶，特别是在没有ι-卡拉胶酶的情况下。所有参与卡拉胶代谢的硫酸酯酶可分为5个亚家族，即S1_7、S1_NC、S1_17、S1_19B和S1_19A(图2B)。其中，S1_17和S1_NC亚家族均由对ι-卡拉胶具有DA2S脱硫活性的硫酸酯酶组成。不同的是，S1_17成员来自含有ι-卡拉胶酶的菌株，而S1_NC硫酸酯酶则来自不产生ι-卡拉胶酶的菌株，如P. fuliginea PS47和P. haloplanktis LL1。S1_7和S1_19B亚家族对κ-卡拉胶具有外G4S-硫酸酯酶(Exo-G4S-KC)的保守功能，负责合成不含硫酸盐的β-卡拉胶寡糖。S1_19A成员来源于含有或不含有ι-卡拉胶酶的菌株，它们对κ-卡拉胶和ι-卡拉胶表现出不同的G4S脱硫活性。根据具有不同活性的硫酸酯酶的系统发育分析(图2B)，所有已知的S1_19A硫酸酯酶和S1_NC亚家族的PhSulf1对ι-卡拉胶具有内切硫酸酯酶活性，这是启动卡拉胶降解所必需的，而不是卡拉胶酶。此外，值得注意的是，在能够产生ι-卡拉胶酶的菌株中也检测到内硫酸酯酶，如Z.galactanivorans和F.algicola(图2B)，这表明这些菌株可能同时对ι-卡拉胶的分解代谢采用了脱硫-解聚和解聚-脱硫的顺序过程。
到目前为止，根据已知的经过脱硫-解聚顺序过程的细菌菌株，如P.fuliginePS47和F.algicola，ι-卡拉胶的分解代谢分别由亚家族S1_19A硫酸酯酶、PSS1_19A和OUC-S1_19B启动。根据这些硫酸酯酶的内切-G4S-硫酸酯酶活性(图2B)，去除ι-卡拉胶D-半乳糖残基中的硫酸盐基团以产生部分脱硫化的ι/α-卡拉胶杂化。然后，在具有ι/α-和κ/β-卡拉胶杂化活性的GH16酶的作用下，产物被水解成各种类型的寡糖，例如来自F. algicola的OUC-FaGH16A和OUC-FaGH16B，以及来自黄腐菌PS47的GH16B。获得的ι-卡拉胶寡糖随后在进一步代谢之前通过来自S1_19B或S1_NC亚家族的外源DA2S硫酸酯酶进行脱硫。在P. haloplanktis LL1中，也存在这样的ι-卡拉胶降解的脱硫-解聚顺序过程，并由PhSulf2(图6)启动，因为它对ι-卡拉胶具有内切-G4S-硫酸酯酶活性(图2B和4D S3)。因此，P. haloplanktis LL1的ι-卡拉胶分解代谢途径具有明显的特征。它可以由独特的内切作用的DA2S硫酸酯酶启动，产生ι/κ-卡拉胶杂交(图6)。
与在Galactanivorans DsijT和F.algicola中观察到的全基因组分布相反，我们的分析表明，菌株LL1中所有可能与卡拉胶解聚相关的基因都位于PhCarPUL簇中(图2A)。其中LL1_GM000391、LL1_GM000393和LL1_GM000414参与卡拉胶解聚，且均集中在PhCarPUL中。如图6所示，在PhSulf1和PhSulf2脱硫后，PhGH16(LL1_GM00393)被预测作用于卡拉胶杂交菌，并以内切α/β卡拉胶酶(GH16_13)的形式产生卡拉胶寡糖，供PhSulf3进一步脱硫。β-NC2(新卡拉比糖)随后从卡拉胶寡糖是由LL1GM000391编码的β半乳糖苷酶(PhGal和GH167)作用形成的，并被候选的α−1，3-(3，6-脱水)-D-半乳糖苷酶(LL1_GM00394)转化为D-半乳糖和3，6-脱水D-半乳糖。值得注意的是，根据CarPUL分析(图2A)，这种降解过程模式在各种Pseudoalteromonas中是保守的。相反，在Flavobacteriales的Z.galactanivorans DsijT和F.algicola中，外切β-半乳糖苷酶(GH2)和随后的外切-α−3，6-脱水-D-半乳糖苷酶(GH127和GH129)被确定为驱动解聚过程。这进一步突出了海洋细菌中卡拉胶代谢过程的多样性。
此外，P. haloplanktis LL1的ι-卡拉胶脱硫过程可以发生在细胞外，这从ι-卡拉胶培养过程中卡拉胶硫酸盐含量的下降得到了证明(图5D)。PhSulf1的这种胞外脱硫过程将大大促进菌株LL1对ι-卡拉胶的高效利用。此外，菌株LL1还可以为环境中缺乏硫酸酯酶的其他菌株提供脱硫产物，并在异养细菌群落中扮演“共享先锋”的角色，而不是自私的有机体。因此，尽管嗜盐假单胞菌LL1不能产生ι-卡拉胶酶，这要归功于特定的硫酸酯酶，但它使用两条不同的途径来分解κ-和ι-卡拉胶，这为该菌株提供了从海洋环境中获取营养的增强能力，从而提高了存活率。同时利用水解物和脱硫物的能力扩大了可用碳源的范围，从而增加了盐生浮游藻在海洋生态系统中的适应性和竞争优势。
DOI:https://doi.org/10.1128/aem.00255-24
END
前期回顾
《J. Agric. Food Chem.》糖苷水解酶家族157 内切-β-1,3-葡聚糖酶对植物病原体具有抗真菌活性的表征
