物理化学学报|河北师范大学赵晋津研究论文：高效靶向示踪钙钛矿纳米系统光电增效抗肿瘤

第一作者：李坚，张毓，闫融融

通讯作者：赵晋津，卜晖，陈欣

通讯单位：河北师范大学，河北医科大学第二医院，邢台市人民医院

本研究利用壳聚糖（CS）修饰CsSn_0.5Pb_0.5Br₃钙钛矿纳米颗粒提高其亲水性，将靶向剂叶酸（FA）和化疗药物甲氨蝶呤（MTX）通过酰胺键与CS共轭，合成了具有水稳定的、生物成像及抗肿瘤的CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米光电增效载药体系，集成示踪诊断和肿瘤治疗功能。CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA解决了钙钛矿纳米颗粒的水稳定性问题，能够通过三种机制杀伤肿瘤细胞：（1）在可见光照射下，CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA生成大量电子，促进多种ROS的产生，包括超氧阴离子（O₂^·−）和羟基自由基（·OH）和单线态氧（¹O₂）。（2）利用光生空穴作为氧化剂消耗细胞内过表达的谷胱甘肽（GSH），从而促进肿瘤细胞凋亡。（3）在肿瘤细胞内的碱性环境中，钙钛矿纳米颗粒释放化疗药物甲氨蝶呤，抑制嘌呤合成，同时阻断GCH1/BH4/DHFR系统，增强脂质过氧化作用。因此，本研究提出的基于CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA光电增效集成治疗诊断平台通过荧光检测追踪肿瘤细胞、释放MTX进行化疗，并在可见光照射下生成ROS（图1），成功地诱导肿瘤细胞内的氧化还原失衡，增强脂质过氧化作用，最终导致肿瘤细胞碎片化凋亡。

图1  CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒抑制肿瘤细胞生长的机制，包括光催化治疗和化疗。肿瘤靶向CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在碱性环境下产生ROS并释放MTX，在可见光照射下精准杀死肿瘤细胞的示意图。

CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的晶体结构通过X射线衍射（XRD）进行表征（图2a）。由于Sn²⁺的半径（0.118 nm）小于Pb²⁺的半径（0.119 nm），在CsSn_0.5Pb_0.5Br₃晶体中，XRD图谱中位于15.0°、19.9°和30.2°的衍射峰分别对应于(101)、(121)和(202)晶面。此外，位于22.3°、32.5°、37.6°、40.7°和45.6°的衍射峰分别对应于(110)、(200)、(211)、(220)和(221)晶面，这表明成功制备了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃纳米颗粒。傅里叶变换红外光谱（FTIR，图2b）中，1530 cm⁻¹处出现的酰胺键（N―C＝O）峰表明MTX-CS-FA的成功合成，―CH₃官能团在2925 cm⁻¹处出现，以上特征性官能团证实了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃成功被MTX-CS-FA外壳包裹。透射电子显微镜显示所制备的CsSn_0.5Pb_0.5Br₃纳米颗粒具有规则且均匀的矩形形态，粒径范围为5–20 nm（图2c）。高分辨率透射电子显微镜分析显示出清晰的晶格条纹，平均晶面间距为0.60 nm（图2d）。快速傅里叶变换图像（FFT，图2d插图）和选区电子衍射图 （SAED，图2e）证实了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃的晶体结构。CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒粒径为20–40 nm，呈球形，表面均匀包覆有MTX-CS-FA壳层，形成核壳结构（图2f,g）。这些结果表明MTX-CS-FA有机壳层保护了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃纳米颗粒。X射线光电子能谱（XPS）表明，在模拟肿瘤环境（H₂O₂）中，CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA和CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA（H₂O₂）样品均观察到特征的N 1s峰（图2i），而在CsSn_0.5Pb_0.5Br₃样品中未观察到，这证实了在氧化性的H₂O₂肿瘤环境中，被MTX-CS-FA包覆的CsSn_0.5Pb_0.5Br₃的结构稳定，未被降解。此外，Pb 4f峰和Sn²⁺价态峰（图2j,k）显示了极小的变化，表明Sn取代Pb不会显著影响内在的钙钛矿结构。以上结果表明，成功合成了具有20–40 nm粒径，且结构高度稳定的CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒，以用于后续的体内抗肿瘤治疗。

图2  纳米颗粒的结构表征（a）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA（红色）、CsSn_0.5Pb_0.5Br₃（灰色）的XRD光谱。（b）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA（红色）、CsSn_0.5Pb_0.5Br₃（灰色）的红外光谱。CsSn_0.5Pb_0.5Br₃的（c）TEM、（d）HR-TEM、快速傅里叶变换图像（右上角所示）、（e）选取电子衍射图像。CsSn_0.5Pb_0.5Br₃的（f）TEM、（g）HR-TEM、快速傅里叶变换图像（右上角所示）、（h）选取电子衍射图像（SAED）。CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA（红色）、模拟在肿瘤环境的CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA（蓝色）、CsSn_0.5Pb_0.5Br₃（灰色）（i）N 1s、（j）Pb 4f、（k）Sn 3d轨道的XPS能谱。

采用光致发光光谱（PL）和开尔文探针力显微镜（KPFM）分析CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的光电性能。随着浸泡时间的延长（0到228 天），PL强度增加，PL峰值红移，表明CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在水中具有极佳的稳定性（图3a）。在405 nm光照射下，使用体内成像系统（IVIS）对浸泡228天后的CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在水溶液中的图像进行捕捉（图3b）。水浸纳米颗粒显示出较高的IVIS强度（亮红色），与PL结果一致，表明CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在水中的稳定性可达228 天。为了研究CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的光电催化性能，采用KPFM测量暗态和405 nm光照射下的表面电势（CPD，图3c–f）。在暗态下，三维拓扑图像中的原位平均CPD为0.28 V （图3c），在光照条件下光诱导的平均CPD增加了约0.16 eV（图3f）。CPD的光诱导增加表明光照下CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒发生了电子-空穴对的分离，证实了其具有良好的光电特性。

图3  光电表征（a）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA的PL光谱。（b）0天和228天CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA粉末分散在去离子水中的活体成像图（上图）和在可见光激发下的图像（下图）。（c）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA在暗态下的三维形貌图。（d）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA的形貌直方图分布。（e）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA在原位亮态下表面电势叠加的三维表面电势图（λ=405 nm，lx=491 W∙m⁻²）。（f）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA表面电势的振幅直方图分布及亮态和暗态的表面电势差值（λ=405 nm，lx=491 W∙m⁻²）。

CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在可见光激发下生成电子（e⁻）和空穴（h⁺）（图4a）。将Control、MTX（3.04 μg∙mL⁻¹）、CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@CS-FA（200 μg∙mL⁻¹）、CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA（200 μg∙mL⁻¹）分为4组，分别处理LLC细胞，进行GSH含量检测（图4b,c），结果表明CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒通过产生的空穴氧化GSH，发挥抗肿瘤作用。DHE共聚焦染色进行细胞内ROS检测（图4d,e），并采用电子自旋共振光谱法对主要ROS成分进行定量验证，得出产生的ROS包括O₂^·−、·OH和¹O₂三种形式（图4f–h）。应用酶联免疫吸附试验检测处理后LLC细胞四氢叶酸含量，与对照组和MTX组相比，CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒组的THFA浓度分别显著下降了81.41%和42.31%（图4i），揭示CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒显著增强了MTX化疗的抗肿瘤效果，导致肿瘤细胞的脂质过氧化和凋亡。

图4  CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA对LLC细胞的作用机制研究：（a）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA通过三条通路作用公式。（b）、（c）应用流式细胞术进行LLC细胞中GSH含量检测。（d、e）使用DHE作为ROS探针进行LLC细胞内ROS检测。（f–h）应用ROS捕获剂（TEMP或DMPPO）进行LLC细胞电子自旋共振（ESR）光谱检测。（i）应用酶联免疫吸附试验测量LLC细胞四氢叶酸含量。

为了验证CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA对LLC细胞的杀伤性及靶向性，进行细胞实验。CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒显著提高了LLC细胞死亡率，达到83% （P < 0.001，图5a,b）。CCK-8法检测确定200 μg∙mL⁻¹ CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒处理后的LLC细胞活性显著下降，仅为37% （图5c）。为了研究MTX在CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒中的负载情况，采用UV-Vis分光光度法，结果表明药物负载率为1.52% ± 0.03% （图5d），证实MTX成功加载到纳米颗粒中。体外释放实验中，在pH=8.4条件下，1.5小时后的累积MTX释放量为51.17%±3.84%（图5e），表明在肿瘤细胞典型的弱碱性环境中，MTX释放显著。为了评估FA对肿瘤细胞的靶向能力，使用共聚焦显微镜观察了LLC细胞和小鼠肌母细胞（C2C12）在与CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@CS-FA孵育6小时后的荧光强度。LLC细胞中的荧光强度是C2C12细胞的2.9倍（图5f），CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@CS-FA组的荧光强度是CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@CS组的2.8倍（图5f,g），证明了FA的肿瘤细胞靶向效应。在24小时孵育后，LLC细胞的溶酶体几乎没有荧光，表明溶酶体破裂。溶酶体破裂不仅促进了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒从溶酶体的释放，还促使MTX的释放，从而导致肿瘤细胞凋亡（图5f,g）。因此，浓度为200 μg∙mL⁻¹的CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA表现出强大的细胞毒性和精确的LLC细胞靶向效果。

图5  CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA体外的杀伤性及靶向性。（a），（b）活细胞/死细胞双染实验。（c）CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA对LLC的细胞活力测定。（d），（e）采用释放实验检测不同pH值下MTX的释放量。（f），（g）应用共聚焦观察不同细胞系（C2C12和LLC）中FA的靶向性。

将C57BL/6JNifdc小鼠进行皮下瘤接种，构建了小鼠肿瘤模型，当小鼠肿瘤增至50 mm³，对荷瘤小鼠进行每隔5天尾静脉注射一次CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米体系，总共注射三次，当皮下瘤长至第12天时安乐死处理（图6a）。使用小动物IVIS系统检测CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA在小鼠体内肿瘤的荧光强度。在注射前，皮下肿瘤区域几乎无荧光信号。注射24小时后，荧光强度较注射前增加了108%，充分证明了这些纳米颗粒的精确靶向性（图6b,c）。通过每两天测量荷瘤小鼠的肿瘤体积，重量和存活天数（图6d–f），评价抗肿瘤效果。第12天，对照组的小鼠平均肿瘤体积为1785.44 mm³，而注射CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的小鼠平均肿瘤体积仅为396.11 mm³，体积缩小了约4.51倍。同样，对照组的小鼠平均肿瘤重量为2.31 g，而注射CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的小鼠平均肿瘤重量仅为0.52 g，减轻了约4.44倍。这些结果证实了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒能够显著抑制LLC皮下肿瘤的生长。测量各组的小鼠体重结果发现各组小鼠体重没有显著变化，表明CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒具有较低的急性毒性（图6g）。为了验证CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的光催化治疗和化疗效果，进行了苏木精-伊红（H&E）染色和末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP末端标记（TUNEL）染色（图6h,i）。H&E染色图像显示，与对照组相比，CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒组的肿瘤细胞数量显著减少。此外，TUNEL染色结果表明，CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒组的凋亡细胞占总细胞的3.61%（P < 0.001，图6h）。综上所述，体内肿瘤结果证实，CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在可见光照射下表现出显著的光电催化增强效应，有助于实现对肿瘤生长的有效靶向抑制。

图6  CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA体内肿瘤治疗。（a）尾静脉三次注射CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA到C57BL/6JNifdc荷瘤小鼠体内治疗肿瘤。（b），（c）应用小动物活体成像仪观察CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA的靶向性。（d），（e），（f），（g）纳米体系治疗后小鼠LLC肿瘤体积，终末肿瘤重量和小鼠体重曲线。（h），（i）肿瘤组织的H&E和TUNEL染色。数据以平均值±标准差表示。

为了验证CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在小鼠体内的安全性和代谢分布，通过对小鼠主要器官进行组织学分析，评估了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒组的非炎症和非损伤特性（图7a）。在常规血液参数、肝肾功能或体重方面无显著差异（图7b），表明CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒具有良好的体内生物相容性。荷瘤小鼠的血清游离铅浓度明显低于疾病控制和预防中心采用的参考血铅水平（50 μg∙L⁻¹，图7c），证明了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的体内安全性。为了进一步评估CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒的安全性，使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测小鼠血清中的游离铅浓度（图7c）。结果表明，在第5天肿瘤负荷小鼠的血清游离铅浓度为7.60 µg∙L⁻¹，处于正常安全范围内。对照组的游离铅血清浓度为3.62 µg∙L⁻¹，两组之间无显著差异（P > 0.05）。这些浓度明显低于美国疾病控制与预防中心（CDC）规定的参考血铅水平（50 µg∙L⁻¹），表明CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在小鼠体内具有良好的生物安全性。随后，采用IVIS系统探测CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在肿瘤负荷小鼠组织和粪便中的荧光强度，进一步分析其体内代谢分布（图7d）。注射后24小时，肿瘤和肝脏的荧光强度分别为26.6×10⁶和413×10⁶，而48小时时肾脏的荧光强度为28.9×10⁶。值得注意的是，120小时后，粪便中的荧光强度达到了81.4×10⁶ （图7e），而其他器官的荧光信号则完全消失。这证明了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒能够选择性地靶向肿瘤细胞，在肝脏和肾脏代谢后最终通过粪便排出小鼠体外。以上这些结果表明，CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA纳米颗粒在小鼠体内具有良好的生物安全性，并且以荧光钙钛矿的形式从小鼠体内排出，MTX-CS-FA外壳有效地阻止了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃在水中的降解，并防止了金属离子向血液中的释放。因此，证明了CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA在小鼠体内具有良好的生物安全性。

图7  CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA体内安全性和代谢分布。（a）通过尾静脉注射CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA的健康C57BL/6JNifdc小鼠各器官的H&E染色。（b）通过尾静脉注射CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA的健康小鼠血常规，肝肾功及小鼠体重的曲线。（c）通过尾静脉注射CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA的荷瘤小鼠血铅曲线。（d），（e）应用小动物活体成像仪观察CsSn_0.5Pb_0.5Br₃@MTX-CS-FA在荷瘤小鼠体内成像。数据以平均值±标准差表示。

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赵晋津