01
研究背景
肝细胞癌 (HCC) 是一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤。肝癌往往都经历了“肝脏癌变三部曲”即慢性肝病、肝硬化和肝癌三个阶段，在这三个阶段中，肝纤维化是一个重要的节点，是控制慢性肝病向肝硬化转变的最重要干预时期。因此，构建体外肝纤维化细胞模型是了解肝纤维化的病理发展和寻找潜在的治疗方式的重要手段，能够有效推动肝细胞纤维化机制和干预措施的研究。构建体外肝纤维化模型的关键在于如何快速准确地评估肝细胞纤维化的程度。传统的定量聚合酶链反应测定是评估纤维化的经典方法，然而，它具有时间长、成本高的局限性。因此，开发能够一种快速、精准、经济的新型检测方法用以评估肝细胞纤维化程度具有十分重要科学意义。
非侵入性和高灵敏度的表面增强拉曼光谱 (SERS) 是一项进行物质分析的有力工具，该技术可在细胞和分子水平上揭示生物标志物的指纹信息。通过开发具有优异信号稳定性和高活性的 SERS 底物、构建可靠的无标记 SERS 生物探针可以为疾病诊断提供重要信息。由于测试过程简单、性价比高，是生物医学检测的高效手段之一。然而，大量高维度的无标 SERS 光谱数据给人工分析带来了困难。随着人工智能技术在生物医学精准诊断领域的广泛应用，引入基于线性判别分析 (LDA) 算法的机器学习预测模型可以帮助降低 SERS 光谱的数据维度，并对多组数据进行精准的识别和分类。
02
研究内容
近日，中国科学院宁波材料所吴爱国研究员、林杰研究员，宁波诺丁汉大学任勇教授、宁波市第二医院付丽云主任医师等开发了一种基于 Cu2O@Ag 核壳结构的立方体 SERS 底物。它能够以高光谱稳定性检测多种痕量分子，如茜素红、罗丹明 6G 和亚甲基蓝。通过立方体 Cu2O@Ag 构建无标记 SERS 探针，对四种不同类型的肝细胞进行了拉曼检测。根据获取的数据建立了机器学习预测模型对4种肝细胞系 (THLE-2 正常肝细胞、HepG2 肝癌细胞、LX-2 肝星状细胞和肌成纤维细胞) 进行分类，准确率可达到91.38%。此外，预测模型在四种细胞样本的受试者工作特征曲线的 AUC 上均显示出大于95%的准确度。表明该方法对区分不同类型肝细胞具有良好的能力，具备辅助肝细胞纤维化体外建模的潜力。
图1 立方体 Cu2O@Ag 生物探针用于肝纤维化和肝细胞癌的无标记 SERS 分类
该项工作中，通过合成立方体氧化亚铜 Cu2O 模板和银纳米颗粒制备了 Cu2O@Ag 核壳结构 SERS 材料。透射电镜下进行能谱检测清晰可见银元素分布在铜元素的外层。将材料进行超声破碎处理后，对其边缘处晶格条纹间距进行计算确证了 Cu2O 和 Ag 复合材料的成功构建。
图2 Cu2O@Ag 的形貌表征
对 Cu2O@Ag 进行 SERS 性能检测可以看出，立方体 Cu2O@Ag 可以在低至 10-9 mol/L 的浓度下检测到罗丹明 6G (R6G) 分子，这说明立方体 Cu2O@Ag 具有良好的 SERS 灵敏度。在 R6G 信号分布的热图中可以清晰区分信号强(黄色)和弱(红色)区域。三个强度较高的拉曼峰显示出了较好的信号稳定性，相对标准偏差在 612 cm-1、773 cm-1 和 1507 cm-1 处分别为11.70%、 13.13%和17.07%。
图3 Cu2O@Ag-R6G 的 SERS 增强性能和光谱稳定性
通过活化肝星状细胞 LX-2 在体外构建成纤维性肌成纤维细胞 Myofibroblasts，以 LX-2 细胞、永生化的肝正常细胞 THLE-2 细胞和肝癌 HepG2 细胞作为对照，利用机器学习辅助 LDA 模型来区分四种类型的细胞，以探索立方体 Cu2O@Ag 作为 SERS 底物的无标记试验区分肝细胞的能力。将每个细胞系的无标记 SERS 数据输入分类程序中，按照训练集和测试集进行划分，得到了分类图和预测结果。从图中可以清楚地看出，四种细胞被有效识别并区分。训练集分类总体准确率为 91.38%。k-fold 交叉验证的应用防止了模型过拟合的发生。此外，根据预测概率给出测试集预测结果，概率范围从0到100%，圆角矩形通过颜色深浅的变化来表示概率的大小。从图中可以看出，THLE-2 细胞的11个预测结果和 LX-2 的14个预测结果是完全正确的。15个 HepG2 细胞的预测结果有一个错误。该模型预测肝细胞癌细胞为肌成纤维细胞，这可能是由于过度纤维化可能导致转化为肝细胞癌。结果表明，LDA 模型对肝成纤维细胞的有效分类具有良好的潜力。对正常肝细胞 THLE-2 和肝星状细胞 LX-2 的预测效果良好。肝癌细胞的预测也令人满意。为了进一步提高预测成功率，期望开发出具有更好 SERS 性能的无标记生物探针。
图4 LDA 模型对四种肝细胞进行分类和预测
03
总结展望
该项工作开发了一种立方体 Cu2O@Ag 核壳 SERS 生物探针，该复合衬底具有良好的 SERS 灵敏度和光谱稳定性。采用机器学习辅助的线性判别分析模型和无标记 SERS 检测对四种不同类型的肝细胞进行了鉴定和分类，准确率达91.38%。这项创新技术将进一步促进 HCC 和肝脏疾病的早期诊断，并有助于临床治疗的合理化。
04
论文信息
A cubic Cu2O@Ag bioprobe for label-free SERS classification of hepatic fibrosis and hepatocellular carcinoma
Yujiao Xie, Xue Li, Lei Xu, Chenguang Zhang, Yong Ren, Xiaofeng Shi, Liyun Fu, Jing Wang, Xiawei Xu, Yue Liu, Yue Hu, Zhouxu Zhang, Jiahao Zhang, Ting Yao, Wenzhi Ren, Tianxiang Chen, Xiaoyu Qian, Xiaotian Wang, Jie Lin and Aiguo Wu
Mater. Chem. Front., 2024, Advance Article
https://doi.org/10.1039/D4QM00532E
*文中图片皆来源上述文章
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