2024年6月来自Max Planck Institute for Colloids and Interfaces的Conor J. Crawford等人在JACS发表了一篇题为Automated Synthesis of Algal Fucoidan Oligosaccharides的研究性论文。
Abstract
岩藻多糖是一种存在于海藻中的硫酸多糖，在海洋固碳中发挥着核心作用，并具有广泛的生物活性。然而，岩藻多糖的分子多样性和结构复杂性阻碍了对其精确的结构-功能研究。为了解决这个问题，作者提出了一种自动生成定义明确的线性和支链α-岩藻寡糖的方法。研究人员合成的寡糖包括多达20个顺式糖苷键、多种分支模式和11种硫酸单酯。在本研究中，通过（i）表征两种内切岩藻糖苷水解酶（GH107），（ii）利用它们作为核磁共振研究的标准来确认岩藻多糖的结构，以及（iii）开发岩藻多糖微阵列，证明了这些寡糖的实用性。通过该微阵列，可以筛选出四种针对岩藻多糖的单克隆抗体（mAb）的分子特异性。结果发现，mAb BAM4对β-葡聚糖具有交叉反应，而mAb BAM2则对具有4-O-硫酸酯的岩藻多糖有交叉反应。对 mAb BAM2 表位特异性的了解提供了证据，证明全球丰富的海洋硅藻Thalassiosira weissflogii合成了一种结构上与褐藻中同源的岩藻多糖。自动聚糖组装提供了获得岩藻寡糖的途径。这些寡糖为从分子水平研究岩藻多糖在医药和碳封存方面的作用奠定了基础。
01
简介
多糖是海洋碳循环的核心代谢燃料。大型藻类和硅藻会合成并向环境中分泌岩藻多糖。岩藻多糖的结构多样性给海洋细菌带来了挑战，它们需要进化出复杂的酶级联来降解岩藻多糖。逃过微生物降解的岩藻多糖可以自我组装成颗粒，沉入深海，并将碳储存数百年。此外，岩藻多糖还显示出一系列生物活性，目前正在药物开发和化妆品领域进行研究。目前的一个限制因素是，人们对岩藻多糖介导特定生物活性的确切分子决定因素，或岩藻多糖中是否存在最好的能介导碳固定的确切结构知之甚少。
为了揭示岩藻多糖固碳及其生物活性的分子机制，必须有明确的标准。由于多糖的非模板编码特性，从生物系统中提取的样品并不均匀。因此，化学合成是获得精确定义的有机物的独特方法。自动化流程将大大提高获得定义岩藻寡糖的可能性。
这些确定的标准将成为各种研究的基础，包括：创建微阵列、确定碳水化合物活性酶（CAZymes）的活性以及作为核磁共振实验的标准。复杂多糖的化学合成具有挑战性，不过，自动化方法的进步使寡糖和多糖的高通量组装成为可能。岩藻寡糖的自动化化学合成面临三个主要挑战：(i)1,2顺式糖苷键的立体控制形成，(ii)高度硫酸化，(iii)岩藻糖基供体的高反应性。
本文介绍了一种自动多糖组装（AGA）工艺，用于合成定义明确的岩藻多糖寡糖。这些可作为核磁共振光谱分析的标准，有助于确定CAZymes的活性，并有助于建立岩藻多糖微阵列。利用这个微阵列，研究人员阐明了岩藻多糖定向抗体的特异性，这反过来又表明在海洋硅藻中可以发现褐藻岩藻多糖基序。
02
结果
1.逆合成分析与构件设计
同型和异型岩藻糖代表了两类岩藻多糖。同型岩藻糖由α-（1→3）连接结构或交替的α-（1→3）-α-（1→4）连接的L-岩藻糖连接结构组成。另一方面，异型岩藻糖没有明确的糖骨架，可以由半乳糖、甘露糖或带有岩藻糖分支的葡萄糖醛酸组成。同型岩藻糖的结构多样性因硫酸酯、乙酰化和糖修饰（如半乳糖、葡萄糖醛酸或木糖）的存在而增加。尽管褐藻中同型岩藻糖的结构各不相同，但每种都包含不同的基序。例如，Laminaria hyperborea的岩藻多糖主要以α-（1→3）-连接为特征，还有少量的α-（1→2）和α-（1→4）-连接。Cladosiphon okamuranus具有高度的4-O-硫酸化（图1a）。
逆合成分析发现，硫代糖苷结构单元1-5适合用于组装不同的岩藻寡糖（图1b）。对L-岩藻糖构建块设计的一个限制因素是要求在2-羟基上有非参与性保护基团，以便在糖基化过程中具有α选择性。结构单元1的2-羟基上有一个非参与性苄基醚，3-O位上有一个临时的芴甲氧羰基（Fmoc），4-O-位上有一个苯甲酸酯保护。4-O苯甲酸酯可作为长程参与基（LRP），支持1,2-顺式糖苷的形成。此外，它还可以在树脂上裂解，以实现4-O硫酸化。构建模块2含有一个4-O乙酰丙酸酯（Lev），可形成1→4连接，并可用于精确的4-O硫酸化。构建模块3带有一个非参与性的2-萘甲基醚（Nap）保护基团，可选择性地去除该保护基团，以安装1→2连接或2-O-硫酸酯。构筑模块4在3-O 处使用了一个Nap醚，这样就可以在寡糖的其他部位操作与Lev和Fmoc相关的保护基团。随后可以移除萘酚醚，继续进行主链合成。最后，构件5可以合成半乳糖苷分支。
图1.岩藻多糖的结构多样性
2.改变硫酸糖苷离去基团可改善岩藻寡糖的自动化组装
最初，硫代乙基糖苷被用于α-(1→3)-同源岩藻糖的AGA，结果产生了大量的缺失序列和重复性问题（图1c和d）。通过试用不同的路易斯酸、改变温度和采用双偶联循环来提高糖基化的效率，但结果仍不一致。考虑到岩藻糖基供体通常具有高活性，而目前的自动合成器很难采用低于-40℃的偶联温度，研究人员测试了磷酸二丁基糖基供体，但并没有提高产量。
由于寡糖的目标结构复杂，包括分支和硫酸酯，因此通过改变保护基团来改变巯基糖苷的反应性是不切实际的。相反，通过改变巯基糖苷苷元的离去基团来调节糖基供体的反应性，可以将巯基糖苷的活化温度调整到+10℃。最初选择4-甲基噻吩酚硫代糖苷是由于其可用性和低成本，结果发现这提高了AGA过程中糖基化模块的质量和可重复性。在这些条件下，HPLC或MALDI-MS均未发现可检测到的缺失序列（图1d）。优化的糖基化模块涉及N-碘代丁二酰亚胺(NIS)和三氟甲酸(TfOH)，反应顺序为-20℃，15分钟，然后使用五当量的供体（CH2Cl2/二氧六环，2:1）在0℃下反应35分钟。随后的研究重点是评估糖基化、树脂上甲醇分解、光裂解、硫酸化和氢解的立体选择性。
3.岩藻寡糖和多糖的自动合成
以立体可控的方式化学合成1,2-顺式糖苷并不是一个已经解决的问题。然而，远程协助对于合成1,2-顺式糖苷和岩藻糖苷非常有用。利用优化的AGA条件，制备了一系列α-（1→3）连接的岩藻寡糖，包括五聚体7、六聚体10、八聚体8和20聚体12（图2）。
聚苯乙烯树脂或者使用5-氨基戊醇来释放带有末端胺的多糖，以便与微阵列表面偶联；或者使用"无痕迹"的光可裂解连接体，这种连接体允许合成用于酶测定的自由还原末端糖苷。每个偶联循环包括用三氟甲基磺酸三甲基硅酯（TMSOTf）进行酸性洗涤，然后用NIS-TfOH促进糖基化。随后，用醋酸酐（Ac2O）和甲磺酸（MsOH）溶液对树脂进行孵育，以"封顶"所有未反应的亲核试剂（图2a）。对于α-(1→3)-连接的岩藻糖，使用哌啶溶液（20%的二甲基甲酰胺）去除临时的Fmoc保护基团，使亲核体暴露出来，以进行后续的偶联循环。对7、10和8分别进行了五次、六次和八次偶联循环。
图2.两种主要类型的岩藻多糖主链的自动化多糖组装
在合成20链岩藻糖12时，首先组装10链，通过MALDI-MS和HPLC裂解和分析一小块树脂样品来监控合成过程（图3a）。随后，合成继续进行，最终得到目标的1,2-顺式连接的20链（图3b和c）。
图3.自动组装20链的α-岩藻多糖
岩藻多糖的第二个主链由α-岩藻糖基-(1→3)-α-岩藻糖基-(1→4)交替连接组成。这些寡糖的AGA依赖于构件1和构件2的反复使用，最终产生了四聚体15和六聚体16。在合成这些混合连接寡糖的过程中，Fmoc保护基去除模块是通过在二甲基甲酰胺中使用20%的三乙胺溶液来完成的。之所以选择这种方法，是因为LEV酯类药物对哌啶的处理很敏感。在轴向4-OH受体和硫代糖苷1之间观察到了顺畅的偶联，没有发现任何反应性问题（图4）。
图4.岩藻寡糖16的自动组装
4.硫酸岩藻寡糖的自动组装
岩藻多糖硫酸化的确切模式和程度取决于一系列因素，包括环境条件、生长阶段和提取方法。此外，对不同硫酸化模式如何影响岩藻多糖生物功能的了解仍然有限。这与糖胺聚糖（GAGs）形成了鲜明对比，在糖胺聚糖中，定义明确的寡糖发挥了关键作用，使人们能够从分子层面详细了解各个硫酸基团在调节生物活性方面发挥的作用。
迄今为止，通过AGA制备的硫酸寡糖包含多达四种硫酸酯。然而，要想高保真地解码聚糖与蛋白质之间的相互作用，硫酸化的四糖至十二糖是理想的选择。因此，研究人员最初的目标是合成含有五个硫酸酯的四糖13。AGA，然后进行甲醇分解，得到附着在固体载体上的四糖。已报道的两种树脂上硫酸化方法没有得到所需的五-O-硫酸化化合物（图5，表1）。造成这些结果的原因可能是轴向C4羟基与伯羟基相比亲核性较低，或者是在固体载体上靠近放置几个硫酸酯所涉及的立体要求。
图5.利用四糖13优化树脂上硫酸化反应
硫酸多糖（如GAGs）的溶液相合成可能需要较长的反应时间，这反过来又使得自动硫酸化过程并不总是切实可行（表1）。而最近发表的一种树脂方法是在塑料注射器中进行的，无法提供延长反应时间所需的精确大气和温度控制（表1）。事实证明，可密封的硅烷化微波瓶是在铝加热块中进行长时间硫酸化反应的理想选择（表1）。
在密封的微波瓶中，三氧化硫吡啶（Py-SO3）和三乙胺（NEt3-SO3）复合物的结果相当（表1）。用适当的碱对硫酸化溶液进行预缓冲，例如使用 Py-SO3 进行硫酸化反应时使用吡啶，有助于减少三氧化硫试剂质量的批次间差异（表1）。即使如此，有时仍需要硫酸化模块多次循环才能实现完全硫酸化，例如，六糖(10)和十糖(14)。
要监测固相硫酸化反应，必须进行微裂解，释放出微量的寡糖，以便进行HPLC和MS分析。在这里，研究人员采用二甲基甲酰胺（DMF）作为光裂解溶剂，因为它对聚苯乙烯树脂具有良好的溶胀性，并能溶解释放出的硫酸多糖。使用四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）和反相高效液相色谱（C5 Luna，5% ACN至100）分析，高效液相色谱分析仅对硫酸酯少于六个的寡糖有效。
利用这些条件，完成了从单糖到十糖的固相硫酸化，寡糖14含有11个硫酸酯（9-11、13、14和17）。1 H-13C HSQC NMR 分析证实了4-OH的硫酸化，与未硫酸化的岩藻寡糖相比，碳原子在68至79ppm之间发生了特征性的下移。
表1.树脂硫酸化优化研究
图6.光解固体载体中的多糖
图7.支链岩藻寡糖的AGA
图8.合成含有α-1，2键的岩藻寡糖20的中间体
图9.2-萘甲基醚裂解后四聚体中间体的MALDI-TOF
图10.含有α-1，2键的六糖岩藻寡糖20的NP-HPLC示踪
图11.岩藻六糖20甲醇解后的MALDI-TOF
图12.岩藻寡糖21的自动化组装
图13.岩藻寡糖22的自动化组装
图14.用于合成含有岩藻寡糖的α-1，4键的二醇中间体
图15.含α-1，4键的岩藻寡糖的自动组装
图16.作为合成岩藻多糖的海洋糖生物学工具分布
图17.岩藻多糖微阵列
图18.mAb BAM2的结合检测到Thalassiosira weissflogii合成岩藻多糖
03
结论
通过自动多糖组装，可以获得长度达20链的岩藻寡糖，这些寡糖具有不同的分支模式和多达11个硫酸酯。通过将硫代糖苷苷元的烷基改为反应性较低的芳基来调节构建模块的反应性，从而合成了寡糖。核磁共振实验证实，这些合成岩藻寡糖含有在褐藻中发现的结构特征。通过合成寡糖，还表征了海洋细菌中两种GH107内切岩藻多糖酶，这两种酶都能降解α-（1→3）连接的岩藻糖苷硫酸寡糖。利用岩藻多糖微阵列绘制了四种针对岩藻多糖的单克隆抗体（mAbs）的特异性图谱。研究发现，mAb BAM4对β-(1→3)-葡聚糖具有交叉反应性，包括有β-(1→6)-葡聚糖分支和无β-(1→6)-葡聚糖分支的β-(1→3)-葡聚糖。mAb BAM2与带有4-O-硫酸酯的α-(1→3)-和α-(1→3)-α-(1→4)-连接的岩藻寡糖结合。对mAb BAM2特异性的这一分子认识提供了证据，证明全球丰富的硅藻Thalassiosira weissflogii合成的岩藻多糖与褐藻中的岩藻多糖结构相似。合成岩藻寡糖是研究岩藻多糖在碳封存和医药方面作用的工具。
DOI: https://doi.org/10.1021/jacs.4c02348
END
前期回顾
