《Bioresource Technol》利用T.asperellum ND-1 GH10和11木聚糖酶将玉米芯变成高价值木寡糖

2024年2月来自Zhejiang Shuren University的Fengzhen Zheng等人在Bioresource Technology 发表了一篇题为Transformation of corncob into high-value xylooligosaccharides using glycoside hydrolase families 10 and 11 xylanases from Trichoderma asperellum ND-1 的研究性论文。

木聚糖是自然界第二大木质纤维素聚合物，是可再生和可持续有机原料的主要来源。这种丰富的多糖由β-1,4-连接的 D-木糖苷残基形成的骨架组成，可以通过酶解转化为高价值的生物商品或生物燃料。内切木聚糖酶是一种能裂解木聚糖主链的重要酶，在生产生物技术产品，特别是木寡糖（XOS）方面具有巨大潜力。

木寡糖由2-10个木糖单体组成，通过β-1,4连接，具有巨大的益生潜力，可为健康带来益处。XOS被认为是一种底物，可以有选择性地增加有益肠道微生物（如双歧杆菌和乳酸杆菌）的数量。此外，XOS（尤其是木二糖）是一种非消化性寡糖，具有多种生物功能，如降低结肠癌风险和促进钙吸收。生产XOS可采用酶法、化学法、物理法等多种方法。在酶水解法中，木聚糖酶降解法具有成本效益高、环境友好和可持续利用的特点，其生物技术利用潜力已受到全世界的关注。。

目前，大多数表征的β-木聚糖酶被分为糖苷水解酶（GH）10和11家族，它们表现出不同的催化活性。大多数β-木聚糖酶都是从真菌中分泌出来的，如Thermoascus aurantiacusM-2、Aspergillus sulphureus、Aureobasidium pullulans等。与T. reesei QM6a相比，生物质降解真菌T. asperellum ND-1基因组编码的木聚糖酶系统多样性更高。迄今为止，只从T. asperellum中发现了少数几种β-木聚糖酶，它们通常与β-木糖苷酶一起产生，这对XOS的质量不利。值得注意的是，要满足对高效工业酶（如β-木聚糖酶）日益增长的需求，就必须采用具有成本效益的生产工艺。由于Komagataella phaffii与细菌宿主相比具有多种优势，特别是其分泌途径可降低内源性蛋白质的产量，因此它在异源过表达蛋白质方面备受关注。因此，探索优良的木聚糖酶并开发用于生产 XOS 的高效表达途径具有重要意义。

新筛选出的生物质解构真菌 T. asperellum ND-1 能高效生产多种木聚糖降解酶，包括β-木聚糖酶和β-木糖苷酶。本文从该菌株中鉴定出了属于GH10（XynTR10）和GH11（XynTR11）的两种耐盐β-木聚糖酶，并通过密码子优化提高了它们在K. phaffii中的表达。研究了XynTR10和XynTR11对XOS的作用模式，并通过定向诱变探索了它们的关键催化位点。研究还进一步评估了XynTR10和XynTR11在利用玉米芯生产XOS中的潜在应用。

1.序列分析

在T. asperellum ND-1基因组中发现了两个木聚糖酶基因（Genbank：OP810495.1和OP810494.1，969和798 bp），其编码蛋白分别命名为XynTR10和XynTR11。经SignalP-5服务器鉴定，XynTR10含有322个氨基酸（AA）和18个残基的信号肽，而XynTR11含有265个氨基酸，没有信号肽。XynTR10和XynTR11的理论分子量分别为34.8和28.9 kDa。

XynTR10和XynTR11的序列比对表明，XynTR10与其他GH10木聚糖酶的序列同一性为54-61%，XynTR11与其他GH11木聚糖酶的序列同一性为35-62%。大多数GH10/GH11木聚糖酶都有两个保守的谷氨酸残基作为催化残基，分别起亲核和酸碱催化作用。XynTR10的Glu153和Glu258以及XynTR11的Glu161和Glu252是位于β片区域的保守氨基酸位点，表明这些氨基酸残基可能对酶的功能起着重要作用。

2.XynTR10和XynTR11在K. Phaffii中的异源表达

值得一提的是，目标基因的密码子优化是提高其在K. Phaffii中表达水平的有效策略。因此，根据K. phaffii的密码子使用偏向，对XynTR10和XynTR11的成熟核苷酸序列进行了优化。重组菌株XynTR10-wt、XynTR11-wt、XynTR10-opt和XynTR11-opt经PCR进一步鉴定。

XynTR10和XynTR11在K. phaffii中成功表达。如图1B和D所示，诱导6天后，XynTR10-opt和XynTR11-opt菌株的木聚糖酶活性在第5天达到最大值446.2±9.9和78.8±1.3 U/mL，分别是XynTR10-wt和XynTR11-wt的1.4倍和2.1倍。XynTR10和XynTR11的SDS-PAGE 结果分别显示出分子质量约为36 kDa和24 kDa的单一条带，与它们的理论值接近（图1C，E）。

图1.XynTR10 和 XynTR11 在 K. phaffii 中的高水平表达。(A）构建菌株 XynTR10-opt 和 XynTR11-opt 的示意图。（B, D）构建菌株 XynTR10-wt、XynTR10-opt、XynTR11-wt 和 XynTR11-opt 的木聚糖酶活性。(C、E）SDS-PAGE分析。泳道 M：标准蛋白质标记；泳道 1：XynTR10- wt和XynTR11-wt 的上清液；泳道 2：XynTR10-opt和XynTR11-opt 的上清液。

3.XynTR10和XynTR11的生化特性

以山毛榉木聚糖为底物，分析了pH值和温度对XynTR10和XynTR11的木聚糖酶活性的影响。在pH值为6时，XynTR10和XynTR11的酶活性最高；在pH值为8时，酶活性急剧下降，分别只保留了最大活性的48%和33%（图2A）。真菌木聚糖酶通常在中性或酸性条件下显示出最适pH值；例如来自 Chaetomium sp.（pH值为7.5）、Gloeophyllum trabeum（pH值为4.5）和Aureobasidium pullulans NRRL Y- 2311-1（pH值为4）的木聚糖酶。用不同pH值的缓冲液预处理1小时后，XynTR10在pH值为5、6和7时的原始活性分别保持了93%、89%和87%（图2B）。XynTR11在pH值为4-6时表现出较高的稳定性，其原始活性＞80%（图2B）。

XynTR10在65◦C时表现出最大活性（图2C）。然而，当温度＞65◦C时，活性急剧下降，在80◦C时仅保留了最大活性的18%（图2C）。XynTR11的最适温度为50◦C，在30-60 ◦C时活性保持率＞80%（图2C）。在稳定性方面，XynTR10和XynTR11在20至55◦C温度范围内均表现出其原始活性的＞80%（图2D）。值得注意的是，酶在更高温度下不稳定，XynTR10和XynTR11在80 oC 时的残余活性分别只有10.5%和1%（图2D）。

图2.温度和pH对XynTR10和XynTR11的影响。(A)最适pH。(B)pH稳定性。(C)最适温度。(D)温度稳定性。

使用各种化学物质作为底物研究了 XynTR10 和XynTR11 的底物特异性（表 1）。这两种酶只对山毛榉木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖具有活性，表明它们具有严格的底物特异性。XynTR10对山毛榉木聚糖的酶活性最高（446.2±9.9 U/mL），其次是小麦阿拉伯木聚糖（273.2±10.6 U/mL）（表1）。与XynTR10 相比，XynTR11对山毛榉木聚糖（78.8±1.3 U/mL）和小麦阿拉伯木聚糖（23.3 ± 3.7 U/mL）的酶活力要低得多（表 1）。这两种酶的特性与来自Thermobacillus composti, Chaetomium sp. CQ31和Streptomyces sp. B6相似.

表1.XynTR10和XynTR11对不同底物的催化作用

以山毛榉木聚糖为底物研究了XynTR10和XynTR11的动力学参数。XynTR10的Km值和Vmax值分别为11mg/mL和3225.8μmol/min/mg，XynTR11的Km值和Vmax值分别为2.8 mg/mL和721.5 μmol/min/mg。此外，与来自Aureobasidium pullulans（19.4 mg/mL）、Streptomyces sp. B6（16.1 mg/mL）和Sorangium cellulosum（25.8 mg/mL）的木聚糖酶相比，XynTR10和XynTR11较小的Km值表明它们具有更强或相当的底物亲和力。

4.化学试剂和金属离子对XynTR10和XynTR11活性的影响

研究了各种化学试剂和金属离子对XynTR10和XynTR11 β-木聚糖酶活性的影响。1 mM Mg2+、NH+、Ni2+、Li+、K+、Al3+、Ca2+、Co2+和Ba2+对XynTR10的活性有一定的促进（超过10%），但5 mM Cd2+（29.4%）、Al3+（47.6%）和Fe3+（48.3%）对XynTR10的活性有明显的抑制作用（表2）。此外，1 mM和5 mM Mn2+、Cu2+和SDS的存在会显著降低XynTR10的活性（表2）。据报道，Cd2+和Fe3+对木聚糖酶活性有抑制作用，而Ca2+能促进酶活性。

表2.金属离子和化学试剂对XynTR10活性的影响

表3.金属离子和化学试剂对XynTR11活性的影响

图3.5 U/mL XynTR10（A，C-F）和XynTR11（B，G-J）降解10 mg/mL山毛榉木聚糖和5 mg/mL XOS的TLC分析。XynTR11降解50 mg/mL木四糖（K）和木三糖（L）的时间过程。以木戊糖（X5）、木四糖（X4）、木三糖（X3）、木二糖（X2）和木糖（X1）的混合物为标准。

图4.鉴定XynTR10 和 XynTR11 的催化位点。用SWISS-Model模拟的XynTR10（A）和XynTR11（B）的三维结构。推测的催化残基已标注。(C、D）XynTR10/XynTR11 及其突变体的 SDS-PAGE 分析。(E，F）XynTR10/XynTR11 及其突变体的酶活性。

图5.XynTR10 和 XynTR11 的分子对接研究。分别为XynTR10 和 XynTR11 的模拟分子表面（A，E）、带状图（B，F）和活性残基立体图（C，G）。(D、H）催化中心的酶结构，显示催化残基之间的距离。

图6.XynTR10 和 XynTR11 从碱预处理玉米芯中生产XOS 的时间过程曲线。 (A) XOS和木糖产量的HPLC分析。(B）木戊糖、木四糖、木三糖和木二糖的分布。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.130249