在疑似原发性或转移性中枢神经系统（CNS）恶性肿瘤患者中，脑脊液（CSF）细胞病理学分析局限于检测肿瘤。本研究探索了使用 CSF 液体活检（LBx）检测 CNS 的肿瘤过程。使用 302 基因panel对疑似转移性（N = 106）或原发性 CNS（N = 23）肿瘤患者的CSF游离 DNA（cfDNA）进行深度测序。4 份样本（3%）（3 份转移性和 1 份原发性）未通过测序质控标准。在103例疑似转移性肿瘤患者中，84例（82%）证实转移性肿瘤。在22例疑似CNS肿瘤患者中，11例（50%）证实原发性CNS肿瘤。55 份样本（54%）检测到染色体异常。23 例（22%）转移性肿瘤患者和 1 例（5%）原发性 CNS 肿瘤患者检测到胚系突变。在 29 例转移性乳腺癌患者中，2 例（7%）有 ESR1 突变，9 例（31%）有 PIK3CA 突变。在 21 例转移性肺癌患者中，9 例（43%）有 EGFR 突变，5 例（24%）有 KRAS 突变。在 14 例患者中比较了 CSF LBx 与外周血 LBx，13 例（93%）仅显示 CHIP，1 例患者显示 CNS 原发性肿瘤突变。14 例患者的连续样本表明，CSF LBx 可用于监测治疗效果。本研究表明，CSF LBx 在临床上是可靠的，在很大一部分转移性 CNS 肿瘤患者中提供了有价值的结果，在原发性 CNS 肿瘤患者中，在较小程度上也是如此。
研究背景
疑似原发性或转移性中枢神经系统（CNS）恶性肿瘤患者经常分析脑脊液（CSF）评估是否存在肿瘤。常规方法的细胞学检查往往是不充分的，因为CSF样本中肿瘤细胞较少。从 CSF 样本中获得的细胞数量有限，这也限制了进行额外检测评估免疫表型、染色体异常和基因变异的能力。对于评估血液系统恶性肿瘤累及 CNS 的情况，染色体流式细胞术和细胞遗传学数据对于诊断和确定治疗至关重要。对于原发性和转移性实体瘤，基因组异常的分子评估对于靶向治疗和评估耐药机制也很重要。然而，在大多数累及 CNS 的癌症类型中，尤其是实体瘤，在 CSF 中很少能够找到足够的循环肿瘤细胞。此外，即使通过显微镜检查识别了肿瘤细胞，通常数量也过少，难以进行辅助检查来识别特定的生物学特征，确定精准治疗方法。
与正常细胞相比，肿瘤细胞更新换代的速度更快，脱落 DNA 和 RNA 的速度更快。由于这些特性，在一些器官中，外周血游离 DNA（cfDNA）和 RNA（cfRNA）已被广泛用于评估转移性和局限性肿瘤。然而，由于血脑屏障，在外周血中很少检测到来自 CNS 肿瘤的 cfDNA。检测 CSF 中的 cfDNA 或 cfRNA 或许能为检测 CNS 内的肿瘤过程提供一种更可靠的方法。
为此，我们从疑似原发性或转移性肿瘤累及 CNS 的患者中收集 CSF，分析 cfDNA 和 cfRNA。
研究结果
在研究期间，检测了来自疑似转移性（#105）或原发性（#23）CNS 肿瘤患者的 129 份 CSF 样本。中位患者年龄为 58 岁（范围：19 至 86）。在这 129 份 CSF 样本中，4 份因 cfDNA 测序数据不符合质量标准而被排除：3 份来自疑似转移性 CNS 肿瘤患者，1 份来自疑似原发性 CNS 肿瘤患者。除了一份样本来自一例被诊断为乳腺癌的患者外，其余所有检测样本在常规细胞学检测中均未显示诊断结果。在 14 例患者中，还收集了外周血（PB），并使用相同的技术和相同的方法检测 cfDNA 和 cfRNA。此外，14 例患者收集和检测了两份或以上连续样本。在 92% 的样本中，cfRNA 数据没有达到我们的质控（达到 8000 万reads和大于 20% 的剪接read）。
转移性肿瘤的阳性率高于原发性CNS肿瘤
在来自疑似转移性肿瘤患者的 103 份 CSF 样本中，84 份（82%）显示常见于实体瘤或淋巴瘤的突变或染色体异常，证实了 CNS 转移的诊断（表 1）。在诊断为乳腺癌（91%）、肺癌（95%）或淋巴瘤（71%）的患者的CSF样本中，很多检测到此类异常。相比之下，仅在 11 例（50%）（P 值 = 0.004，Kruskal-Wallis 检验）疑似原发性 CNS 肿瘤患者样本中识别原发性 CNS 肿瘤（表 1）。与侵袭性较低的肿瘤相比，胶质母细胞瘤显示出更高的阳性率（表 1）。在 CSF 中识别实体瘤的存在并不能区分软脑膜疾病和脑实质肿瘤。
表1
CSF检测到染色体异常
在转移性肿瘤患者的 103 份样本中，55 份（54%）检测到染色体结构异常，而在 23 份原发性 CNS 肿瘤患者样本中，只有 4 份（18%）检测到（表2；图 1、图 2）。只有 1 例转移性肿瘤显示染色体异常，无体细胞突变。该病例显示 5q 增加，涉及 PDGRB，16q 缺失，可能是由于 PDGFRB 扩增以及可能的 16q 纯合缺失。一些检测到的异常与治疗非常相关。20 份样本显示一个或多个治疗相关基因扩增，包括 PDGFRB、ERBB2、CCND1、MDM2、FGFR1、MYC、KRAS 等（表 2；图 1）。如表 3 所示，比较同一时间收集的 CNS 与外周血样本发现，所有外周血样本均未检测到染色体异常。
表2（左右滑动查看更多）
图1
图2
表3
染色体异常的存在与否与诊断和预后相关。例如，表 4 显示了具有单个异常（12 三体）的淋巴瘤患者（患者 #2）达到缓解并在 406 天后保持缓解，而具有多个染色体异常（复杂异常）的患者 8 在 285 天内复发。
表4（左右滑动查看更多）
CSF突变谱
检测到的突变因肿瘤类型而异。然而，21/125 份样本（17%）显示 ASXL1、TET2 和 DNMT3A 突变，可能代表 CHIP（潜能未定的克隆性造血）。其中 2 例严格显示 CHIP，无其他异常，被认为转移性或原发性 CNS 肿瘤的分子证据为阴性。比较 PB 与 CSF，13/14 的比较样本显示 PB 突变水平低，主要为 CHIP 或胚系。1 例弥漫性中线胶质瘤患者 PB 和 CSF 均显示 H3-3A（H3K27M）突变。然而，CSF 的突变水平显著高于 PB（变异丰度 36% vs 0.001%）。更重要的是，所有 PB 样本均未显示染色体异常，而 8/14 的病例 CSF 显示显著的染色体异常。
在 125 例提供信息的病例中，24 例（19%）检测到高丰度（VAF）（40%–50%）突变，提示胚系突变。其中，2 例检测到 BRCA1 突变，3 例BRCA2，3 例PRKDC，5 例CHEK2，2 例FANCC，2 例PALB2，1 例ALK，1 例BARD1，1 例TP53，1 例PTEN，1 例MSH2，1 例MPL，1 例SRC。这些胚系突变大多涉及 DNA 修复，导致同源重组缺陷（HRD）。当分析样本的肿瘤分数显著较高时，区分胚系突变与体细胞突变可能很困难。然而，在大多数液体活检样本中，肿瘤分数非常低，胚系突变的 VAF只有当胚系突变和各种体细胞突变之间存在显著差异时才判定。
在 29 例阳性结果的乳腺癌转移性肿瘤中，2 例（7%）有 ESR1 突变，9 例（31%）有 PIK3CA 突变。在 21 例阳性肺癌病例中，9 例（43%）有 EGFR 突变，5 例（24%）有 KRAS 突变。
CSF液体活检的临床相关性
CSF 显示存在癌症相关分子异常可作为癌症累及 CNS 的确认性检测，这些发现也与治疗和监测相关。在 CSF 中可以检测到耐药相关突变以及新的可操作突变。表 4 展示了使用 CSF 液体活检进行患者监测的示例。前 4 例患者在治疗后从阳性转为阴性，而患者 8 表现出低水平突变，提示可能的淋巴瘤，但在随后的检测中转为明显的弥漫性大 B 细胞淋巴瘤。异常水平以每 1 mL CSF 的分子水平定量报告（数据未显示），该水平可以定量监测。虽然没有长时间的随访，但从有限的数据来看，转为阴性 CSF 可能与较好的结局相关。例如，表 4 中患者 #2 在 406 天后仍处于 CR 状态，提示较好的无进展生存期和可能的总生存期。
讨 论
CSF 提供了不同于外周血浆的特殊环境。CSF 包含的细胞、蛋白质和糖水平明显较低。此外，CSF 和外周血浆之间的蛋白质图谱以及对各类肿瘤或炎症过程的反应要素也存在差异。CSF 特异性富含 T 细胞。因此，CSF 通常不能为细胞存活和常规细胞学检查提供良好的环境，在存在 CNS 转移的情况下，CFS 细胞学评估经常不确定或阴性。CSF cfDNA 和 cfRNA 下一代测序可能是一个很好的替代方法。更重要的是，对分子异常的基因组分析可能提供关于靶向治疗或预测对特定治疗耐药性的信息。
本研究结果表明，CSF cfDNA 测序是评估转移性肿瘤累及 CNS 的可靠方法。然而，我们评估 cfRNA 的尝试表明，在大多数情况下，cfRNA 降解，无法可靠地用于分子评估或定量。与外周血不同，cfRNA 检出水平非常低，尽管 cfDNA 很容易检出且水平相对较高。对低水平 cfRNA 进行测序会导致高表达基因（通常为管家基因）的 RNA 水平偏倚，而参与肿瘤发生过程的重要基因未被检测到（零水平）。本研究表明，在转移性肿瘤患者中，使用 cfDNA 时，82% 的CSF样本显示临床有用的信息。所研究的转移性肿瘤包括实体瘤和淋巴瘤（表1）。乳腺癌最常见，其次是肺癌；在这些癌症中，液体活检识别肿瘤的比例分别为 91% 和 95%。高比例（68%）的淋巴瘤（DLBCL 和其他类型）的 CSF 液体活检也呈阳性。
更重要的是，液体活检结果通常在治疗选择方面具有临床相关性。例如，31% 的乳腺癌显示 PIK3CA 突变，提示可以被 PI3K 抑制剂靶向；9% 显示 ESR1 突变，提示氟维司群和 CDK4/6 靶向治疗可能有益。在肺癌病例中，43% 显示可以靶向的 EGFR 突变，24% 显示 KRAS 突变。这些发现支持携带EGFR和KRAS突变的肺癌更倾向于累及CNS。此外，CSF 液体活检可用于监测患者和评估治疗效果。表 4 的数据具有临床价值，可帮助医生制定个体化精准治疗。
我们的检测panel包括大多数已知与遗传性癌症相关的基因。如果它们不参与癌症，应通过检测皮肤活检或外周单核细胞样本来确认是否存在胚系突变，告知主治医师可能存在胚系突变非常重要。当变异丰度（VAF）在 40% 到 50% 之间时，预计为胚系突变，当 VAF 显著较低时，则怀疑为其他突变。有趣的是，在这一系列患者中，在 22% 的转移性肿瘤患者样本中检测到胚系突变，显著高于所有类型癌症的预期比例（6% 至 10%）。有研究表明，癌症易感基因胚系突变的患者可能有较高的 CNS 受累倾向，这可能反映了转移至 CNS 倾向更高的癌症类型。本研究中高比例的转移性肿瘤患者患有乳腺癌，胚系突变在乳腺癌的肿瘤发生中起重要作用，这也许是我们病例中胚系突变率高的原因。
CSF 还检测到显著的染色体增加和缺失，这不仅与临床诊断相关，还与治疗方法相关。超过一半（54%）的转移性肿瘤患者 CSF 检测到染色体增加或缺失。一份来自一例转移性乳腺癌患者的样本显示染色体改变，没有单个基因点突变。相比单基因突变，乳腺癌的肿瘤发生更可能由染色体结构异常驱动。识别此类异常对于诊断和治疗选择都很重要。例如，检测到 ERBB2、CCND1、MDM2 和 FGFR1 基因扩增与靶向这些基因的治疗选择有关。
尽管本研究样本量较小，但我们的数据表明，原发性 CNS 肿瘤可以使用 CSF 识别，尽管与转移性肿瘤相比，检出率要低得多（原发性 55% vs 转移性 82%）（表 1）。在涉及疑似原发性 CNS 肿瘤的 22 例提供信息的病例中，11 例显示肿瘤证据，4 例显示与分类和预后相关的染色体结构异常。只有一例样本提供信息的患者显示胚系突变，发生于CHEK2。
基于 CSF 分子发现做出治疗决策是新的临床实践，应谨慎实施。治疗决策应考虑整体临床表现和病史。在评估 CSF 分子发现时，应排除 CHIP。如表 3 所示，在 CSF 中通常也可以检测到一些 CHIP 突变，但当肿瘤累及 CNS 时，实体瘤异常通常占主导地位。将 CSF 结果与 PB 结果进行比较可能是一种很好的标准做法。此外，确保 CSF 结果与预期的原发肿瘤结果一致非常重要。
总之，在转移性肿瘤患者中，CSF 液体活检对于评估 CNS 受累是可靠的，在原发性脑肿瘤患者中，在较小程度上也是如此。我们的结论受到病例数量相对较少的限制，需要进一步的研究将 CSF 分子发现与结局相关联。
参考文献：
Ahmad Charifa, Sally Agersborg, Arash Mohtashamian, Andrew Ip, Andre Goy, Maher Albitar, Liquid biopsy for evaluating mutations and chromosomal aberrations in cerebrospinal fluid from patients with primary or metastatic CNS tumors, The Journal of Liquid Biopsy, Volume 6, 2024, 100281, ISSN 2950-1954, https://doi.org/10.1016/j.jlb.2024.100281.
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