尽管靶向EGFR激活突变的TKIs显著改善了EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）患者的预后，但耐药性仍不可避免地出现。尽管这些耐药机制存在异质性，但在EGFR - TKIs存在的情况下，许多机制会诱导MAPK信号通路的激活。ARAF基因扩增被认为是通过直接与RAS相互作用激活MAPK信号的机制之一，但其临床病理特征却知之甚少。研究者对EGFR突变型NSCLC患者在对EGFR - TKIs产生耐药后再次活检样本中ARAF扩增的情况进行了单中心回顾性分析。从电子病历中提取人口统计学数据、治疗过程和临床分子检测报告。使用基因拷贝数检测法确定ARAF扩增情况。对存在ARAF扩增且出现向小细胞肺癌（SCLC）组织学转化的患者进行RNA序列分析。
在97例对厄洛替尼或吉非替尼耐药的患者中，有5例检测到ARAF扩增；在48例对奥希替尼耐药的患者中，有4例检测到ARAF扩增。ARAF扩增主要见于EGFR外显子19缺失的女性患者。所有存在ARAF扩增的肿瘤均保留了初始的EGFR突变，且无继发突变。研究者还发现2例ARAF扩增病例显示出从肺腺癌向小细胞肺癌（SCLC）的组织学转变。
在5% - 8%的EGFR - TKI耐药肿瘤中检测到ARAF扩增。ARAF扩增可能营造了在EGFR - TKI作用下促进肿瘤细胞存活和神经内分泌标志物转录的条件。ARAF在SCLC转化中的可能作用有待进一步研究。
研究背景
EGFR TKIs靶向治疗的出现，显著改善了EGFR突变型肺癌患者的治疗反应和无进展生存期（PFS）。然而，基本上所有最初有治疗反应的患者最终都会对这些药物产生获得性耐药。EGFR - TKIs的耐药机制主要分为三大类：（1）EGFR出现继发突变（T790M、C797S）；（2）其他受体（MET、HGF、AXL、IGF - 1R）或下游蛋白（AKT突变、PTEN缺失）替代通路的激活；（3）表型转化。
前两种耐药机制与基因变异相关，而表型转化的原因仍不明确。在使用早期一代EGFR TKIs治疗期间，SCLC转化被认为是EGFR突变型NSCLC疾病进展过程中最常见的表型变化。然而，近期研究结果表明，基于一项随访有限的小样本队列研究，在接受奥希替尼治疗的患者中，鳞状细胞癌（SCC）转化可能更为普遍（15%）。转化后的肿瘤通常保留原始的EGFR突变。
诊断组织学转化的一个关键因素是是否存在预先存在的混合组织学类型的可能性，而通过小活检样本或细胞学样本很难准确评估这一点。这种复杂性突显了研究组织学转化所面临的挑战。此外，虽然SCLC常常伴有视网膜母细胞瘤基因（RB1）的突变或缺失，但RB1缺失对于腺癌发展为SCLC来说是必要条件，但并非充分条件。其他信号通路，如NOTCH、ASCL1和TP53，可能也发挥着重要作用。在表型转化过程中，基因和非基因耐药机制之间的相互作用仍不明确。
当EGFR出现继发突变或旁路网络被激活时，EGFR - TKIs无法抑制经典的癌症信号通路，从而导致肿瘤细胞增殖。MAPK是一条与癌症密切相关的关键信号通路，在对分子靶向药物的耐药过程中发挥着关键作用。在MAPK信号通路中，RAF激酶是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，由三种RAF异构体组成：ARAF、BRAF和CRAF。虽然BRAF变异是对EGFR治疗产生耐药的主要机制，但最近发现，ARAF扩增会导致EGFR突变型肺癌对EGFR抑制剂产生耐药。从机制上讲，ARAF直接与RAS结合，取代GTP酶激活蛋白NF1，从而拮抗其对RAS的抑制作用。因此，ARAF表达的增加会促进MAPK信号通路的激活。
在本研究中，研究者分析了对第一代或第二代EGFR - TKI耐药且存在ARAF扩增的癌症的详细特征，此前研究者已报道过这类癌症的发生率。此外，研究者还对奥希替尼耐药患者进行了ARAF扩增检测。研究者发现，存在ARAF扩增且对EGFR - TKI耐药的肿瘤，多出现于携带EGFR外显子19缺失突变的女性患者中。此外，研究者在转化为SCLC的肿瘤中发现了ARAF扩增，并对其表型进行了表征。
研究结果
第一代EGFR-TKIs耐药患者的ARAF扩增：
在97例对厄洛替尼或吉非替尼产生耐药后进行再次活检的患者中，有5例检测到ARAF扩增。图1A展示了ARAF拷贝数的分布情况。ARAF扩增阴性患者的中位年龄为65岁（范围：36 - 85岁），ARAF扩增阳性患者的中位年龄为66岁（范围：36 - 80岁），二者相似。图1B总结了ARAF扩增患者的临床病理特征。ARAF扩增主要见于EGFR外显子19缺失的女性患者。所有存在ARAF扩增的肿瘤均保留了原始的EGFR突变，且无T790M突变。3例患者有TKI治疗前的肿瘤样本，均未显示ARAF扩增迹象。
图1
第三代EGFR-TKIs耐药患者的ARAF扩增：
为探究ARAF扩增是否与第三代EGFR-TKIs耐药相关，研究者对48例对奥希替尼产生耐药后进行再次活检的标本进行了筛查。其中，13例患者将奥希替尼作为一线治疗药物。图1C展示了ARAF拷贝数的分布情况，4例检测出ARAF扩增。ARAF扩增阴性患者的中位年龄为63岁（范围：37 - 83岁），ARAF扩增阳性患者的中位年龄为70岁（范围：51 - 82岁），二者相近。所有存在ARAF扩增的肿瘤均保留了初始的EGFR突变，且无C797S突变（图1D）。3例患者证实奥希替尼治疗前不存在ARAF扩增。
ARAF扩增耐药肿瘤的SCLC转化：
在存在ARAF扩增的肿瘤中发现了2例发生SCLC转化的病例。在对第一代/第二代EGFR - TKI耐药的患者中，92例无ARAF扩增的患者中有1例发生SCLC转化，5例有ARAF扩增的患者中有1例发生转化（p = 0.10）。在对奥希替尼耐药的患者中，44例无ARAF扩增的患者中有1例发生SCLC转化，4例有ARAF扩增的患者中有1例发生转化（p = 0.16）。综合这些结果，136例无ARAF扩增的患者中有2例发生SCLC转化，9例有ARAF扩增的患者中有2例发生转化（p = 0.018）。
在第一代EGFR - TKI耐药队列中，一名74岁女性被诊断为TTF - 1阳性腺癌。部分细胞CD56阳性，但突触素阴性（病例1，图2A）。血液检测显示CEA和NSE升高，分别为25.7ng/mL和46.2ng/mL。由于神经内分泌肿瘤标志物升高，该患者先接受了铂类化疗，随后接受EGFR - TKI治疗。吉非替尼和厄洛替尼均无效。对原发灶再次活检发现，大多数肿瘤细胞CD56和突触素呈阳性。基因检测显示存在外显子19缺失和ARAF扩增。
图2
在奥希替尼耐药队列中，一名82岁女性最初被诊断为携带EGFR外显子19缺失的腺癌。她使用吉非替尼治疗后获得部分缓解，病情进展后使用细胞毒性药物。在奥希替尼治疗前的活检显示TTF - 1表达呈异质性。TTF - 1阴性细胞p40阳性，提示为腺鳞癌（病例2，图2B）。基因检测发现存在初始的外显子19缺失，但无T790M或ARAF扩增。奥希替尼耐药后的活检样本显示出现SCLC转化，ARAF拷贝数从3.5增加到7.9。
此外，一名35岁患有未分化腺癌的女性病例为ARAF扩增和SCLC转化之间提供了可能的关联。吉非替尼耐药后再次活检的样本中发现CD56阳性细胞，但同时也观察到腺癌的组织学特征，这表明是小细胞肺癌与腺癌复合的情况。该样本ARAF扩增呈阴性；然而，在使用依托泊苷和顺铂以及随后的厄洛替尼治疗后的病情进展时，活检肿瘤发现存在ARAF扩增。
虽然目前尚无可用的大型数据集来确定经EGFR - TKI治疗后发生SCLC转化的肿瘤中ARAF扩增的发生率，但在一个包含293个SCLC样本的大型临床测序队列中探究了ARAF扩增的发生率。结果发现，在9例伴有EGFR激活突变的SCLC病例中，有1例存在ARAF扩增；而在284例EGFR野生型SCLC病例中，仅有1例存在ARAF扩增（Fisher检验，p = 0.06）。
耐药肿瘤的SCLC亚型：
基于特定转录因子驱动的转录特征，SCLC可分为四种亚型：无毛鳞片同源物1（ASCL1）、神经源性分化因子1（NEUROD1）、细胞相关蛋白1（YAP1）和POU 2类同源盒3（POU2F3）。这些亚型被指定为SCLC-A（ASCL1显性）、SCLC-N（NEUROD1显性）、SCLC-P（POU2F3显性）和SCLC-Y（YAP1显性）。为了评估这些耐药肿瘤的亚型，研究者对EGFR - TKI治疗前后的配对样本进行了RNA测序分析。在每个亚型的代表性基因中，病例1中YAP下游的CCN1（CTGF）和CCN2（CYR61）上调（图2C）。基因集富集分析（GSEA）显示上皮 - 间充质转化（EMT）相关基因和YAP通路基因富集，提示为SCLC - Y亚型（图2D）。对奥希替尼耐药的肿瘤显示NEUROD1表达上调（图2C）。此外，在830个细胞类型特征基因集中，NEUROD1相关基因特征富集最为显著，提示为SCLC - N亚型（图2D）。与此一致的是，治疗后的样本分别变为YAP1和NeuroD1阳性（图2E）。
讨 论
在本队列研究中，5% - 8% 的对EGFR - TKI耐药的肿瘤中检测到了ARAF扩增。所有肿瘤都保留了最初的EGFR突变，且不存在如T790M和C797S这样的继发变异。ARAF扩增主要见于EGFR外显子19缺失的女性肿瘤患者，而T790M和C797S的出现与年龄、性别或原发突变状态等临床特征并无关联。这种女性患者居多的现象，可能与ARAF定位于Xp11.3有关。在出现ARAF扩增的癌症中，研究者发现了2例从腺癌组织学转化为SCLC的病例。
谱系可塑性，即细胞从一种既定发育轨迹转换至另一种轨迹的能力，被认为会导致肿瘤内异质性，并成为肿瘤适应靶向治疗压力的一种途径。在对第一代和第三代EGFR - TKI产生获得性耐药的EGFR突变型非小细胞肺癌患者中，4% - 15% 的患者会出现从腺癌到小细胞肺癌的组织学转化。与ARAF扩增且发生小细胞肺癌转化的病例一致，小细胞肺癌转化主要发生在EGFR外显子19缺失的肿瘤中，且转化后的肿瘤保留初始突变。
SCLC转化的确切机制尚未完全阐明。尽管源自不同上皮组织的神经内分泌肿瘤似乎需要对转录和表观遗传程序进行调控，但MAPK信号通路会降低神经内分泌细胞特征所需转录因子的表达。因此，EGFR - TKI对MAPK信号通路的抑制可能会促进EGFR突变肺癌细胞的谱系转换。虽然激活的MAPK信号通路会抑制神经内分泌谱系分化，但MYC或BCL2的同时过表达会加速神经内分泌肿瘤的形成。MYC是MAPK的一个已知下游靶点，同时MAPK信号通路还通过使促凋亡的BIM失活和稳定抗凋亡的MCL1来调节BCL2家族蛋白。之前已证明，EGFR - TKI治疗中产生的药物耐受持久性细胞会增加mTORC1介导的MCL - 1的mRNA翻译。这些表明，持续的MAPK激活对于维持细胞活力也是必要的。值得注意的是，ARAF的激酶活性明显低于BRAF和CRAF，但其过表达会延长MAPK激活的持续时间，这有可能在EGFR - TKI存在的情况下，营造有利于肿瘤细胞存活和神经内分泌标志物转录的条件。
由于经EGFR - TKI治疗后发生SCLC转化的情况较为罕见，本研究受限于患者数量较少。另一个不足是，由于缺乏经过验证的抗体，研究者无法确定ARAF蛋白的表达位置。最后，本系列研究的回顾性特质，需要更大规模的队列研究来加以证实。尽管存在这些局限性，但探究ARAF扩增在经EGFR - TKI治疗的癌症发生SCLC转化的发病机制中的作用，仍是有必要的。
在本研究中，研究者在EGFR - TKI耐药的肿瘤中发现了ARAF扩增现象。这些存在ARAF扩增的耐药肿瘤保留了最初的EGFR起始突变，且无继发性变异。此外，ARAF扩增主要见于存在EGFR外显子19缺失的女性患者。值得注意的是，研究者还发现2例病例显示出从肺腺癌向SCLC的组织学转化。ARAF扩增可能营造了在EGFR - TKI作用下促进肿瘤细胞存活和神经内分泌标志物转录的条件，这在存在EGFR外显子19缺失的女性患者中尤为明显。
参考文献：
Kimura, R.; Adachi, Y.; Hirade, K.; Kisoda, S.; Yanase, S.; Shibata, N.; Ishii, M.; Fujiwara, Y.; Yamaguchi, R.; Fujita, Y.; et al. ARAF Amplification in Small-Cell Lung Cancer-Transformed Tumors Following Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor–Tyrosine Kinase Inhibitors. Cancers 2024, 16, 3501. https://doi.org/10.3390/cancers16203501
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