蛋白质的化学修饰方法大致可分为三类：1)利用cAAs的反应性进行修饰；2)核糖体介导的非规范氨基酸(ncAAs)掺入；3)通过亲和驱动的配体定向反应进行修饰。本节介绍这些方法的最新进展。表1总结了本节讨论的反应。表1. cAAs的化学修饰
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氨基酸的化学修饰为修饰蛋白质提供了直接的方法。这些残基的反应活性和相对丰度在决定化学修饰的选择性方面起着至关重要的作用。针对赖氨酸等高度丰富的残基的反应通常会产生修饰蛋白的混合物；然而，在获得位点选择性Lys修饰方面已经取得了重大进展。另一方面，Cys和Tyr等低丰度残基可能为位点选择性蛋白修饰提供了机会。其中许多反应可以在活细胞内作为常规实验的一部分进行。目前，多细胞生物的研究方法备受关注。在20种cAAs中，赖氨酸是一个有吸引力的修饰选择，因为它的天然丰度高，并且与它的亲核伯胺有许多生物相容性的化学反应。赖氨酸可以用亲电试剂修饰，如方酸、异硫氰酸酯、磺酰氯、活化酯(包括N-羟基琥珀酰亚胺[NHS])和2-氨基-2-甲氧基乙基(图1a-e)。由于其天然丰度较高，在位点选择性不重要或需要多个修饰位点的情况下，Lys修饰往往是有用的。例如，以NHS为基础的邻硝基苄基酯和醛类被用来修饰光敏水凝胶中的一种细胞外基质糖蛋白——玻璃体连接蛋白。该系统为研究细胞对生理线索的反应提供了简化的环境。通过在水凝胶上可逆地构建玻璃体连接蛋白的呈递模式，可以实现对成骨干细胞分化的时空控制。由于其天然丰度高，赖氨酸残基的位点特异性修饰具有挑战性。近年来，实现位点选择性的方法不断涌现。在一种情况下，利用赖氨酸残基在不同局部微环境中的不同反应性，Matos等人通过计算设计了磺酰基丙烯酸酯，可以进行化学和区域选择性修饰。使用设计的磺酰基丙烯酸酯，在不干扰POIss结构和功能的前提下，对包括治疗性抗体Trastuzumab在内的几种蛋白质中的单个Lys残基进行修饰。该方法提高了位点选择性，因为该反应有利于POIss中pKa最低的Lys残基(溶菌酶Lys33的pKa为9.5；膜联蛋白V Lys300的pKa为10.3；C2Am Lys100的pKa为10.1)。然而，这种策略在某些pKa最低的Lys无法访问的POIs中可能并不适用。在另一种情况下，为了制备抗体-药物偶联物(ADC)，Rader和同事通过醛醇和反醛醇反应将β-内酰胺衍生物与h38C2抗体中的Lys残基( p Ka ~ 6 )进行位点特异性偶联。这种方法可以得到均一的ADC，这可能有助于进一步的治疗开发。![]()
图1.赖氨酸化学修饰策略。(a)方酸酯反应，(b)用异硫氰酸酯生成硫脲，(c)磺酰氯反应，(d)用nhs酯生成酰胺，(e) 2-亚胺-2-甲氧基乙基反应。
除了Lys残基外，蛋白质的N 端伯胺还显示出独特的反应性。这种位点选择性修饰通常用于肽合成，并已应用于天然化学连接（NCL）反应（图2a)。在NCL反应中，一种肽的N端Cys残基的硫化物与另一种肽的C端硫酯反应。所得硫酯中间体发生酰基位移以形成天然肽键（图2)。N端修饰的另一种方法是表达蛋白连接（EPL）方法，其中重组蛋白可以与含有所需修饰的合成肽偶联（图2b) 。当所需位点接近 POIs 的 N 端或 C 端时，这种方法可以进行位点选择性修改。例如，N端超快分裂内含肽与组蛋白H2B的C端基因融合，然后与带有预泛素化Lys120的合成C端内含肽片段反应。两个内含肽片段之间的反应产生泛素化的 H2B（H2B–K120Ub）。半合成的 H2B–K120Ub 可起作用，可以在分离的细胞核中诱导染色质信号传导。此外，N-末端已被用于通过吡哆醛-5′-磷酸（PLP） 催化的转氨反应生成反应酮;然而，由于副反应，该反应与某些 N 端残基不相容，例如 Lys和Gln。所得酮或醛可用于肟/肼连接。例如，链霉亲和素的 N 末端被修饰为 α-酮酰胺，允许其通过肟连接固定在微图案表面上。这种方法将蛋白质固定在特定方向上，这对于维持其生物活性至关重要。此外，已经开发了用小分子修饰N-末端的策略，例如使用含醛的2-吡啶甲醛（2-PCA）进行还原烷基化。这种N-烷基化反应已被应用于在人胰岛素上安装仲胺。所得的仲胺保留了人胰岛素N末端的正电荷，修饰胰岛素的生物活性与未修饰的胰岛素相当。尽管取得了这些进展，但仍面临许多挑战。例如，许多蛋白质的N-末端可能无法进行修饰，或者可能对其生物/催化活性至关重要。此外，N端修饰需要仔细控制反应条件。除了赖氨酸残基外，蛋白质的N端伯胺也表现出独特的反应活性。这种位点选择性修饰通常用于多肽合成，并已应用于天然化学连接(NCL)反应中(图2a)。在NCL反应中，一个肽的N端Cys残基的硫酯与另一个肽的C端硫酯反应。所得的硫酯中间体发生酰基移位，形成天然肽键(图2a)。N端修饰的另一种方法是表达蛋白连接（EPL）方法，其中重组蛋白可以与含有所需修饰的合成肽偶联（图2b) 。当所需位点靠近POIs的N端或C端时，这种方法可以实现位点选择性修饰。例如，将N端超快分裂的内链蛋白遗传融合到组蛋白H2B的C端，然后与合成的C端内链蛋白片段反应，其中含有预泛素化的Lys120。两个蛋白片段之间的反应导致H2B泛素化(H2B - k120ub)。半合成的H2B-K120Ub是有效的，可以在离体细胞核中诱导染色质信号传导。此外，N端被用于通过吡哆醛-5'-磷酸(PLP)催化的转氨化反应生成活性酮；然而，由于副反应的存在，该反应与某些N端残基如Lys和Gln不相容。生成的酮或醛可用于肟/肼连接。例如，链霉亲和素的N端被修饰为α-酮酰胺，从而通过肟连接将其固定在微图案表面上。这种方法将蛋白质固定在一个特定的方向上，这对维持它们的生物活性至关重要。此外，已经开发出用小分子修饰N末端的策略，例如使用含醛的2-吡啶甲酸(2-PCA)进行还原性烷基化。这种N-烷基化反应已被应用于在人胰岛素上安装仲胺。所得到的仲胺保留了人胰岛素的N端正电荷，修饰后的胰岛素的生物活性与未修饰的胰岛素相当。尽管取得了这些进步，但仍然存在许多挑战。例如，许多蛋白质的N端可能无法修饰，或者可能对其生物/催化活性至关重要。此外，N端修饰需要对反应条件进行严格控制。![]()
图2.修饰蛋白质N端的策略。(a) NCL方法，使用一个具有N端Cys的肽和第二个具有C端硫酯的肽。(b)利用EPL生成半合成蛋白。在这种方法中，将POI的N端片段与一个内部蛋白融合，并通过过表达产生融合蛋白。然后使用含有所需修饰和N端Cys的合成肽片段来取代超快分裂的内部蛋白，在感兴趣的位点产生具有所需修饰的靶蛋白。红星表示蛋白质修饰。该图改编自文献[12]。
Cys是化学修饰的另一种选择残基，因为它的硫醇具有高亲核性，在蛋白质中的天然丰度较低，这两种残基都有利于POIs的单位点修饰。在控制良好的pH条件下，可以获得Cys残基对其他亲核残基(如Lys和His)的选择性修饰。半胱氨酸巯基可以用亲电性的α-卤代羰基(碘乙酰基、溴乙酰基或氯乙酰基)、马来酰亚胺、甲磺酸盐或苯基硫代磺酸盐(图3a)进行修饰。male亚胺类药物已被广泛用于合成ADC，包括FDA批准的ADC，如brentuximab vedotin、trastuzumab emtansine和certolizumab pegol。然而，马来酰亚胺缀合物的硫醚可以通过硫醇交换或水解驱动反应发生裂解。硫醇交换产生的产物会导致药物过早丧失疗效，并增加体内毒性。这些问题可以通过最小化硫醇交换反应或通过将马来酰亚胺硫加合物转化为稳定的开环共轭物来解决。后者是通过开发新的自水解马来酰亚胺来实现的，马来酰亚胺具有优越的药代动力学特性。![]()
图3.Cys残基修饰方法。(a)用卤代羰基、马来酰亚胺、砜等常用试剂对半胱氨酸进行化学修饰。(b)通过胺-巯基偶联试剂CBTF将抗体与染料偶联。(c)二溴代亚胺通过二硫桥接构建ADC。所有蓝色球体代表探针中的其他惰性官能团，红星代表要加入的修饰。
近年来，新一代的巯基靶向修饰试剂被开发出来，包括缺电子炔、3-芳基丙腈、烯酰胺、巯基炔反应和羰基丙烯酸试剂。例如，Wagner等人报道了一种胺-巯基偶联试剂，4-((4-(氰乙基)苯甲酰)氧)-2,3,5,6-四氟苯磺酸钠(CBTF)，它含有芳基丙腈官能团而不是马来酰亚胺(图3b)。与马来酰亚胺偶联物相比，所得偶联物在血浆中表现出更高的稳定性。在最近的一项研究中，Bernardes等人合理设计了羰基丙烯酸试剂，利用POIs的Cys残基进行巯基- michael加成。使用这种方法修饰了多种蛋白质，包括抗体。修饰后的抗体不仅均匀，而且对血浆中的降解具有抵抗力。Bernardes小组报道了通过乙烯基/烷基吡啶、氮醇冰片二烯溴麓基砜和重氮试剂进行Cys选择性蛋白质修饰的其他方法。在POIs缺乏硫醇官能团的情况下，二硫修饰可以作为替代目标。包括双砜、烯丙基砜、炔和3,4-二取代马来酰亚胺在内的多种试剂已被开发出来，以选择性地修饰蛋白质的二硫化物。例如，使用2,3-二溴马来酰亚胺和C-2(甘氨酸衍生)连接体，通过双烷基化反应生成阿霉素(DOX)-抗体偶联物(图3c)。这种方法产生了具有增强药理特性的同质ADC。氧乙烷是一种含氧(醚)的四元环，也被用于通过位点选择性双烷基化反应修饰蛋白质二硫化物。在其中一篇报道中，将氧乙烷安装在基因解毒白喉毒素(CRM197蛋白)上，由此修饰的蛋白在体内表现出更高的免疫原性。除了Cys外，天然丰度相对较低的芳香残基，包括His、Tyr、Trp和Phe，为位点特异性修饰提供了替代靶标。然而，获得一种芳香残基对另一种芳香残基的位点特异性修饰仍然具有挑战性。Tyr的可电离侧链的反应活性取决于它的质子化状态，这使得Tyr的反应活性可以通过控制反应的pH来调节。在酸性条件下，与羟基相邻的芳族ε-碳可能发生重氮偶联(图4a)。在最近的一项研究中，使用这种方法将鲑鱼的降钙素与线性单甲氧基PEG偶联。由此产生的偶联物保持降低血浆中钙离子浓度的能力。在pH值接近pK的条件下一个Tyr残基的苯酚侧链（pKa = ~10），氧的烷基化或酰化反应可以发生。另一种位点选择性Tyr修饰方法是使用π-烯丙基钯复合物 （图4b)。使用这种方法，将一种新型极性敏感荧光探针安装到牛Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD）的Tyr108上，从而可以监测含Tyr结构域的构象变化。如果感兴趣的结构域具有 Tyr 残基，则此示例可以作为研究蛋白质构象变化的一般方法。![]()
图4.Tyr改性方法。(a)通过重氮偶联对Tyr进行化学改性。(b)利用π-烯丙基钯配合物将SOD中的Tyr与荧光探针偶联。蓝色的球体代表剩下的官能团。
以色氨酸为例，通过金属催化反应对其侧链进行了修饰(图5)，包括炔基化、C-H芳基化和光诱导的四唑环加成。然而，这些方法通常涉及非生物相容的反应条件，如使用有机溶剂和高温。另一种选择性修饰色氨酸的策略是在环境条件下将N-氧自由基9-氮杂环壬烷-3-1-N-氧与NaNO2偶联(图5)。利用这种方法，Kanai和同事在肌红蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白和β2微球蛋白抗体上实现了Trp选择性修饰。这项研究为在生物相容性条件下不使用有毒金属修饰色氨酸开辟了新的途径，进一步为抗体等治疗靶点的功能调节铺平了道路。除了上述案例外，最近的综述也很好地总结了其他蛋白原性残基的位点特异性修饰。
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图5.利用N-氧自由基对色氨酸残基进行无金属化学修饰。粉色球体代表探针中的其他官能团。
利用化学反应对蛋白质进行修饰是选择性地在POIs上安装所需化学手柄的有力方法。操纵蛋白质翻译机制以直接结合ncAAs是另一种理想的方法，它可以引入超过20种cAAs所提供的新功能和反应性。将ncAAs掺入蛋白质已被广泛应用于生物催化中，以增强酶的活性和选择性，甚至可以使研究人员获得天然无法获得的新型催化反应。本节介绍了一些使用遗传密码扩展方法将ncAAs纳入POIs的最新示例。自然遗传密码由四个核碱基编码的64个密码子组成。其中，3个密码子作为终止密码子，其余61个密码子被转移RNA(tRNA)识别，并被同源tRNA合成酶(aaRS)与其中一个cAAs充电。除了吡啶赖氨酸和硒代半胱氨酸外，所有生物编码相同的20种氨基酸(aa)。利用和修改现有的蛋白质翻译机制将ncAAs纳入蛋白质的能力为蛋白质修饰开辟了新的途径。其中一种策略依赖于一些tRNA的混杂性，这些tRNA可以携带结构类似于其同源氨基酸的ncAAs(图6a)。在这种方法中，营养不良细菌宿主不能产生cAA，并依赖于外源供应的ncAAs。这种方法导致了ncAA与蛋白质组的整体结合。其中一个突出的例子是用Se-Met取代Met，将重原子纳入POIs中进行晶体相化。这种策略很简单，不需要对蛋白质翻译成分进行遗传操作。相反，这种方法依赖于aaRS-tRNA对的多特异性，这意味着只有与同源氨基酸结构相似的ncAAs才能被纳入，从而限制了修饰的数量。此外，ncAAs的整体掺入可能会改变蛋白质折叠，这可能导致POIs的活性和稳定性受到干扰。![]()
图6.在体内整合ncAAs的策略。(a)利用营养不良宿主的内源性aaRS-tRNA对残基特异性结合ncAAs。(b)利用正交aaRS-tRNA对，通过琥珀色密码子抑制法特异性地整合ncAAs。
将位点特异性ncAAs纳入POIs的另一种有效方法是通过遗传密码扩展(图6b)。在这种方法中，琥珀色终止密码子(UAG)被用于编码感兴趣的ncAA，因为它在大肠杆菌中的使用率很低(~ 7-8%)。琥珀色密码子被一个工程aaRS-tRNA对识别为感兴趣的ncAA。aaRS-tRNA对还必须是正交的，即不干扰内源性翻译系统(图6b)。例如，来自jannaschii甲烷钙球菌的酪氨酸-tRNA合成酶TyrRS-tRNACUA对在大肠杆菌和其他细菌中是正交的;大肠杆菌的TyrRS-tRNACUA和LeuRS-tRNACUA对在真核细胞中是正交的;来自barkeri和mazei的pyrolyyl - trna合成酶PylRS-tRNACUA对在细菌和真核细胞中都是正交的。可以获得位点特异性修饰的poi，但产量通常受到外源aaRS-tRNA对的表达水平和释放因子1 (RF-1)的存在的限制，释放因子1识别UAG三元组并终止翻译。最近，通过从大肠杆菌基因组中去除RF-1来改造大肠杆菌宿主。此外，273个琥珀色终止密码子中的95个被其他更常用的终止密码子取代。经过这种工程改造，大肠杆菌宿主在过表达含有ncAAs的蛋白时，其生长缺陷被最小化。最重要的是，在该工程宿主菌株中，ncAA的掺入效率>98%，允许可扩展地生产含ncAA的目标蛋白。迄今为止，已有超过200种ncAAs通过琥珀色抑制方法被纳入POIs，从而扩展了蛋白质的化学功能和反应活性。迄今为止，绝大多数采用这一技术的研究仅限于将单个ncAAs纳入POIs。将多个ncAAs结合到蛋白质中的能力可能为高级生物物理研究和合成增强的基于蛋白质的治疗方法提供新的机会。为了实现这一目标，增强aaRS-tRNA对的特异性和正交性是必不可少的。正交aaRS-tRNA对可以在翻译过程中对多个ncAAs进行充电。因此，为了选择性地结合多个ncAAs，正交aaRS-tRNA对必须具有高度选择性。已经开发了几种工程方法来解决这些挑战。Liu等人利用噬菌体辅助连续进化(PACE)技术进化出一种PylRS变体，其催化效率比野生型高45倍。通过该技术，还获得了对对碘-l-苯丙氨酸选择性提高的TyrRS变体。aaRS-tRNA对的工程已被证明可用于在多个位点结合ncAAs。在最近的一项研究中，Chatterjee和同事们同时将三种不同的生物偶联处理结合到GFP蛋白上，采用三对正交的方法来解码三个不同的密码子。这些氨基酸对包括大肠杆菌衍生的色氨酸对、古菌酪氨酸对和吡咯赖氨酸对。这项工作允许在没有外源化学催化剂的情况下对蛋白质进行简单的多位点标记。然而，掺入效率仅为野生型产量的2%。除了提高aaRS-tRNA对的特异性外，进化其他翻译机制组件对于将ncAAs有效地整合到POIs的多个位点也很重要。为了促进ncaa与大体积侧链或改变的主干的结合，核糖体工程已被尝试。核糖体的小亚基含有16S rRNA并结合mRNA，而大亚基含有23S rRNA。这两个亚单位都参与协调翻译过程。核糖体工程有两个主要的挑战。首先，核糖体的活性和保真度对细胞存活至关重要。其次，23S rRNA亚基可以在细胞内的原生rRNA和正交16S rRNA之间自由交换。为了克服前一个问题，进化出正交(O-)核糖体-MRNA对。在这些配对中，一个含有O-16S rRNA和抗shine-dalgarno (ASD)序列突变的O-核糖体被引入大肠杆菌(图7a)。这种O-核糖体可以选择性地翻译含有O-核糖体结合位点的正交mRNA (O-mRNA)，但不能翻译天然mRNA转录物。O-核糖体被进一步改造以将不同的ncaa整合到蛋白质中。内源性核糖体和正交核糖体共享23S rRNA。因此，在23S rRNA工程方面也有进一步的尝试。这些努力放大了新23S rRNA对O-mRNA翻译的贡献，并最小化了新23S rRNA在内源性翻译过程中的致死效应。为了实现这一目标，Chin等人报道了一种正交核糖体，其中两个亚基通过优化的正交RNA短链连接。这种工程钉接核糖体可以保持与正交亲本核糖体相当的活性，并且与内源性16S或23S亚基的关联最小(图7a)。这项技术为进一步改进正交核糖体以纳入更多的ncAAs开辟了道路。![]()
图7.其他平移机械部件工程。(a)聚合核糖体工程的努力使各种各样的ncAAs的结合成为可能。(b)核糖体工程，以有效解码四联体密码子。
其他令人兴奋的遗传密码扩展技术超越了规范的64个密码子。鼠伤寒沙门氏菌首次报道了四联体密码子的使用，其中观察到一个含有移框CCCC反密码子的tRNAGly。然而，天然核糖体解码四联体密码子的效率极低。为了克服这一挑战，Chin及其同事设计了利用四联体密码子而不是传统的三联体密码子的翻译组件(图7b)。在这项工作中，Chin及其同事进化出一种正交核糖体（ribo-Q1）和一种变体丝氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，可以在四联密码子上结合ncAA。然后使用该系统将叠氮化物和含炔烃的氨基酸掺入钙结合信使蛋白钙调蛋白中。另一项重要工作是一种具有扩展遗传密码的半合成细菌。在这项研究中，Romesberg等人引入了一个由两个脱氧核苷三磷酸(dNaM和dTPT3)组成的非自然碱基对(UBP)。理论上，这两个UBPs的加入使152个新的非自然密码子的结合成为可能。在这项研究中，作者发现了9个非自然密码子，可以用来有效地结合ncAAs。其中三个密码子是正交的，可以用于三个不同的ncAAs，这就产生了第一个67个密码子的半合成生物。遗传密码扩展允许将多种ncAAs结合到POI中，为双正交反应提供有用的化学处理。通过琥珀色密码子抑制方法，可以将叠氮化物、炔烃、烯烃和四嗪等几个官能团纳入，然后用适当的试剂修饰。例如，掺入的ncAAs的叠氮化物或炔可以发生铜催化的叠氮化物-炔环加成反应(CuAAC)，称为“CuAAC点击化学反应”(图8a)。click化学由于其高特异性和合理的反应速率，已被应用于通过双正交非规范氨基酸标记(BONCAT)分析细胞蛋白质组。通过将细胞培养基中的Met替换为含叠氮化物或炔的ncAA，如叠氮同质丙氨酸(AHA)或同质丙氨酸(HPG)，新合成的蛋白质具有叠氮化物或炔的功能标记，并且与先前存在的蛋白质池区分(图8b和c)。用AHA标记的时间应根据目标细胞类型的蛋白质合成速率进行调整。随后，含有AHA或hpg的蛋白质通过点击化学共价连接到亲和标签，如二硫生物素炔标签(DST-alkyne)。新合成的亲和标记的蛋白质可以通过常规生化研究或使用高分辨率质谱分析(图8c)。在最近的一项研究中，将炔炔Nε-(丙基氧羰基)- l -赖氨酸(AlkK)加入到小鼠组织切片和活体小鼠大脑的蛋白质组中，表达由病毒注射引入的正交赖氨酸对。含炔的蛋白质通过重氮苯连接物与链亲和素珠共价连接，然后将其裂解以释放标记的蛋白质组，用于串联质谱分析。该方法已被用于表征特定细胞类型经过药物治疗后新合成的蛋白质。![]()
图8.用点击化学修饰ncAAs。(a)铜催化叠氮化物与炔的偶联反应。(b)用于化学反应的含叠氮化物和含炔ncaa的例子。(c)使用点击化学标记新合成的蛋白质(黄色部分)，使用BONCAT技术。(d)含有烷基酸的蛋白质可以通过SPAAC进一步修饰。红色和蓝色球体代表探测器中的其他官能团。
CuAAC反应涉及使用有毒金属催化剂和外源配体。作为一种替代方法，应变促进叠氮化物-炔环加成(SPAAC)已成为一种强大的无铜点击化学修饰POIs(图8d)。目前已开发出几种应变炔，包括二氟环辛基、二苯并环辛基和双芳基环辛基。其中一些官能团可以通过琥珀色密码子抑制系统被纳入POIs。无铜点击化学已在各种应用中实现，最近的综述对其进行了很好的总结。另一种新兴的ncAA修饰策略是光点击化学，它涉及在烯基ncAA和腈亚胺之间进行光诱导的偶极[3 + 2]环加成反应。该反应导致荧光加合物的形成，不仅可以在体外修饰分离的蛋白质，还可以在活细胞中可视化蛋白质。这些例子说明了双正交反应在复杂生物环境(包括活细胞和多细胞生物)下对POIs的位点特异性修饰的一般适用性，这些环境对POIs的生物功能和活性的破坏最小。在某些情况下，蛋白质对其各自的结合伙伴具有高的结合亲和力。蛋白质和它们的结合物之间的相互作用允许亲和驱动的位点特异性修饰。各种识别驱动的化学修饰策略已经被开发出来，包括配体定向(LD)修饰。蛋白质的LD化学修饰已被开发用于内源性蛋白质标记，利用POIs和小分子之间的特定相互作用。在这种方法中，标记试剂包含亲和配体、报告标记和活性片段(图9a)。配体与POI的结合使标记试剂的反应单元靠近配体结合位点附近的残基，从而增强了选择性修饰。LD方法已应用于碳酸酐酶(CA)的标记。在本研究中，特定的配体苯磺酰胺通过苯基磺酸键偶联到一个合成探针上，该探针包括一个荧光基团(图9a)。在与目标蛋白结合后，POI中的亲核侧链与亲电的苯基磺酸酯基反应。该反应导致POI的标记，同时，配体可能解离。因此，经过化学修饰后，POI的功能不会被破坏。此外，用于CA标记的LD方法可用于体外和体内研究。![]()
图9.亲和驱动的蛋白质化学修饰。(a)基于ld的蛋白质标记方法。(b) LDNASA共价抑制剂通过LD化学修饰得到。红星和黄星分别代表一个探测器。蓝色和粉色的球体分别代表一个官能团。
非共价和可逆配体结合剂在许多应用中都很有用。然而，在某些情况下，形成稳定共价加合物的能力可能很重要，例如在抑制剂的开发中。在最近的一项研究中，Hamachi等人报道了一种新的基于配体定向的N-酰基-N-烷基磺酰胺(LDNASA)的共价抑制剂，其靶向伴侣蛋白Hsp90(图9b)。LDNASA能够对Lys58进行位点特异性修饰，Lys58是Hsp90中靠近配体结合位点的残基。该反应导致Hsp90与其抑制剂之间形成共价加合物(图9b)。用ldnasa连接抑制剂治疗癌细胞导致Hsp90在Lys58位点被抑制剂不可逆的共价修饰，并降低Hsp90在癌细胞中的分子伴侣活性。化学修饰和遗传密码的扩展允许将结构和化学上多样化的ncAAs整合到POIs中，从而可以研究包括金属酶在内的蛋白质的生物学功能和调控。除了这些方法之外，还可以通过在蛋白质支架上安装非生物金属辅助因子来实现蛋白质修饰，从而产生人工金属酶。这些技术为研究具有新活性的金属酶的酶反应机理和工程研究开辟了新的途径。在这些金属酶中，非血红素铁(NHFe)和血红素酶催化一系列显著的化学转化，包括羟基化、内过氧化和以牺牲作为最终电子受体的分子氧为代价的去饱和。近年来在金属酶工程及其生物化学应用中利用这些策略的努力在最近的几篇综述中进行了总结。本节介绍了近年来对NHFe、血红素和含Cu酶的案例研究，其中ncAAs被用作新工具。我们在表2中总结了所讨论的案例。表2.蛋白质修饰在金属酶研究中的应用
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翻译后修饰(PTMs)是蛋白质功能的必要条件，包括亚细胞定位、蛋白-蛋白相互作用和催化。例如，蛋白质衍生的硫醚Cys-Tyr交联可增强NHFe半胱氨酸双加氧酶的半胱氨酸氧化活性(CDO，图10a和b)。在CDO中，八面体亚铁由一个3-His基序配位(图10b)。CDO中的Cys-Tyr交联生物发生是一种自催化氧化反应，氧活化的铁中心氧化活性位点(Cys和Tyr)上的残基，而不是底物L-Cys。尽管Cys-Tyr交联在催化活性中起着重要作用，但这种交联的生物发生机制细节仍不清楚，部分原因是获得同质的交联或非交联CDO群体的挑战。在最近的一项研究中，Liu等人采用琥珀色密码子抑制方法将人CDO中的Tyr157替换为卤素取代的Tyr。含氟和含氯的CDO变体仍然具有活性，尽管活性较低(为野生型活性的2-10%)。有趣的是，在这些变体中也观察到Cys93-Tyr157交联。考虑到高键解离能，C-F键的裂解在Cys-Tyr交联生物发生中是意料之外的(图10c)。氧化C-F键断裂可能发生在Tyr157被铁中心或Cys93自由基氧化的过程中。本研究首次报道了NHFe酶介导的C-F键氧化裂解。![]()
图10.应用ncAAs研究Cys-Tyr辅助因子在CDO中的生物发生。(a) CDO介导的半胱氨酸氧化。(b)野生型CDO中的3-His基序和Cys-Tyr交联(绿色)与L-Cys底物(紫色)配合。铁的中心用黄色球体表示(PDB ID: 6BGF)。(c) c - f键在CDO催化下的裂解。(d)未交联的F2-Tyr CDO•L-Cys的结构(蓝色，PDB ID: 6BPS)与成熟的F2-Tyr CDO•L-Cys的结构(粉色，PDB ID: 6BPV)重叠，显示出Cys93的两种构象。氟原子用浅蓝色表示。(e) F2-Tyr CDO•LCys•NO的三元配合物(洋红色)表明，Cys93的一个构象是3.1 Å，来自NO，并被金属中心(PDB ID: 6BPR)氧化。
含有CDO的F2-Tyr的非交联结构表明，在Cys-Tyr辅因子形成之前，Cys93具有两种构象(图10d)。在交联生物发生过程中，Cys93的硫原子可能会向铁中心旋转，这是由最近报道的非交联F2-TyrCDO•L-Cys•NO三元配合物的结构所支持的(图10e)。该结构揭示了NO与Cys93的一个构象之间的相互作用，表明半胱氨酸氧化可能在交联形成之前发生。一项计算研究进一步支持了铁中心氧化Cys93的观点，该研究表明，铁结合氧作为交联生物发生的第一步氧化Cys93，而不是像之前提出的那样氧化Tyr157。对CDO辅助因子生物发生的研究突出了POIs位点特异性修饰在机理研究中的普遍适用性。由于Tyr在酶催化中的重要作用，在一些情况下，人们寻求控制活性Tyr残基的结构特征和化学性质(还原电位和pKa)的能力。麦角硫因是一种有效的抗氧化剂，被认为是一种长寿维生素。由于其潜在的益处，麦角硫因的生物合成受到了相当大的关注。在分枝杆菌麦角硫因生物合成途径中，NHFe亚氧化酶EgtB介导水仙花碱与γ-谷氨酰半胱氨酸之间的氧化偶联(γ-Glu-Cys，图11b)。最近，真菌麦角硫因生物合成途径被报道，其中亚砜合成酶Egt1催化水仙花碱和L-Cys之间形成C-S键(图11b)。在另一种强效抗氧化剂卵硫醇A的生物合成中也观察到类似的反应。在卵硫醇生物合成中，一种亚砜合成酶OvoA催化L-His和L-Cys之间的氧化偶联(图11b)。麦角硫因和卵硫醇亚砜合成酶的反应在底物选择性和产物的C-S键区域选择性方面是不同的。在EgtB-和Egt1催化中，C-S键在海参碱的咪唑环ε-碳上形成，而OvoA催化在L-His的咪唑环δ-碳上形成C-S键(图11b)。耐高温分枝杆菌的EgtB结构显示出与CDO类似的3-His铁配位位点(图12a)。将活性位点Tyr377突变为Phe抑制了亚砜合成酶的活性，γ-Glu-Cys的氧化是突变体的主要活性。最近，一种来自嗜热候选绿酸杆菌的亚砜合成酶的晶体结构也有报道，其铁中心也具有3-His铁配位体环境。基于EgtB晶体结构，基于密度泛函理论(DFT)或量子力学/分子力学(QM/MM)方法的计算，提出了三种不同的机制模型(图12c)。关键问题是该反应是否涉及亚磺酸中间体以及活性位点Tyr377在EgtB催化中起什么作用。关键问题是该反应是否涉及次磺酸中间体，以及活性位点Tyr377在EgtB催化中发挥什么作用。在图12c中，Tian和Wei报道的两个独立的理论研究表明硫氧化为次磺酸是反应(路径IA-IC)的前半部分，而Faponle等人的另一项研究提出氧化C - S键的形成是EgtB催化的前半部分(Path II)。在这两个机理模型(通路Ⅰ与通路Ⅱ)中，对活性位点Tyr377提出了不同的功能。在Tian模型中，Tyr377作为路易斯酸/碱(路径I , 图12c)起作用。在Faponle模型中，Tyr377在质子耦合电子转移( PCET )过程(路径II , 图12c)中起着关键作用。由于这些反应的相似性，所有关于EgtB催化的机理讨论都被扩展到OvoA的研究中。为了揭示OvoA催化的机制，Liu和同事利用了非典型Tyrs的独特化学性质。值得注意的是，生化表征还揭示了半胱氨酸在OvoA催化中的氧化活性。计算研究和生化结果表明，亚砜化和半胱氨酸氧化活性可能是OvoA催化中一个共同中间体的两个分支。因此，采用同位素敏感分支法测量OvoA反应的动力学同位素效应。OvoA中的Tyr417是EgtB的Tyr377对应体(图12a和b)。使用琥珀色密码子抑制系统(图11a)将OvoA的Tyr417替换为2-氨基-3-(4-羟基-3-(甲基硫)-苯基)丙酸(MtTyr)。OvoAY417MtTyr变体的底物KIE接近统一，与野生型相当。这一实验结果与Wei等人预测的初级底物氘KIE高达5.7的模型相矛盾。为了进一步研究Tyr417的作用，Liu及其同事用3-甲氧基酪氨酸（MeOTyr）取代了Tyr417，它具有类似的pKa，但还原电位远低于典型的Tyr。OvoAY417MeOTyr变异具有反向的KIE，而野生型具有接近统一的KIE。这些结果暗示Tyr417可能是ovoa催化氧化还原化学的一部分。![]()
图11.Tyr类似物的化学性质及麦角硫因和卵硫醇a的生物合成(a)利用琥珀色密码子抑制方法将非典型Tyr纳入POIs具有不同的还原电位和pka。(b)亚砜合成酶(EgtB/Egt1/OvoA)在麦角硫因和卵硫醇A生物合成中的氧化C-S键形成反应。
Faponle等提出的模型与上述实验结果更为吻合。在该计算模型中，如果咪唑环的δ-氢被氘取代，则可以预测逆氘KIE，这在OvoAY417MeOTyr变体中确实观察到。鉴于OvoA-和EgtB-催化之间的相似性，我们将在EgtB机制模型的背景下讨论OvoA机制(图12c)。在Faponle及其同事提出的模型中，氧结合和激活导致了一个FeIII-超氧氧物种(f)。然后，EgtB中的Tyr377通过活性位点的水网络参与PCET过程，产生了FeIII-氢过氧物种(g)和一个基于Tyr377的自由基物种(图12c)。随后γ-Glu-Cys的硫原子在水仙花碱的咪唑侧链上的亲核或自由基攻击产生硫醚产物。在这一步骤中，氢过氧化物中的氢原子传递回基于Tyr377的自由基，再生Tyr377并生成FeⅡ-超氧化合物(h)。然后，FeⅡ-超氧化合物从咪唑环中提取一个氢原子以再生芳构性并生成FeⅡ-氢过氧化物中间体(i)，该中间体经过氧化生成亚砜产物(图12c)。我们的含meotyr的OvoA研究与Faponle等人提出的EgtB模型一致。然而，OvoA结构是不可用的，OvoA和EgtB可能遵循不同的机制模型。需要进一步的动力学和光谱学研究来揭示这些亚砜合成酶的机理细节。
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图12.亚砜合酶的结构和机制。(a)含有金属中心和活性位点Tyr377的EgtB晶体结构。铁的中心用黄色球体表示，水分子用红色球体表示。(b)含拟金属中心和活性位点Tyr417的塔斯马尼亚厄尔维尼亚OvoA的计算模型。(c)拟议的埃及结核机制。
还有另一种酶系统，其中Tyr在催化中的作用正受到激烈的争论。在致震颤真菌毒素verruculogen的生物合成中(2)，α-酮戊二酸依赖(αKG) NHFe酶FtmOx1介导伏曲霉素B的内过氧化(1)(图13a)。在没有额外还原剂的单次翻转反应条件下的生化表征（例如，抗坏血酸)，揭示了ftmox1催化的每个循环消耗两分子分子氧，并涉及两个不同的反应:产生疣状菌素的内过氧化反应(2)和疣状菌素的c13 -羟基氧化形成酮类产物(3)(图13a)。化合物3是单次转化条件下的主导产物。在报道的FtmOx1•αKG二元配合物的晶体结构中，αKG通过远端构型与金属中心坐标，Tyr224靠近假定的氧结合位点(图13b)。结构、生化和光谱表征得出了一个机制模型，其中Tyr224自由基是ftmox1催化的关键物种之一(图13c)。![]()
图13.FtmOx1介导的内过氧化反应。(a)在没有额外还原剂(如抗坏血酸)的情况下，FtmOx1在单次周转条件下的反应产物。(b) FtmOx1•αKG二元配合物的远端型αKG结合构型(PDB ID: 4Y5S)。αKG以紫色表示，铁中心以黄色球体表示。水以红色球体的形式呈现。(c)在单次翻转条件下提出的FtmOx1机制模型，涉及Tyr224自由基作为关键物种之一(绿色阴影)。Tyr224自由基也负责启动c13-羟基氧化为酮产物(13)。因此，在单次翻转条件下，ftmox1催化存在两个反应周期。
然而，在最近的一份报告中，Bollinger及其同事提出，另一种酪氨酸残基(Tyr68)可能是酪氨酸自由基位点(图14)。作者报道，在FtmOx1Y68F变体催化的反应中，形成了一个新的主要的、未表征的产物。在ftmox1催化中，在单次转化条件下，在没有其他还原剂的情况下，酮产物(3)是主导产物。在这个Tyr68自由基模型中(图14)，Tyr68位于蛋白质表面，完全暴露在溶剂中，Fe中心远离底物的C13-OH基团。使用Tyr68自由基模型来解释酮产物(3)作为主导产物的形成将具有挑战性。此外，在对反应产物的结构进行表征后，讨论Tyr68自由基的机理模型将更有说服力。因此，Tyr224仍然是ftmox1催化中酪氨酸基自由基的最佳候选。为了提供进一步的证据来区分两种提出的机制模型，使用非规范Tyr将有助于表征两种Tyr残基在ftmox1催化中的催化作用，这是我们实验室正在进行的工作。![]()
图14.提出的FtmOx1机制模型涉及tyr68基自由基(绿色阴影)。
另一种常见的铁依赖性酶是含血红素的酶，其中铁中心与卟啉配位为四齿配体。除了血红素辅因子外，这些酶通常还具有额外的金属，它们催化各种反应，例如铜（CuB）在血红素铜氧化酶（HCO）和铁（FeB）在一氧化氮还原酶（NOR） 中。设计人工血红素酶是一种强大的工具，不仅可以促进深入的机理研究，还可以开发新的生物催化剂。在血红素酶工程中，通过调节金属配体和二级配位壳残基，可以采用合理的酶设计和定向进化两种方法。读者可以参考最近几篇关于人工金属酶工程的综述。细胞色素c氧化酶(CcO)是HCO家族的一种膜结合蛋白。它催化O2还原为水而不产生有毒的活性氧(ROS)。在该反应中，额外的CuB位点的催化功能尚不清楚。由于难以获得大量的膜结合CcO，因此通过对抹香鲸Physeter macrocephalus (swMb，图15a)中含血红素的氧载体蛋白肌红蛋白进行工程改造，生成了该酶的人工模型。根据swMb与天然牛CcO的结构比较，选择swMb活性位点的His64、Leu29和Phe34残基构建CuB结合位点。Leu29和Phe34都突变为His，产生swMb L29H F43H变体，称为CuBMb。这一改造的CuBMb变体表现出类似于HCO家族血红素-铜中心的生物物理特性。此外，工程化 CuBMb 的光谱研究表明，在 HCO反应中，CuB中心增强了分子氧与血红素中心的结合亲和力。![]()
图15.CuBMb酶工程。(a) swMb (PDB ID: 1VXA)的晶体结构。选择残基Leu29、Phe43、His64和Val68来创建Cu结合位点。(b)牛心脏CcO (PDB ID: 1OCO)的晶体结构。Tyr244和His240形成共价交联，这被认为是氧化酶活性所必需的。铜以蓝色球体表示。
CuBMb蛋白的创造使得后续的努力能够改善其自然活性，甚至创造非自然活性。在CuBMb中，ROS的形成受到抑制，而H2O的产生相对于野生型swMb没有明显变化。HCOs在活性位点含有保守的Tyr-His交联，这种交联被认为对产水很重要(图15b)。Lu和他的同事用一个Tyr残基取代了Gly65，这是一个靠近铜结合位点的残基。与原生的CuBMb相比，变种CuBMbG65Y的产水速率显著提高。考虑到Tyr在CuBMbG65Y催化中的重要性，作者利用琥珀密码子抑制方法结合的ncAA进一步研究了Tyr- his交联在hco催化中的作用。在这项研究中，Lu和同事选择(S)-2-氨基-3-(4-羟基-3-(1h -咪唑-1-基)苯基)丙酸(imiTyr)来模拟Tyr-His交联。由此产生的imiTyr-CuBMb变体不仅介导了超过1000次的O2还原反应，而且相对于CuBMbG65Y变体，还使ROS的形成最小化。这项研究强调了Tyr-His交联在HCO中选择性产水和最小化ROS形成的关键作用。工程HCO的催化活性和选择性的增强揭示了蛋白质修饰在开发健壮的生物催化剂中的价值。NORs与HCOs相似，它们都在血红素中心附近含有一个额外的铁结合位点。然而，NORs可以催化NO的双电子还原成N2O。此外，由于缺乏NOR晶体结构，从血红素模板(即swMb)创建NOR活性具有挑战性。基于他们在CuBMb研究中的成功，Lu及其同事创造了swMb的变体FeBMb，具有NO还原活性。从CuBMb (swMb L29H F43H变体)支架开始，引入额外的Val68 to Glu突变来模拟NOR中的Glu残基(图15a)。CuBMbV68E变体具有所需的FeB位点，并且也表现出与天然NOR相当的NO还原活性。在这些血红素酶工程的努力中，除了改变金属结合位点外，血红素类似物可以取代天然血红素；第二个血红素辅助因子也可以加入。例如，HCOs中的天然血红素b已被单甲酰基、二甲酰基和双乙酰血红素所取代(图16a)。通过增加这些血红素类似物中吸电子基团的数量，HCO的还原电位成比例地增加。增强的还原电位导致HCO具有增加的双氧还原活性。在另一项研究中，锰salen复合物Mn (salen)通过两点共价附着策略被引入swMb，其中Leu72和Tyr103突变为Cys。然后，swMbL72C_Y103C变体的这两个Cys残基与人工辅助因子的甲烷硫代硫酸盐基团反应，将Mn(salen)共价附着在蛋白质上(图16a)。与载子swMb(<5%)相比，含Mn(salen) swMb催化硫代苯甲醚亚氧化反应的对端选择性显著提高(51%)(图16b)。在这些研究中，通过体外重组将血红素类似物引入纯化的载脂蛋白酶中。这种方法往往导致重组全酶的产率低。为了克服这一问题，研究人员开发了一种正交酶/血红素对，由血红素样辅助因子和互补血红素结合蛋白组成(图16c)。在这个系统中，原生血红素运输通道ChuA进化为输入铁去卟啉IX (Fe-DPIX)辅因子，该辅因子选择性地结合来自巨芽孢杆菌的工程细胞色素P450支架。含有变异的非天然辅因子不催化天然P450单氧反应。相反，这种人工酶催化环丙化反应(图16d)。![]()
图16.血红素类似物或人工金属配合物的结合，以产生血红素蛋白变体。(a)血红蛋白变异中使用的非天然辅因子。(b)含Mn(salen)的swMb催化的亚砜化反应。(c)体内利用血红素转运蛋白ChuA结合非天然辅因子。(d) p450与Fe-DPIX催化环丙烷化反应。
2.3. 铜酶工程
含铜金属酶在多种生物过程中发挥着重要作用，例如，由于其金属中心具有广泛的氧化还原电位，因此可以作为电子传递介质。其中，来自铜绿假单胞菌的Azurin (Az)是一种被广泛研究和重组的I型铜蛋白。三角形双锥体Cu2+由2-His和1-Cys结合在一个平面上，Met121和Gly45的羧基部分在轴向位置结合(图17)。为了确定轴向Met配体在Az中的作用，Lu和同事通过表达蛋白连接方法用多个ncAAs取代Met121。ncAAs的疏水性与铜中心的氧化还原电位呈线性相关，疏水性越高，还原电位越高。除了铜结合配体的工程外，由于载脂蛋白的稳定性，Az还可以作为蛋白质支架来结合非天然辅因子。二茂铁是一种很有吸引力的有机金属催化剂，但由于其在水溶液中的溶解度差，其应用受到限制。为了解决这个问题，通过Cys112和2-[(甲基磺酰基)硫]乙基二茂铁之间的共价连接，生成了Azurin-二茂铁配合物。与野生型相比，含二茂铁络合物的Az变体的还原电位增加。二级配位壳残基的改造进一步增强了Az变体的还原潜力。Az还原电位的可调性使其成为生物系统中良好的电子传递介质和酶工程的理想靶标。![]()
图17.Azurin的金属结合位点。在azurin (PDB ID: 4AZU)的活性位点上，铜离子(蓝色球体所示)由Gly45、His46、Cys112、His117和Met121配位。
