《ACS Catalysis》通过基于计算的跨区域组合诱变提高念珠菌酮还原酶的热稳定性
文摘
科学
2024-07-10 10:43
江苏
2023年5月，来自华东理工大学的Jiang Pan等人在ACS Catalysis上发表了一篇题为Enhanced Thermostability of Candida Ketoreductase by Computation-Based Cross-Regional Combinatorial Mutagenesis的研究性论文。
![]()
通讯作者：Jiang Pan ; Jian-He Xu通讯单位：State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, People’s Republic of China
Abstract
以环为代表的柔性区域一直是蛋白质稳定性工程研究的热点。然而，位于特定刚性区域的残基对蛋白质的稳定性也至关重要。这两个区域突变之间的动态相关性在蛋白质稳定中的作用仍然没有得到充分的了解。本研究通过对近平滑念珠菌中酮还原酶CpKR的柔性和刚性区域的重新设计，对其进行了合理的改造，以提高其稳定性。在B因子或均方根波动值较低的刚性区域，以及蛋白质相对灵活的区域，先后确定并验证了热点。基于非加性和合作突变效应，在这两个不同区域有有益突变的组合变异(M2)在40°C时的半衰期比野生型提高4630倍，表观熔化温度提高12°C。变异M2还表现出更好的pH相容性，更好的有机物质耐受性，以及增强的不对称还原2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-氧丙酸甲酯(1a)的性能，后者是心血管药物地尔硫卓的前体。晶体结构和分子动力学模拟表明，刚性和柔性区域的额外相互作用网络调节了蛋白质的稳定性，并且这两个区域之间的动态关联介导了所观察到的协同组合。这些结果表明，柔性区和刚性区，特别是交叉相关区，对提高蛋白质的稳定性至关重要，全面重新设计这两个区域是获得稳定酶的有力和有吸引力的方法。![]()
在过去的几十年里，生物催化剂被广泛应用于各种研究和工业部门，用于催化合成药物和生物活性分子。工业生物催化剂需要耐受恶劣的反应条件，如高温和高底物/产物浓度优异的稳稳性是酶所必需的，这不仅包括高热稳定性，而且还包括对有机物质(如溶剂、底物和产物)、剧烈的pH变化(特别是在需要酸/碱中和的情况下)、甚至高剪切应力(这在大型搅拌槽反应器中变得越来越重要)的特殊抗性。此外，考虑到通过一系列突变产生的酶的新功能经常遇到更不稳定的结构，健壮的酶也是非常可取的，因为它们的可进化性可以适应更广泛的不稳定突变。因此，提高酶的稳定性对于工业应用和基础研究都是极其重要的。蛋白质工程是一种强大的方法来剪裁蛋白质基序或区域，以提高酶的稳定性，特别是当涉及理性或半理性设计时。合理设计酶稳定性的主要策略之一是刚性柔性区域，通常以环为代表，因为它们的大热波动可以触发蛋白质的展开。可通过引入脯氨酸突变、添加盐桥、设计二硫桥、高B因子残基的迭代饱和诱变等多种策略来降低灵活性。使用B因子作为指示剂，可以快速识别柔性残基和区域。然而，隐藏在蛋白质刚性部分的一些敏感残基会逃避发现。刚性区域对于蛋白质的稳定性也是至关重要的，已经报道了许多策略涉及在刚性区域进行修饰以提高蛋白质的稳定性，包括去除或配对未配对的氢键供体/受体和带电基团，填充空腔，改善疏水堆积，扩大疏水簇，和解决空间应变。如果希望进一步提高蛋白质的稳定性，除了考虑柔性区域的热点外，还可能需要考虑刚性区域的敏感残基，因为多个突变可能具有协同效应。合理修饰蛋白质稳定性的另一种常用策略是应用计算蛋白质设计方法，包括FRESCO、PROSS和FireProt，这些方法主要是通过计算突变引起的吉布斯自由能变化(ΔΔGfold)来预测稳定效果。使用这些方法，大量独立的稳定突变被预测和验证，突变位点分散在整个蛋白质结构中，而不仅仅位于柔性区域。上述所有结果都表明，要获得健壮的酶(变体)，可能需要综合考虑柔性和刚性区域的方法。此外，探索这两个区域突变之间的动态相关性非常重要，因为它可能对这两个区域之间的突变组合的有效性产生重大影响本研究以近平滑念珠菌的一种天然酮还原酶为模型酶，通过共识设计和计算设计确定了39个位于刚性区和柔性区的热点。这两个区域的稳定突变组合产生了显著的协同效应，与野生型(WT)相比，得到的最佳变异体M2不仅在热稳定性方面，而且在pH耐受性和有机物抗性方面都有显著提高。蛋白质晶体学和分子动力学(MD)模拟提供了对多区域突变引起的相互作用变化以及柔性和刚性区域之间动态的见解。
在之前的研究中，CpKR在不对称还原2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-氧丙酸甲酯(1a)过程中表现出优异的立体选择性。然而，CpKR的稳定性较差(在30、35和40℃下的半衰期分别为390、10.2和1.2 min)阻碍了其工业应用前景。因此，提高CpKR的稳定性对其实际应用至关重要。共识序列设计是一种被广泛接受的提高生物催化剂热稳定性的方法，使用嗜热蛋白作为比对模型来搜索影响CpKR热稳定性的热点。使用易于使用的生物信息学工具EnzymeMiner平台检索与CpKR具有一定同一性的嗜热酶。利用CpKR序列作为查询，鉴定出Ser133、Tyr171和Lys175是催化和辅助因子结合的必需残基，从嗜热菌中获得了4个蛋白。然后选择这四个嗜热源蛋白进行多序列比对，并补充另外两个蛋白，SsCR (PDB ID: 5GMO)和CgKR (PDB ID: 5B6K)，因为它们与CpKR相比具有较高的辨识度(48%和46%)和更好的稳定性。基于同源序列中某一位置出现频率最高的氨基酸比同一位置出现频率最低的氨基酸对蛋白质稳定性的贡献更大的假设，根据多序列比对，用更保守的氨基酸替换目标残基，构建了31个突变体。基于共识序列的突变剩余活性和相对活性的测量变化如图1A所示。除V24L、V118I、L177F和T181A突变体外，大多数突变体的热稳定性下降，在35℃下孵育0.5 h后，剩余活性比野生型蛋白增加1.9倍以上。然后将这四个突变组合起来，形成一个由六个双点突变、四个三点突变和一个四点突变组成的突变文库。在组合突变体中，四点突变体CpKRV24L/V118I/L177F/T181A ( M1 )表现出最高的热稳定性，在40 ° C孵育4 h后保留近90 %的初始活性(图1B)。表征了这些稳定变体在40℃下的表观熔化温度(Tm app)和半衰期(t1/2)，进一步证实了热稳定性的改善。4个单点突变体(V24L、V118I、L177F和T181A)和4点突变体M1的Tm app和t1/2均有显著改善。突变体V24L、V118I、L177F和T181A在40°C下的半衰期分别为4.87、3.38、3.57和2.93 min，与WT相比提高了2- 4倍。此外，M1在40°C下的半衰期增加到1430 min，明显长于WT(仅为1.2 min)，说明4个单点突变体的结合产生了协同效应(表1)。Tm app值也有改善，与WT(41.7°C)相比，M1增加了9.3°C。![]()
图1.通过共识设计确定CpKR变异的筛选、组合和空间分布。显示了(A)大多数单一突变体和(B)所有组合突变体的催化活性和热稳定性。单点突变体在35°C下孵育0.5 h，组合突变体在40°C下孵育4 h，测定残余活性。未进行任何热处理的对应突变体作为对照。(C)通过共识设计在M1晶体结构中确定的点突变位置。稳定突变体的Cα原子显示为热粉色球体。浅橙色球体表示未观察到稳定。M1的三维结构通过b因子值表示。在b因子图中，原子完全缺失的残基用虚线表示。从蓝色到红色的颜色变化表明蛋白质从刚性结构到柔性结构的转变，其中最灵活的区域被突出并增厚。
表1.CpKR变异的特征
![]()
成功获得了含有NADPH的变体M1晶体(PDB ID: 7XWU)，这可能得益于M1稳定性的显著提高。晶体结构中的每个不对称单元包含两个蛋白质分子，M1-A和M1-B，这是其他晶体中普遍存在的现象。M1-A和M1-B的晶体结构都表现出短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族特有的罗斯曼折叠，其中平行的七股薄片被几个螺旋夹在一起，形成辅因子NADPH的结合域。M1-A和M1B的三级结构相似，总体均方根偏差仅为0.344 Å，但B因子差异显著。在M1-A中，高B因子区域位于环7和8，而在M1-B中，它们包围环4和螺旋α3的一部分(图1C)。我们追溯了之前通过共识分析分析的突变位点的空间分布。如图1C所示，M1A中三分之二的位点位于B因子值较低(低于B因子平均值)的刚性区域，包括突变位点24、118、177和181，这表明刚性区域的敏感位点对蛋白质稳定性具有重要作用。M1-B也有类似的情况。此外，具有高B因子值(高于平均B因子值)的柔性区域通常是蛋白质稳定性工程的目标，但在第一轮诱变中没有得到深入研究(图1C)。“锚定”现有的柔性区，不仅可以通过这些区域突变的潜在协同效应进一步增强CpKR的稳定性，而且可以探索柔性区和刚性区之间可能存在的动态耦合效应。因此，对柔性和刚性区域进行综合重新设计的概念自然产生。考虑到M1-A和M1-B中B因子的差异显著，分别从M1-A和M1-B中选取B因子值较高的20个残基作为热点，并考虑M1-A中另外12个缺失电子密度的残基，尽可能完善筛选文库。从这51个热点中将产生一个包含近1000个突变体的庞大饱和突变库，因此使用计算工具来搜索潜在的稳定突变。受到先前开创性工作的启发，采用了以下计算设计方法。基于M1的X射线结构，通过两种计算算法(FoldX和Rosetta Cartesian_ddg)进行潜在稳定点突变的蛋白设计。51个位点单点突变的ΔΔGfold值分别用所有蛋白原残基代替。共获得263个独特的预测突变作为潜在的稳定候选，其中98个被FoldX预测，198个被Rosetta Cartesian_ddg预测，有一些重叠(图2A)。这些潜在稳定候选者的生物物理缺陷，如在螺旋中引入脯氨酸、盐桥相互作用的丧失和酶表面疏水残基的暴露，被检查以提高文库的质量并减少筛选工作，提供了87个符合实验验证的潜在稳定突变。![]()
图2.位于具有高B因子值的柔性区域的氨基酸残基的虚拟突变和潜在热稳定性突变体的实验验证。(A)利用FoldX和Rosetta Cartesian_ddg对氨基酸残基进行虚拟突变。选择具有负ΔΔGfold值的稳定突变位点(用浅蓝色、蓝色和深蓝色填充色块)进行下一次筛选。(B)潜在耐热突变体的催化活性和残留活性。在45°C条件下培养20分钟后测定剩余活性。成功发现10个有益突变，它们集中在4个突变位点，即位置67(蓝色三角形)、290(橙色菱形)、294(紫色正方形)和303(绿色倒三角)。(C)组合突变体概要。在45°C下孵育80 min后测量剩余活性。选择黑线框标记的突变体作为进一步迭代突变的模板。
在实验测试的87个突变中，发现了10个显著稳定的点突变，在45°C孵卵20分钟后显示出≥50%的残留活性(图2B)。FoldX和Rosetta Cartesian_ddg分别提供了3个和9个有益突变，有一些重叠。这10个有益突变集中在4个突变位点，即位点67、290、294和303。其中，290位点被认为是最重要的，因为它的突变对酶的热稳定性有最大的积极影响(图2B)。考虑到残基290和294之间潜在的协同作用，涉及这两个关键残基的突变最初被合并到M1中。6个组合突变体均表现出比M1更高的稳定性，其中CpKRM1/N290E/E294S和CpKRM1/N290Q/E294L更为明显，其残留活性分别增加了2.8倍和3.0倍(图2C)。这两个6点突变体随后被用作引入更多突变的新模板，从而产生10个7点突变体。在这些突变体中，CpKRM1/N290E/E294S/S303A和CpKRM1/N290Q/E294L/S303A在保持相似的催化活性的同时表现出更高的残留活性，因此它们被用作在67位进行其他突变的基础。最后，得到的突变体CpKRM1/G67A/N290E/E294S/S303A(指定为M2)表现出最显著的热稳定性改善，在45°C孵育80分钟后，与变异M1相比，剩余活性提高了4.9倍(图2C)。在柔性区域引入4个稳定突变(G67A、N290E、E294S和S303A)，导致变异M2在Tm应用程序中比变异M1升高3°C(表1)。突变体M2在40℃下的半衰期延长至5550 min，是WT的4630倍。突变蛋白的最佳温度也发生了变化，WT为30℃，M1和M2分别为40℃和45℃。此外，为了研究柔性区突变对野生型的影响，构建了多点突变体CpKRG67A/N290E/E294S/S303A (M1-1)。惊讶的是，M1-1的Tm应用和半衰期分别比WT增加了2°C和7倍，这表明这些区域对野生型的热稳定性也是必不可少的。此外，柔性区域和刚性区域之间存在非凡的协同突变效应，特别是在40 ° C下的t1/2，证实了综合考虑这两个区域的合理设计方法是获得稳定酶的一种有前途和有吸引力的方法。为了更深入地了解提高蛋白质稳定性的分子机制，用NADPH (PDB ID: 7Y0K)以3.04-Å的分辨率解析了CpKR的晶体结构。以1.90 Å分辨率测定了NADPH变异M2 (PDB ID: 8H61)的晶体结构。以CpKR为模板，通过同源性建模得到突变体M1−1的结构模型。还对WT及其突变体进行了MD模拟，以研究蛋白质构象的动态变化。根据WT及其变异的平均均方根波动(RMSF)分析，WT与突变体相比，有四个区域的波动较大，分别是1区，代表Ile158 - Phe168残基，2区，代表Ala89 - Pro108残基，3区，代表Ile62 - Ala75残基，4区，代表Phe288 - Lys305残基(图3)。此外，基于共识设计产生的大多数突变位于RMSF值较低的刚性区域(低于时间平均RMSF值)，包括4个有益突变位点24、118、177和181。同样，确定用于虚拟筛选的灵活区域热点主要位于RMSF值高于平均水平的灵活区域。这与对M1的b因子分析得出的结论是一致的。突变位点67、290、294和303位于WT和M1的RMSF波动较大的3区或4区，表明这些位置的修饰确实增强了突变体M1−1和M2的整体鲁棒性，导致观察到的热稳定性增加。![]()
图3.MD模拟显示了WT及其突变体的RMSF结果。(A) RMSF平均差异较大的区域和相应的突变位点分别用虚线框和五角形标记。(B) M2三维结构中1 ~ 4区对应的位置。刚性区突变引起RMSF显著变化的区域用黄色表示，柔性区突变引起RMSF显著变化的区域用蓝色表示。稳定突变体的c - α原子显示为热粉色球体。
对比WT、M1和M2的晶体结构，也发现1区和2区发生了明显变化(图4)。晶体结构表明，T181A的取代增强了位于α3和α4螺旋内的残基(Ile108、Ile112、Lys176、Ala178和Lys180)的疏水相互作用。此外，在M1和M2中，Phe177和Tyr160之间形成了很强的π−π堆叠相互作用，从而稳定了含有Tyr160的310螺旋(图4)。177位置芳基侧链的较强空间屏障也维持了Tyr160在M1和M2中的稳定状态，而Tyr160在WT或M1-1中的构象在MD轨迹中发生了巨大的变化。因此，在M1和M2中只观察到Tyr160在1区的羟基和Glu100在2区的羧基之间存在一个新的、稳定的氢键(图4A−C)。M1和M2的MD轨迹中该氢键的占有率也分别为50.0 ± 3.5和57.9 ± 9.7 %，而WT为0 %。这个复杂而稳定的网络是通过Glu100，Tyr160和Phe177之间的相互作用而建立的，这使得整体蛋白结构的稳定性增加。![]()
图4.(A) WT， (B) M1， (C) M2晶体结构中1区和2区相互作用分析。突变的残基显示为粉色棒状。参与疏水相互作用或氢键的残基分别以青色和灰色棒状表示。黄色虚线表示氢键。绿色虚线表示π−π堆叠相互作用。1区和2区用玫瑰红标记。
柔性区的合理修饰导致的蛋白质构象变化主要集中在3区和4区。熵稳定可能是G67A突变导致3区稳定的原因。甘氨酸是唯一缺乏β-碳的氨基酸，并且N−Cα的旋转很少受到限制，这有助于很大程度的构象自由度和构象刚性的降低。与甘氨酸相比，丙氨酸具有较高的空间位阻和较低的构象熵，限制了可能的主链构象，使折叠后的蛋白质稳定。与其他区域相比，第4区有3个突变(N290E, E294S, S303A)，这表明该区域的残基相互作用可能非常多变。主成分分析(PCA)分析了该区域的主要运动模式Zone 4的构象聚类分析显示，该区域的运动在突变体M1-1和M2中更为集中，而在WT中则更为分散，分布在三个区域(图5A−C)。通过提取和比较典型构象，在M1-1和M2中都发现了Zone 4主链和侧链之间额外的氢键网络，这有助于该区域的“收紧”构象(图5D-F)。然后分析了MD轨迹中4区的内部氢键。WT最常见的氢键数为6个，而M1-1和M2最常见的氢键数为8个(图5G)。此外，我们还观察到N290E和E294S突变导致盐桥相互作用网络的重排和蛋白质表面不利的静电相互作用的调节，这两者都有助于提高蛋白质的稳定性(图5H)。![]()
图5.从WT到M2的4区构象动力学演化。(A) WT， (B) M1−1和(C) M2区域4的构象聚集。PC1和PC2分别表示主成分1和主成分2。黑盒子表示PC1和PC2高度聚集的区域，代表典型的构象。(D) WT， (E) M1−1和(F) M2的代表性构象。形成氢键的关键残基用棒状表示，氢键用黄色虚线表示。(G)第4区内部氢键分布。评价氢键的几何截止距离为3.5 Å，角度为30°。(H) MD系统第4区所涉盐桥的占用率。仅考虑占用率>20%的稳定盐桥。
另一个有趣的现象是，M1的第4区比WT表现出更多的盐桥和内部氢键，这表明刚性区域的修饰也影响了该酶柔性区域的残基相互作用。变体M2的4区显示出最复杂的氢键和盐桥网络，说明柔性区和刚性区之间存在一定的动态耦合效应(图5G,H)。计算WT和变异的动态相互关联矩阵(DCCMs)，以研究两两相互关联系数(Cij)，表明一个Cα原子的波动与另一个Cα原子相关(或反相关)的程度。34,35与WT相比，M1中残基80-125和140-190之间的相关性更强。突变位点177和181以及它们的关联区域1区和2区也参与了这种相关性。这与我们之前观察到的WT和M1相比，1区和2区之间的相互作用网络的变化一致(图4 )。此外，在WT及其变体中，残基140-190和270-310之间存在正或负的动态相关，涉及1区和4区。然后，这些区域之间的动态相关性通过特定的相互作用网络介导柔性和刚性区域突变体的协同组合，从而导致最佳变体M2的更高的表观熔化温度(Tm app)和半衰期(t1/2)(表1)。5.稳定的CpKR突变体具有更高的pH相容性，有机物质耐受性和反应性能为了进一步研究变体M2的稳健性，研究了pH和有机物质(共溶剂、底物1a和产物2a)对CpKR及其变体稳定性的影响。与CpKR相比，突变体M2对pH变化和有机共溶剂都表现出更强的抗性。此外，相对于WT, M2的蛋白表达也有所提高。值得注意的是，底物和产物对蛋白质都有一定的失活作用，但M2对底物和产物的耐受性都比WT好得多，尤其是对产物2a(图6A,B)。![]()
图6.(A)底物1a和(B)产物2a对酶失活的影响。酶在模拟反应体系中于30°C和200 rpm下孵育，其中含有100 mM底物1a或100 mM产物2a(用5% v/v二甲亚砜溶解)，0.8 U/mL冻干CpKR或M2无细胞提取物，40 mg/mL冻干甲酸脱氢酶(FDH)粉(2.5等量活性)，0.2 mM NADP+和1ml磷酸钾缓冲液(100 mM, pH 6.0)。间歇提取样品，并根据标准测定系统测定残留活性。(C) WT和M2在100 mM下对1a进行5 mL规模生物转化的时间过程。反应条件:底物1a (100 mM)，甲酸钠(1.5等量)，CpKR或M2冻干无细胞提取物(0.8 U/mL)，二甲基亚砜(5%，v/v)， FDH(2.5等量活性)和NADP+ (0.2 mM)冻干粉末，磷酸钾缓冲液(100 mM, pH 6.0)，总容积5 mL, 30℃。
鉴于蛋白质稳定性的显著提高，在不同的温度下也进行了不对称反应。12 h后，变体M2在25、30和35℃的温度下转化率超过94%，其中在30℃的温度下表现最佳，显示了该蛋白的广泛温度适应性。为了评估变体M2增强的稳健性，研究了变体M2和WT在100 mM 1a不对称还原中的反应性能。由于WT的不稳定性，2 h后WT的反应速率迅速下降，12 h内底物1a的转化率仅为45%，而M2的稳定性较好，12 h转化率>98%(图6C)。立体选择性没有改变，WT和M2的(3S)-2a摩尔比均>99%。正是增强的蛋白质热稳定性和其他性能的改善共同促成了变体M2优越的反应性能，其在工业应用中表现出显着放大的潜力。
在这项工作中，综合考虑柔性区和刚性区被证明有利于获得稳定的酶(变体)。通过计算设计、生物信息学和实验室筛选，在B因子或RMSF值较低的刚性区域以及相对灵活的区域相继发现了稳定突变。这两个区域的突变组合产生了显著的协同效应，导致最佳变异体M2具有更高的热稳定性、更好的耐有机物性和更好的pH相容性。这些增强的特性使得M2在合成心血管药物地尔硫卓的前体1a的不对称还原中表现出更高的性能。晶体结构和MD模拟表明，工程蛋白受到复杂的相互作用网络的调节，包括氢键、盐桥和疏水相互作用，最终导致稳定性的显著提高。刚性和柔性区域之间的蛋白质动力学介导了观察到的合作突变效应。虽然有各种方法可以在柔性区域设计弱稳定残基以获得稳定的蛋白质，但我们相信，刚性区域和柔性区域之间相互关联位点的综合发现将使研究人员能够有效地获得更稳定的酶，大大减少实验努力和成本。
原文：Enhanced Thermostability of Candida Ketoreductase by Computation-Based Cross-Regional Combinatorial MutagenesisDOI: https://doi.org/10.1021/acscatal.3c00503
